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Artículo de método

Quemaduras severas en un modelo porcino para la preparación clínica evaluación

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DOI:

10.3791/57942

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6 de noviembre de 2018

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1Graduate Institute of Medical Sciences, National Defense Medical Center, 2Department and Graduate Institute of Biology and Anatomy, National Defense Medical Center, 3Department of Gerontological Health Care, National Taipei University of Nursing and Health Sciences, 4Division of Rheumatology/Immunology/Allergy, Department of Internal Medicine, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center, 5Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Tri-Service General Hospital, 6Department of Nursing, Yuanpei University, 7Department of Physiology and Biophysics; Graduate Institute of Physiology, National Defense Medical Center, 8Division of Urology, Department of Surgery, Tri-Service General Hospital, National Defense Medical Center

En este artículo

Resumen

Mímico de cerca el modo de quemaduras requiere la interacción entre la observación clínica y estudios en modelos animales. En este estudio, un modelo porcino de quemaduras graves se estableció para evaluar una preparación experimental en ajustes fisiológicos y patofisiológicos.

Resumen

La cicatrización es un proceso dinámico de reparación y es el proceso biológico más complejo en la vida humana. En respuesta a lesiones por quemadura, alteraciones en las vías biológicas afectan la respuesta de la inflamación, resultando en retraso de la cicatrización de heridas. Alteración de la cicatrización ocurre con frecuencia en pacientes con diabetes lleva a resultados desfavorables como la amputación. Por lo tanto, se necesitan apósitos tener efecto beneficioso en la promoción de reparación de herida de quemadura. Sin embargo, estudios sobre tratamiento de herida de quemadura son limitados debido a la falta de modelos animales adecuados. Nuestro estudio anterior demostró cicatrización rendimiento en modelos de rata y cerdo usando una técnica quirúrgica mínimamente invasiva. Este estudio pretende demostrar un modelo porcino de herida por quemaduras severa que elimina la contracción de la herida y más cerca se aproxima a los procesos humanos de reepitelización y formación de tejido nuevo. Este Protocolo establece un procedimiento detallado para crear heridas de quemadura consistente y examinar el rendimiento de la cicatrización en el tratamiento de una preparación experimental en un modelo porcino. Seis heridas de quemadura se crearon simétricamente en el dorso, que fueron cubiertas con un apósito clínico compuesto de cuatro capas: una capa interna de contacto de materiales experimentales, una capa intermedia interior de película impermeable, una capa intermedia externa de gasa, y una capa externa de esparadrapo. Sobre la realización de experimentos, encierro de la herida, área de la herida y puntuación de la escala de cicatrices de Vancouver fueron examinados. Las muestras de piel resecada de cada animal sacrificio posterior histológico fueron preparadas y teñidos usando hematoxilina y eosina. Actividad antibacteriana de cada preparación en el contexto de la cicatrización también fue examinada. La aplicación de la preparación clínica para las heridas en modelo porcino imita los procesos biológicos de cicatrización humana con respecto a los procesos de epitelización, proliferación celular y angiogénesis. Por lo tanto, este modelo de cerdo proporciona un método fácil de aprender, rentable y sólido para evaluar el efecto clínico apósitos en herida por quemaduras severa.

Introducción

Una herida por quemaduras inicia el proceso inflamatorio e induce efectos patológicos complejos, que influyen en muchas funciones del cuerpo inmediatamente después de un accidente, dando por resultado un impacto negativo en la calidad de vida del paciente. Deteriora la cicatrización de heridas causa significativa morbilidad y mortalidad en los pacientes con diabetes mellitus1,2. Mayoría de los pacientes con heridas por quemaduras dolor durante el desbridamiento de la herida quemadura, que se conoce como un proceso atroz a pesar del uso de potentes analgésicos opiáceos3.

A diferencia de otros mamíferos, cerdos comparten varias características anatómicas y fisiológicas con los seres humanos sobre el proceso de epitelización, proliferación celular y angiogénesis. Esto hace porcina un modelo potencialmente mejor para ciertos procedimientos y estudios, y a menudo son utilizados en estudios posteriores que demostraron resultados prometedores en ratones. Estas características han llevado a la creciente utilización de cerdos como una especie principal en las pruebas preclínicas. Recientemente, se ha observado un rápido incremento en la investigación biomédica con respeto a cardiovascular, urinario, tegumentario y sistema digestivo4,5,6. Este estudio pretende demostrar un modelo porcino de herida por quemaduras severa que elimina la contracción de la herida y proporciona una mejor aproximación de los procesos de curación de herida humana y la formación de nuevos tejidos. Seis heridas de quemadura se crearon simétricamente en el dorso, tres a cada lado de la columna vertebral de los cerdos. A continuación, anexperimental aderezo fue examinado en un modelo porcino de herida por quemaduras severa, que puede ser adaptado para replicar la cicatrización de la herida humana (figura 1). Las heridas estaban cubiertas con un apósito clínico, que se compone de cuatro capas: una capa interna de contacto de materiales experimentales, una capa intermedia interior de película impermeable, una capa intermedia externa de Gasa y una capa externa de esparadrapo. Una película impermeable mantiene el ambiente de la herida húmedo mientras que la prevención de la infección bacteriana y permitiendo que los gases permear la preparación. La capa intermedia externa de Gasa fue aplicada en las películas impermeables y asegurada por una capa externa de esparadrapo. En la realización de experimentos, encierro de la herida, área de la herida y puntuación de la escala de cicatrices de Vancouver (VSS) fueron examinados. Las muestras de piel resecada de cada animal sacrificio posterior histológico fueron preparadas y teñidos usando hematoxilina y eosina (HE) la coloración. Actividad antibacteriana de cada preparación en el contexto de la cicatrización también fue examinado en este modelo. Nuestro estudio anterior ha demostrado rendimiento cicatrizante en ratas y cerdos modelo mediante una técnica quirúrgica mínimamente invasiva7. Puesto que había que seis queman en el dorso de cada cerdo, cada preparación experimental fue probado y evaluado en todas las posiciones para minimizar el sesgo relacionado con el proceso de curación de la herida en diferentes puntos en el dorso del cerdo. Por lo tanto, el modelo porcino de quemaduras graves establecidos en el presente estudio ofrece un nuevo enfoque para la evaluación de preparaciones clínicas y facilita el desarrollo de un novedoso tratamiento para quemaduras. Este estudio proporciona herramientas cruciales para descubrir la fisiopatología de la cicatrización de quemaduras.

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Protocolo

Procedimientos que involucran animales sujetos han sido aprobados por el Comité de cuidado del Animal en el centro de médico de defensa nacional, Taiwán (ROC). Este estudio se realizó en el centro de animales de laboratorio en el centro de médico de defensa nacional. Cerdos entre 20 y 25 kg de peso ha sido instrumentada con éxito usando este protocolo.

1. adaptación de los animales al manejo humano

  1. Después de su llegada a las instalaciones, los animales de la casa solitario pero que interactúan entre sí.
  2. Proporcionar a los animales acceso ad libitum al alimento y al agua.
  3. Aclimatar porcina a humano manejo y transporte de la instalación de animales al laboratorio experimental de manejo del animal por lo menos una vez al día durante una semana.
  4. Rápido el animal por lo menos 12 horas antes de la cirugía para prevenir náuseas, vómitos y aspiración del líquido estomacal.

2. sedación

  1. Antes de la creación de la herida quemadura, sedar a los animales a través de una inyección intravenosa con Zoletil 50 (25 mg/kg).

3. intubación y ventilación

  1. Colocar el animal sobre una mesa o carro en posición esternal.
  2. Abrir la boca del animal con un difusor oral.
  3. En caso de relajación insuficiente de los maxilares o presencia de reflejos de deglución, que dificultan la intubación, máscara porcina con isoflurano para inducir sedación.
  4. Monitorear la presión arterial, frecuencia cardíaca y temperatura corporal por el monitor de la señal fisiológica durante la cirugía para evitar posibles complicaciones.

4. anestesia

  1. Inducir y mantener la anestesia; preferentemente anestesiar al animal mediante una inyección intramuscular de tiletamina y zolazepam (25 mg / kg + 25 mg / kg).
  2. Intubar al animal con el tubo endotraqueal al reflejo de la relajación muscular, caracterizada por pérdida del tono de la mandíbula y palpebral, observó.
  3. Mantener todos los cerdos en un estado anestésico en un entorno de vaporizador de 0,5 – 2,5% (v/v) isoflurano hasta el final de la cirugía.
  4. Examinar la profundidad de la anestesia por la prueba de reflejos de dolor con una pizca de dedo de la pata trasera antes de la cirugía. Cuando es necesario, añadir anestesia adicional o esperar unos minutos. Ver reflejos de dolor regularmente durante la cirugía.

5. esterilización del campo quirúrgico

  1. Afeite y limpie la piel del animal en un área de aproximadamente 25 cm de ancho de la columna vertebral hasta la axila en ambos lados.
  2. Frote la piel hidratada con scrub povidona-yodo (75 mg/mL) durante aproximadamente 5 minutos.
  3. Quitar el jabón de povidona yodada de la piel con gasas estériles húmedas.
  4. Esteriliza la piel con povidona yodada loción (100 mg/mL).
  5. Cubrir el animal con cortinas quirúrgicos estériles para reducir la transferencia bacteriana y la subsecuente contaminación del sitio quirúrgico.

6. creación de herida de quemadura

  1. Utilice un marcador quirúrgico para marcar el centro de seis heridas de quemadura simétricamente en el dorso del cerdo. Asegúrese de que la distancia entre cada herida de quemadura por lo menos mayor que el radio de la herida (figura 1A).
  2. Llene un soldador modificado con 50 mL de glicerina e Inserte un termómetro para controlar la temperatura. El hierro caliente posee un área plana de aproximadamente 9 cm2 (figura 1B).
  3. Calentar la plancha a 137-139 ° C con una placa (figura 1).
  4. Crear seis heridas de quemadura uniforme colocando la plancha en el área marcada sin aplicar ninguna fuerza durante 30 segundos (figura 1).
  5. Lavar las heridas de la quemadura con solución salina al 0.9% (figura 1).
  6. Medir las dimensiones de la herida y microfotografía (Figura 1E) para registrar la herida.

7. preparación de las salsas

  1. Cubrir cada herida con la capa de contacto interna de una preparación clínica de cuatro capas a través de contacto directo. Para esta capa use aderezo que contiene tapas y materiales alternativos (Figura 1F).
  2. Aplique una capa impermeable en la preparación clínica para servir como una barrera contra la penetración bacteriana (Figura 1F).
  3. Cubrir cada herida con una gasa (0,5 cm de espesor) y fijar con cinta de papel para servir como capa intermedia de la preparación (figura 1).
  4. Fije la gasa con una capa externa de esparadrapo. Extender esta capa para el torso para evitar el desplazamiento de la preparación (figura 1 H-1J).

8. quemar la atención y medición

  1. Inyectar los cerdos con buprenorfina (0.1 mg/kg, IM) para el tratamiento del dolor para cada 8-12 h, a partir antes de recuperación de la anestesia, durante una semana reducir el posible dolor.
  2. Permiten el acceso libre de cerdo para la alimentación y de agua.
  3. Cambie los apósitos clínicos cada 2 días durante los primeros 10 días y luego dos veces a la semana para la 6 semanas de estudio.
  4. Limpiar y medir las heridas antes de volver a aplicar vendajes clínicos. Administrar los anestésicos durante los cambios de apósito.
  5. Para registrar la herida microfotografía para la comparación de la tasa de curación de herida cada 2 días durante los primeros 10 días y luego dos veces a la semana para la 6 semanas de estudio.
  6. Calcular la reepitelización de la herida o la contracción como el porcentaje del tamaño original de la herida según un método previamente descrito. Se realizó el análisis de encierro de la herida de forma doble ciego.
  7. Medir la cicatriz de la quemadura con VSS, que consta de cuatro variables: vascularización, altura (espesor), flexibilidad y la pigmentación poste-queme los días 0, 7, 21 y 42. Cada variable tiene cuatro a seis posibles resultados. Total puntaje oscila entre 0 y 14, por el que una puntuación de 0 refleja normal de la piel.

9. experimentos de crecimiento bacteriana de tejidos post-quemaduras

  1. Limpiar la herida para pruebas antibacterianas poste-queme los días 0, 7, 21 y 42.
  2. Colocar el hisopo en 100 mL de solución salina estéril al 0.9% y suavemente agitar para lograr una suspensión homogénea.
  3. En serie diluido (10−1– 10−5) el homogeneizado y placa 100 μL de cada dilución en medios selectivos y no selectivos, respectivamente.
  4. Incube todas las diluciones bajo condiciones aerobias a 37 ° C durante 24 – 72 horas.
  5. Placa por triplicado partes alícuotas de 10 μL de todas las diluciones en agar-sangre suplementado con sangre de carnero 5% a aislar organismos gram-positivos aerobios.
  6. Incubar la muestra por separarse o verter la muestra uniformemente en la superficie de una placa de agar durante la noche para determinar el número de colonias formando unidades (UFC).
  7. Leer las placas después de la incubación durante la noche. Invertir la placa de agar sangre de oveja y la parte inferior del plato se dividen en cuatro cuadrantes iguales, utilizando un marcador y una regla pequeña.
  8. Coloque la placa en el escenario de un microscopio de disección y contar las colonias en cada placa. Por definición, una colonia debe tener un mínimo de 300 UFC a enumerar.
  9. Contar las colonias bacterianas en cada una de las tres repeticiones. Calcular que el valor promedio de las tres repeticiones. Determinar la UFC por placa multiplicando el promedio del valor por el factor de dilución final.

10. la eutanasia y la fijación de tejido

  1. Inyectar por vía intravenosa una sobredosis de la solución de eutanasia pentobarbital sódico (80-120 mg/kg).
  2. Realizar en bloque la supresión de los tejidos de la herida quemadura incluyen la musculatura subyacente y unwounded tejido circundante.
  3. Fijar los tejidos con formalina tamponada neutra 10%.
    1. Mezclar 10 mL de formaldehído (37%) en 90 mL de solución amortiguada de fosfatos (PBS) y almacenar a 4 ° C.
    2. Transferencia de tejidos para fijador y agitar el envase para asegurar que todos los tejidos son completamente inmerso en el fijador. El volumen de fijador debe ser 30 veces el volumen de tejido.
    3. Fijar los tejidos durante la noche a 4 ° c.
  4. Deshidratar los tejidos con etanol y embed en bloques de parafina. Realice los pasos siguientes a 4 ° c en un agitador.
    1. Lavar dos veces con PBS durante 30 minutos.
    2. Deshidratar los tejidos con etanol al 70% de 8 horas, durante la noche el etanol del 80%, etanol al 95% durante 8 horas y luego en etanol al 100% durante la noche.
    3. Incubar los tejidos en 100% de etanol durante otras 8 horas.
    4. Incubar los tejidos en tres cambios de xileno cada 30 minutos.
    5. Sustituya el xileno con cera recién fundido (52 ° C) e incube a 52 ° C en un horno durante 1 hora.
    6. Reemplazar la cera con la cera fresca incubar a 52 ° C en un horno durante 3 horas y una vez más reemplazar e incubar a 52 ° C durante la noche.
    7. Incubar los tejidos con los dos cambios más de cera cada 1 hora y luego incrustar el tejido y almacenar a 4 ° C.
  5. Corte las secciones parafina-encajadas con él la mancha y visualizar a través de un microscopio óptico con 100x de aumento.
    1. Crear secciones de la parafina utilizando un micrótomo rotatorio.
    2. Dewax secciones con tres cambios de xileno cada 3 minutos.
    3. Rehidratar los tejidos con 100%, 95%, 80% y etanol al 70% cada 3 minutos y luego sumergir en agua destilada.
    4. Tinción con hematoxilina durante 10 minutos y luego enjuague en agua corriente.
    5. Distinguir con etanol ácido clorhídrico al 0.1% durante 5 minutos y enjuague en agua del grifo.
    6. Tinción con eosina 0,5% durante 1 minuto.
    7. Deshidratar los tejidos con etanol 70%, 80%, 95% y 100% cada 2 minutos.
    8. Claro de la tinción con xileno y secar en campana.

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Resultados

Quemadura de duración de 30 segundos por el hierro caliente resultó en heridas que eran circulares con un margen bien definido y uniforme claro con un borde de eritema (figura 1). Dentro de cada animal, había seis heridas de quemadura en el dorso. El arreglo de las heridas de la quemadura fue representado en la figura 1 K. Heridas de quemadura fueron totalmente cubiertas con apósito que contiene tapas y utilizadas para evaluar la...

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Discusión

El presente estudio estableció un modelo porcino de quemaduras severas y examinó el modelo usando un apósito que contiene los casquillos. Nuestros resultados sugieren que este modelo de cerdos se puede utilizar para supervisar el rendimiento clínico de preparaciones experimentales, incluida la propiedad antibacteriana. Heridas tipo, encierro de la herida y actividad antibacteriana también se analizaron mediante test de tinción y antibacteriano VSS, H & E. El uso de modelos animales quemadura se ha desarrollado como una h...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por una subvención del Tri-servicio General Hospital; Centro de médico de defensa nacional, Taiwán (TSGH-C107-042); Ministerio de ciencia y tecnología, Taiwán (mayoría 106-2314-B-016-014); y la defensa nacional Medical Center (MAB-106-055; MAB-106-010; MAB-107-064).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sedación:
KetaminaMerial2528 ESP10 mL vial
AzaperonaChina química y farmacéutica47W406100 mL
vial Atropina Trabajos químicos orientalesIN120802vial
Anestésico:
tiletamina+ZolazepamVirbacBC91vial de 5 mL
IsofluranoBaxterN002A225vial de 100 mL
Cirugía:
CortapelosMoser--
Solución exfoliante de yodo PovidonaEver star HA161202barril de 4 L
Hierro modificado---
Solución salina al 0,9%CHI SHENGKC130500 mL vial
GasaCentro de Apósitos Quirúrgicos de ChinaMO1590008010 x10 cm
CAPSCoreLeader Biotech Co., Ltd, Taipei, Taiwán--
Papel cinta3MNDC-8333-1530-012,5 cm x 9,1m
Película impermeable3MNDC-8333-1600-4010 cm x 10 m
Apósito adhesivo QuímicojovenBH142601510 cm x 10 m
Disección:
Par de tijeras rectas estándar afiladas/romas (14 cm)Shinetec instrumentsST-S114-
Halstead-Mosquito (12.5 cm)Shinetec instrumentsST-H012-Mango
(# 4)Shinetec instrumentsST-H004-Cuchilla
quirúrgica(#21)Shinetec instrumentsST-B021-
Post-Fixation & Almacenamiento:
50 ml Tubo de centrífuga de plástico Falcon352070-10
% formalina tamponada neutraLeica3800604EG-
crecimiento bacteriano fuerte  Placa de
agar sangre (BAP) (TSA con 5% de sangre de oveja) CMP-90mm Mono

Referencias

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