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Developmental Biology

小鼠胰腺内分泌细胞的单细胞 Transcriptomic 分析

Published: September 30, 2018 doi: 10.3791/58000
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1, *1,3, *1,3, 1
1College of Life Sciences, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University, 2Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University, 3PKU-Tsinghua-NIBS Graduate Program, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

我们描述了一种方法, 从胚胎, 新生儿和产后胰腺的内分泌细胞分离, 其次是单细胞 RNA 测序。这种方法可以分析胰腺内分泌谱系的发展, 细胞异质性和 transcriptomic 动力学。

Abstract

胰腺内分泌细胞聚集在胰岛, 调节血糖稳定性和能量代谢。胰岛细胞的不同类型, 包括胰岛素分泌β细胞, 在胚胎阶段与常见的内分泌祖先分化。未成熟的内分泌细胞通过细胞增殖和成熟在长时间的产后发育期内扩张。然而, 这些进程所依据的机制并没有明确界定。单细胞 RNA 测序是一种很有希望的方法来表征不同的细胞种群和追踪细胞谱系分化途径。在这里, 我们描述了从胚胎, 新生儿和产后胰腺分离的胰β细胞单细胞 RNA 序列的方法。

Introduction

胰腺是哺乳动物重要的代谢器官。胰腺由内分泌和外分泌的隔间组成。胰腺内分泌细胞, 包括产生胰岛素的β细胞和胰高血糖素生成α细胞, 聚集在胰岛并协调调节系统葡萄糖稳态。内分泌细胞功能失调导致糖尿病, 这已成为世界上一个重要的公共卫生问题。

胰腺内分泌细胞在胚胎发生1期间由 Ngn3+祖祖先衍生。后期, 在围产期, 内分泌细胞增殖形成未成熟的胰岛。这些不成熟的细胞继续发展, 逐渐成为成熟的胰岛, 这成为丰富的血管化调节血糖动态平衡在成人2。

虽然已经确定了一组转录因子来调节β细胞分化, 但β细胞的精确成熟途径还不清楚。此外, β细胞的成熟过程也涉及到细胞数量扩展3,4和细胞异质性的生成5,6。然而, 这些过程的监管机制还没有得到很好的研究。

单细胞 RNA 测序是一种强有力的方法, 可以分析细胞亚群和跟踪细胞谱系发展途径7。利用这一技术, 在胰岛发育过程中发生的关键事件可以在单细胞8级破译出来。在单细胞 RNA 测序协议中, Smart-seq2 允许生成全长 cDNA, 提高灵敏度和准确度, 并使用标准试剂降低成本9。Smart-seq2 大约需要两天时间来构建一个用于序列10的 cDNA 文库。

在这里, 我们提出了一种方法, 从胎儿胰腺的荧光标记β细胞分离到成年 Ins1-RFP 转基因小鼠11, 使用荧光活化细胞分类 (资产管制署), 并在 transcriptomic 分析的性能单细胞水平, 使用 Smart-seq2 技术 (图 1)。该协议可推广到所有胰腺内分泌细胞类型在正常、病理和衰老状态下的 transcriptomes 分析。

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Protocol

这里所描述的所有方法都已获得北京大学机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的批准。

1. 胰腺隔离

  1. 为 E17.5 (胚胎天 17.5) 胚胎:
    1. 估计胚胎日0.5 根据时间点时, 阴道插头出现。
    2. 通过2的管理, 牺牲怀孕的老鼠。用70% 酒精喷雾腹部毛皮。
    3. 用剪刀从延伸到肋骨的生殖器区做一个 V 形切口。这个过程将完全打开腹腔。
    4. 解剖子宫出腹腔, 并把它放在一个10厘米的菜, 包含冷 PBS。
    5. 在显微镜下用薄尖钳解剖子宫内的胚胎, 去除其他组织, 如胎盘和脐带。将所有胚胎放置在含有冷 PBS 的10厘米盘中。
    6. 撕开胚胎的腹腔, 用肘钳挖出内脏组织。将内脏组织移植到含有冷 PBS 的6厘米黑底盘中。
    7. 胰腺位于腹部的左上半部, 附着于胃、脾脏和十二指肠 (图 2A中的黄虚线)12。用镊子将胰腺从内脏组织中分离出来, 将胰腺组织组合成一个20毫升的小瓶, 含有5毫升0.5 毫克/毫升的冷胶原酶溶液: 0.5 毫克/毫升胶原酶 P 在隔离缓冲 (HBSS 含10毫米 HEPES, 1 毫米氯化镁2, 5 毫米葡萄糖, pH 值 7.4)。
  2. 为 P0-P15 (产后天 0-15) 小鼠:
    1. 用胶带将四肢附着在台式保护器上, 以牺牲和修复鼠标。用70% 酒精喷雾腹部毛皮。
    2. 完全打开腹腔, 如步骤1.1.3 所述。把肠子从老鼠的左边拉出来。这一过程将暴露胰腺的十二指肠, 胃和脾脏裂片。仔细解剖胰腺的所有裂片 (图 2B)12 , 并将胰腺组织组合成一个20毫升的小瓶, 含有5毫升的0.5 毫克/毫升冷胶原酶溶液。
  3. 为 P18-P60 (产后天 18-60) 小鼠:
    1. 准备胶原酶溶液。保持冰块, 直到准备使用。
    2. 牺牲鼠标, 打开腹腔如上所述 (步骤1.1.2 和 1.1.3)。
      注意: 不要伤害肝脏, 任何伤口对肝脏会减少流压入胆管和降低灌注效率的以下步骤。
    3. 删除剑突。将肠道拉出并向右移动鼠标, 并将肝脏的左、右内侧裂片推至两侧, 以暴露胆囊 (图 2C中的白色箭头) 和普通胆总管。
    4. 用一对小容器钳夹在十二指肠的上、下位置, 在胆管进入十二指肠的部位侧侧 (图 2D)。
      注意: 不要夹住胰腺的胃或脾叶。如果夹紧, 胶原酶溶液不会流入胰腺的胃和脾叶。
    5. 用5毫升的0.5 毫克/毫升冷胶原酶溶液填充注射器, 将30克针插入胆囊。小心和顺利, 操作针通过胆总管。
    6. 灌注胰腺通过注射1–5毫升0.5 毫克/毫升冷胶原酶溶液, 取决于大小的鼠标。注射应该是缓慢和恒定的, 以防止针从导管滑出和防止肠道爆裂在高液体压力下。当胰腺完全膨胀时, 注射完成。
    7. 在灌注后立即用镊子解剖胰腺 (图 2D中的黄色虚线)。将组织放置在含有5毫升0.5 毫克/毫升冷胶原酶溶液的20毫升瓶中。如果一次操作不止一只鼠标, 灌注小鼠, 然后将这些组织放入20毫升瓶中的冷胶原酶溶液中, 直到所有的老鼠都被解剖。

2. 胶原酶消化和胰岛分离

  1. 将含有胰腺组织的20毫升小瓶放入37摄氏度水浴中, 孵育3分钟以平衡温度。
  2. 轻轻地摇动管子3到5分钟。如果胰腺组织完全膨胀, 它将逐渐分离成小的组织块, 直到它最终被均匀地分散。消化时间根据胰腺大小和灌注效率而变化。
  3. 将所消化的产品通过0.25 毫米尼龙过滤器过滤成一个新的50毫升离心管。用装有冰冷 PBS 的20毫升注射器彻底清洗过滤器。
  4. 对于 E17.5-P15 胰腺, 请跳到步骤3.1。
  5. 对于 P18-P60 胰腺, 离心机在 200 x g 1 分钟, 并丢弃上清。用冷 PBS 重新悬浮组织。
  6. 将5毫升的组织悬浮液倒入6厘米的黑底盘中。胰岛小, 紧凑, 乳白色结构和腺泡组织松散和半透明白色。选择胰岛与 200 ul 吸管和转移到一个1.5 毫升的管含有少量的冷 PBS。

3. 胰组织或胰岛的胰蛋白酶消化

  1. 离心管含有胰腺组织或胰岛在 200 x g 1 分钟4摄氏度, 并放弃上清, 不干扰颗粒。
  2. 在37°c 的水浴中, 用0.25% 胰蛋白酶-EDTA 重新悬浮颗粒, 孵育。经过4分钟的孵化, 轻轻地和偶尔吸 (吸管) 1 分钟使用 200 ul 提示。
    注: 对于 E17.5-P3 胰腺, 加入1毫升胰蛋白酶-EDTA。P4-P15 胰腺, 加入3毫升胰蛋白酶-EDTA。100-300 个胰岛, 加入1毫升胰蛋白酶-EDTA。根据组织量调整胰蛋白酶-EDTA 的体积。
  3. 通过增加0.4x 体积的冷胎牛血清 (血清), 并通过柔和的漩涡混合, 停止消化。
  4. 离心机在 250 x g 3 分钟在4摄氏度。在不干扰球团的情况下丢弃上清液。
  5. 用 200 ul 冷的 HBSS 缓冲器 (含有1% 的血清, pH 7.4) 重新悬浮细胞。将细胞转移到5毫升的流式管。
  6. 快速旋转转管, 使细胞悬浮通过过滤器去除未消化的大组织碎片。管中的单细胞悬浮液现在已经准备好进行分类。

4. 单细胞裂解

  1. 准备细胞裂解缓冲液。
    注: 在带层流的紫外线灭菌罩下进行所有实验。所有的管, 板和吸管的提示应 RNase-/DNase 免费。使用前, 用 RNase 离开溶液来清除罩和吸管。
    1. 解冻在冰上的试剂: dNTP (10 毫米), 寡聚 dT 底漆 (10 微米), 和 ERCC 的库存解决方案 (1:20)。
    2. 将 ERCC 稀释至 1:5 x 105 , 核酸酶无水。
    3. 计算所需的细胞裂解缓冲容积。添加 0.1 ul 的 RNase 抑制剂 (40 U/ul), 1.9 ul 0.2% (卷/卷) 海卫 X-100, 1 ul 的 dNTP, 1 ul 的寡 dT 底漆, 和 0.05 ul 稀释 ERCC 到最后量 4.05 ul 为每个细胞。
    4. 将细胞裂解缓冲液整除0.2 毫升薄壁8条带 PCR 管或96井板。离心管或板材为三十年代在4°c。
      注: 离心机0.2 毫升薄壁8条带 PCR 管在 7500 x g 和96井板在 800 x g 在以下步骤。
  2. 单细胞采摘和裂解。
    1. 使用30–40µm 毛细管吸管, 手动选取将 Ins1-RFP+单细胞转化为8条带 PCR 管, 或直接将 Ins1-RFP+单细胞分类为96井板。包含单个单元格的卷被视为少于 0.3 ul。
      注: 使用正向散射高度 (fsc h) 与前向散射区 (fsc a) 的双重判别的门控策略, fsc-H vs 侧散射区 (SSC) 用于 Ins1-RFP+单元格的碎片和荧光门 (图 3A-3C) 排序。对于拾取方法, 将目标单元格分类为1.5 毫升管, 其中包含 300 ul 的外地资产控制缓冲区。适当的最后浓度是5–10细胞/ul。相应地调整缓冲卷。对于板材的采集方法, 在仪器的说明书之后, 将单个单元分为96井板的每个井。7,13
    2. 涡流管或板块溶解细胞并释放 RNA。离心管或板材为三十年代在4°c 并且立刻安置他们在冰。
      注: 细胞可以储存在-80 摄氏度的一个星期。

5. 单细胞 cDNA 扩增

  1. 反转转录 (RT)。
    1. 在冰上解冻 RT 试剂 (表 1)。
    2. 在72摄氏度孵育样品3分钟, 然后立即将管子或盘子放在冰上至少1分钟. 简要离心机管子或板材为三十年代在4°c。
      注: 使用热循环仪与105°c 加热盖子为所有孵化。
    3. 为所有反应准备 RT 组合, 如表 1所述。
    4. 分配 5.7 ul 的 RT 混合到每个样本, 使该卷总共 10 ul。轻轻涡旋混合和离心机为三十年代在4°c。
    5. 将样品放到热循环仪中, 然后启动 RT 程序, 如下所示:42 °c 为90分钟, 10 个周期 (50 °c 为2分钟, 42 °c 为2分钟), 70 °c 为15分钟和举行在4°c。
  2. PCR 预扩。
    1. 在冰上解冻 PCR 试剂 (表 2)。
    2. 为所有反应准备 PCR 组合, 如表 2所述。
    3. 分配 15 ul 的 PCR 混合到每个样本, 其中包含第一股反应。轻轻涡旋混合和离心机为三十年代在4°c。
    4. 放置样品到热循环仪和开始以下 PCR 计划:98 °c 为3分钟, 18 个周期 (98 °c 为二十年代, 67 °c 为十五年代, 72 °c 为6分钟), 72 °c 为5分钟和举行在4°c。
      注: PCR 产品可储存在4摄氏度, 不到一周或在-20 摄氏度/-80 摄氏度, 长达6月。
  3. PCR 纯化。
    1. 添加 25 ul 的重新悬浮 DNA 纯化珠 (1x) 的每个样品从上一步, 并混合良好的漩涡。然后, 快速旋转管或在室温下的板, 以收集液体, 但避免解决的珠子。
      注: 平衡 DNA 净化珠至室温为15分钟, 并在使用前彻底涡流。
    2. 室温下孵育5分钟。
    3. 将管子或盘子放在适当的磁架上, 直到溶液清晰, 然后小心地除去并丢弃上清。
    4. 添加 200 ul 的新鲜准备80% 乙醇洗珠, 而在磁性的立场, 孵化三十年代, 然后小心地去除和丢弃乙醇溶液。
      注: 80% (卷/卷) 乙醇溶液应每一次新鲜准备。
    5. 重复步骤 5.3.4, 共洗两次。
    6. 小心除去和丢弃剩余的乙醇溶液, 空气干燥的珠子, 而管或板块是在磁性立场。
      注意: 避免过干燥的珠子, 以确保最大的洗脱效率。
    7. 添加 11 ul 的核酸酶水, 洗脱的 DNA 目标从珠子和混合良好的涡旋。然后, 迅速旋转的管或板, 并把它放在一个磁性的立场, 直到解决方案是明确的。将样品的 10 ul 转移到新的 PCR 管上。
      注: 如果脂肪酸在单轮纯化后存在, 则基于 cDNA 粒径分布检测, 再净化彻底去除脂肪酸。如果允许留在样品中, 脂肪酸可以影响 cDNA 的产量计算。
  4. cDNA 的质量检查。
    1. 随机选择样本, 用荧光计检测 cDNA 的总产量。
    2. 应用实时 PCR (qPCR) 评价标记基因的表达水平 (图 4E)。删除 1 ul 的样品稀释40倍, 并执行 qPCR 使用384井板。如表 3所述, 准备 qPCR 组合。自行车条件:95 °c 为10分钟, 45 个周期 (95 °c 为十年代, 60 °c 为十五年代, 72 °c 为十五年代)。
    3. 采用平行毛细管电泳仪, 随机选取样品进行尺寸分布检测。

6. cDNA 文库建设

  1. Tagmentation 反应由 Tn5 transposase。
    1. 用荧光计检测 qPCR 中选定细胞的 cDNA 总收率。用2的 cDNA 作为起始材料。
    2. 在冰上解冻 tagmentation 反应试剂 (表 4)。
    3. 在0.2 毫升的薄壁8条带 PCR 管中制备 tagmentation 反应, 如表 4所述, 然后用涡旋仔细混合。然后, 快速地在室温下旋转溶液。
    4. 在55摄氏度孵化样品10分钟, 并保持在4摄氏度。
    5. 立即添加 2 ul 5x TS 的每个样本包含 tagmented DNA, 以停止反应。用涡旋仔细地混合, 然后在室温下快速地旋转溶液。
    6. 在室温下孵育混合物5分钟。DNA 应立即进行最终浓缩 PCR 处理。
  2. 放大适配器-结扎片段。
    1. 在冰上解冻 PCR 试剂 (表 5)。
    2. 准备浓缩 PCR 组合, 如表 5所述, 并小心地混合涡。然后, 快速地在室温下旋转溶液。
    3. 使用以下程序执行 PCR:72 °c 为10分钟, 98 °c 为三十年代, 8 个周期 (98 °c 为十五年代, 60 °c 为三十年代, 72 °c 为3分钟), 72 °c 为5分钟和举行在4°c。
      注: 周期数取决于预期的库 DNA 数量。
  3. PCR 纯化与大小选择。
    1. 添加 14 ul 的重新悬浮 DNA 净化珠 (0.7 x) 的每个样品从上一步, 并混合良好的涡。然后, 快速旋转管在室温下收集的液体, 但避免解决的珠子。
      注: 平衡 DNA 净化珠至室温为15分钟, 并在使用前彻底涡流。
    2. 室温下孵育5分钟。
    3. 将管子放在适当的磁支架上, 直到溶液清晰, 小心地将上清转移到新的管条上, 然后丢弃前管条纹。
    4. 添加 3 ul 的重新悬浮 DNA 纯化珠 (0.15x) 到每个样品的管状条纹和混合良好的涡。然后, 在室温下快速旋转管子。
    5. 室温下孵育5分钟。
    6. 将管子或盘子放在适当的磁架上, 直到溶液清晰, 然后小心地除去并丢弃上清。
    7. 添加 200 ul 的新鲜准备80% 乙醇洗珠, 而在磁性的立场, 孵化三十年代, 然后小心地去除和丢弃乙醇溶液。
      注: 80% (卷/卷) 乙醇溶液应每一次新鲜准备。
    8. 重复步骤 6.3.7, 共洗两次。
    9. 小心除去和丢弃剩余的乙醇溶液, 空气干燥的珠子, 而管或板块是在磁性立场。
      注意: 避免过干燥的珠子, 以确保最大的洗脱效率。
    10. 添加 11 ul 的核酸酶水, 洗脱的 DNA 目标从珠子和混合良好的涡旋。然后, 迅速旋转的管或板, 并把它放在一个磁性的立场, 直到解决方案是明确的。将样品的 10 ul 转移到新的管条上。
  4. 最终 cDNA 文库的质量检查。
    1. 使用荧光计测量每个库的浓度, 并使用平行毛细管电泳仪检查大小分布。
      注: DNA 产率通常介于每个库的15–25之间。从 250 bp 到 450 bp 的碎片将被观察到。如果脂肪酸留在纯化后, 经尺寸分布检查确认, 再用 1 x DNA 纯化珠一次提纯。
  5. 库池
    1. 根据近似片段大小, 池中每个样本的 DNA 数量相等, 以确保它们中没有一个包含相同的 N6XX 和 N8XX 适配器的组合。

7. DNA 测序

  1. 主题条形码库到 51 bp 单端排序使用高通量测序系统。按照制造商的协议执行排序。每个单元的测序深度平均为8, 每单元14的读数至少为50万读100万。

8. 生物信息学分析

  1. 排序质量评估和校准。
    1. 使用 FastQC (v0.11.3)15对顺序读取的质量进行评估, 其参数如下: "FastQC--output_dir input_fastq"。
    2. 将鼠标基因组与 ERCC 序列结合使用命令 "cat mm10 ERCC. 法 > mm10_ERCC 法"。
    3. 使用以下参数生成 bowtie2 (v2.2.5)16索引: "bowtie2-build mm10_ERCC. fa mm10_ERCC"。
    4. 使用 tophat2 (v2.1.0)17与以下参数对齐读取: "tophat2 output_dir-G 基因. gtf 转录 trans_index 指数 mm10_ERCC"。
  2. 量化基因表达水平。
    1. 使用 HTSeq (v 0.6.0)18对每个基因的映射读取进行计数, 其参数为: "HTSeq 计数-\r pos-s 不为 30 accepted_hits. bam 基因 gtf > read_count .txt"。
    2. 将基因表达水平正常化为每百万 (TPM)19的成绩单。
  3. 细胞的质量控制。
    1. 排除少于50万个映射读数或少于4000个基因的单元格 (TPM > 1)。
      注意: 排除的标准取决于单元类型和序列深度。
    2. 保留表达内分泌标记的细胞 (例如, β细胞的 Ins1, α细胞的Gcg ), 并排除表达非内分泌标记物的细胞 (如白细胞的Spi1 )。
  4. 主成分分析 (PCA)
    1. 根据 ERCC, 如前所述20, 确定高度可变基因。
    2. 使用 R 包 FactoMineR (v1.31.4)21中的函数 "pca" 执行 pca, 具有高度可变基因的 log2 (TPM + 0.1)。
    3. 用 ggplot2 (v2.0.0)22可视化 PCA 结果。
  5. 分层聚类。
    1. 使用 "dimdesc" 函数 FactoMineR (v1.31.4)21确定具有最高主成分 (PC) 载荷的基因。
    2. 使用 R 封装 gplots (v3.0.1)23中的函数 "热图 2" 执行分层聚类, 具有 log2 (TPM + 1) 高 PC 加载基因的相对值。

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Representative Results

胰腺从胚胎, 新生儿和产后小鼠 (图 2A 和2B) 进行解剖。对于18岁以上的小鼠, 消化作用取决于灌注程度;因此, 注射是胰岛隔离的最重要步骤 (图 2C-2E和表 6)。在这一步中, 尽可能多地注射胶原酶来填充胰腺。完全膨胀的胰腺如图 2D所示。如果灌注不成功 (图 2E), 但样本是珍贵的, 胰腺可以被撕成小块, 以充分消化后。

灌注后, 胰腺组织被消化成小块释放胰岛 (图 2F)。为了缩短细胞的分类时间, 我们提前提取了胰岛, 丰富了内分泌单元。小岛的大小可能因老鼠的年龄和消化强度而异。偶尔, 小岛不是圆的形状。应根据颜色和紧凑状态选择胰岛 (图 2G和表 6)。如果转基因小鼠菌株有一个报告基因, 如 GFP 或对内分泌细胞的 RFP, 胰岛也可以在荧光显微镜下摘下。

Ins1-RFP+细胞的纯化, 通过外地资产管制 (图 3A-3C), 然后单细胞被挑选使用毛细管吸管为单细胞 RNA 序列 (图 3D)。成功扩增的 cDNA 应该有一个完整的长度超过 500 bp 和丰富从 1.5 kb 到 2 kb。此外, 通常有500-600 的 bp 丰富的 cDNA 在 Ins1-RFP+细胞, 这可能代表胰岛素转录 (图 4A)。然而, 出现了一些异常情况10 (表 6)。例如, 近 100 bp 的 cDNA 片段是底漆脂肪酸 (图 4B), 通常是由过量底漆引起的, 必须通过重复 DNA 纯化步骤来去除。底漆脂肪酸的存在可能影响到总 cDNA 产生率的计算, 用于以下图书馆建设。100 bp 和 500 bp 之间的 cdna 片段通常代表退化 cDNA (图 4C), 这是由坏的细胞状态或试剂问题, 如 RNase 污染造成的。在这种情况下, 我们应该找出 DNA 降解的原因, 排除干扰。例如, 为了确保良好的细胞状态, 组织应被消化, 细胞应迅速和温和地排序, 并应谨慎执行操作, 以避免任何类型的污染物。

在对基因序列进行纯化后, 通过对样品中 DNA 纯化珠的不同比值的说明, 获得了不同尺寸的 cdna 片段。例如, 我们可以获得从 250 bp 到 450 bp 的 cDNA, 分别将0.7x 和 0.15x DNA 纯化珠添加到第一和第二轮纯化中 (图 4D)。这一步的成功率很高。然而, 如果有大约 100 bp 的片段, 建议用 1x DNA 纯化珠重新净化图书馆以去除脂肪酸 (表 6)。Unremoved 脂肪酸将会扭曲 DNA 量化, 影响样本池结果, 从而导致各样本数据的不均匀采集。

我们用生物信息学的方法分析了测序数据 (图 5A)。在测序质量评估中, 测序质量分数应大于 30 (图 5B)。对齐后, 80-90% 的读数将被映射到参考基因组。为了获得高品质的细胞进行下游分析, 我们排除的细胞少于50万映射读数或少于4000检测到的基因 (图 5C和5D)。在 PCA 和层次聚类之后, 我们对不同组的细胞进行了特征分析, 确定了不同组8异种地表达的基因。

Figure 1
图 1: 小鼠胰腺内分泌细胞单细胞 RNA 序列的示意图.请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 胰腺解剖, 灌注和胰岛采摘.(A) 从 E17.5 胚胎 (上部) 解剖胚胎胰腺组织 (下)。黄色虚线界定胰腺组织。刻度条 = 1000 µm (B) 从 P10 鼠 (左) 解剖后胰腺组织 (右)。刻度条 = 1000 µm (c D) P60 鼠在 (c) 和后 (D) 灌注后的胰腺组织。黄色虚线界定胰腺组织。白色箭头表示胆囊。(E) P60 小鼠的部分灌注胰腺组织。红色箭头表示胰腺的井下灌注区域。蓝色箭头表示胰腺的灌注面积不太低。(F) 胰腺组织前 (上) 和后 (下) 胶原酶消化。(G) 箭头指向从胶原酶消化的胰腺组织释放的胰岛。刻度条 = 200 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.

Figure 3
图 3: 在显微镜下用30–40µm 毛细管吸管手工采摘细胞.(丙)Ins1-RFP+单元格分类的步进式智能开关门。(D) 明亮的圆圈表示细胞和管是毛细管吸管。选取具有较好形态学 (箭头) 的单元格, 并忽略聚集单元格 (箭头)。刻度条 = 200 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.

Figure 4
图 4: 用平行毛细管电泳仪对 Ins1-RFP+细胞的 cDNA 和文库大小分布进行质量检测.(A) 成功地扩增基因 cDNA 的代表结果。通常, cDNA 剖面应在500以上的 bp 与一个〜 1.5–2 kb 峰值。(B) 前扩增的 cDNA 与二聚体峰值的代表性结果。引物二聚体峰值约为 100 bp. (C) 在 100 bp 和 500 bp 之间有片段的预扩 cdna 的剖面表明了 cdna 降解的可能性。(D) 在本议定书所述纯化步骤之后, 250 bp 和 450 bp 之间的 cDNA 文库的大小分布。(E) qPCR (左) 和相对测序数据 (右) Ins2在 cDNA 文库中的表达水平。x 轴代表不同的8个单细胞样本。y 轴 (左) 表示相对于Gapdh (ctGapdh-ctIns2 + 6) 的规范化ΔCt, y 轴 (右) 表示Ins2相对于Gapdh的规范化表达式级别 (log2(TPMIns2 /TPMGapdh))。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 单细胞转录数据的生物信息学分析.(A) 生物信息学分析的管道。(B) 在所有阅读基础上对质量分数进行排序。(C) 分配映射的读取计数。(D) 检测到的基因计数的分布情况。请单击此处查看此图的较大版本.

组件 容积 (µL)
逆转录酶 (200 U/µL) 0。5
RNase 抑制剂 0.25
第一股缓冲器 (5x) 2
数码地面 (100 毫米) 0。5
甜菜碱 (5 M) 2
氯化镁2 (1 M) 0.06
祖 (100 µM) 0。1
核酸酶水 0.29
总 5。7

表 1: RT 试剂混合组分在5.7 µL 反应为每个样品。

组件 容积 (µL)
第一股反应 10
DNA 聚合酶 (2x ReadyMix) 12。5
是 PCR 底漆 (10 µM) 0.25
核酸酶水 2.25
总 25

表 2: PCR 预放大试剂组合组分在25µL 反应为每个样品

组件 容积 (µL)
SYBR 绿色大师组合 5
底漆 (5 µM) 0。5
核酸酶水 2。5
Cdna 2
总 10

表 3: qPCR 试剂在10µL 反应中使用标准的 384-井板进行组合。

组件 容积 (µL)
5x TTBL 1。6
2 ng cDNA 变量
ddH2O 变量
混合 V5 2
总 8

表 4: Tagmentation 试剂组合组分在8µL 反应为每个样品。

组件 容积 (µL)
ddH2O 1。6
上一个步骤的产品 10
5x 标签 4
N6XX 2
N8XX 2
泰 0。4
总 20

表 5: 浓缩 PCR 试剂混合组分在20µL 反应为每个样品。

步 问题 可能性 解决 方案
1.3。4 夹子的滑动 小肠外表面因少量的间质液和 collegenase 的存在而湿化 leakness 用棉签轻轻地将腹腔内的十二指肠壁和其他器官壁交换
1.3。6 肚腑爆裂 液体压力太高在肚腑 降低注塑速度
2。6 胰岛在采摘胰岛时坚持外分泌组织 不足消化 延长消化持续时间和震动强度
5。3 PCR 扩增后 cDNA 产量低 细胞处于不良状态 保持细胞的新鲜和良好的状态
5.4 或6。4 底漆脂肪酸可以看到 过量底漆 用 DNA 纯化珠再一次纯化 cDNA (0.8: 1 或1:1 比值)
5。4 PCR 扩增后的降解 cDNA 细胞质量差或试剂污染不良 使细胞保持良好状态或改变试剂
6。3 图书馆建设后 DNA 含量低 PCR 周期太少或 cDNA 质量不好 在图书馆建设前增加周期数或保证 cDNA 质量

表 6: 疑难解答。

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Discussion

在本协议中, 我们展示了一种有效且易于使用的方法来研究胰β细胞的单细胞表达谱。该方法可用于分离胚胎、新生儿和产后胰腺的内分泌细胞, 并进行单细胞 transcriptomic 分析。

最关键的步骤是在良好的条件下隔离单个β细胞。充分灌注胰腺对后续消化反应较好。灌注不足, 通常发生在背胰, 将导致低胰岛产量。灌注后, 消化时间和晃动强度需要特别注意。过度消化, 由于长时间的潜伏期和剧烈的震动, 可以打破小岛成碎片。消化不足不会完全将胰岛与相邻组织分开。胰岛消化后, 通过手工采摘而不是密度梯度离心纯化。虽然密度梯度离心可以丰富胰岛, 许多小胰岛或胰岛连接腺泡组织被错误丢弃。尽量避免采摘腺泡组织, 这可能导致无效的胰蛋白酶消化和降低β细胞的纯度。

独立的生物复制是区分生物变异和批效应的必要条件。如果两种生物复制在 PCA 中具有相似的模式, 并且在聚类结果中包括类似的子群, 则这些样本可能揭示可靠的生物变异性。否则, 需要额外的生物复制来确认结果。对于胰腺等代谢器官, 与生物钟24相关的细胞状态可能会引起批次差异。为了解决这个问题, 我们建议在一天中的同一时间收集所有的样品。

这种方法的局限性是吞吐量很低, 因为我们必须为每个单元格构建一个库。由于反应中的过量引物, 在图书馆建设前后的 cDNA 一般应提纯两次, 彻底去除底漆脂肪酸。这些过程非常耗时。最近, 报告了修改后的25协议, 可以在一定程度上解决这个问题。在本协议中, 特定于单元格的条形码标签在反向转录步骤中的 cDNA 片段。因此, 每个细胞的 cDNA 可以汇集在一起然后被纯化, 其次是图书馆的建设。这一修改大大提高了图书馆建设的吞吐量。然而, 这种改进的方法是不敏感的, 并检测到较少的基因每细胞。此外, 该方法是一个 3 ' 计数的方法, 减少读取覆盖率。因此, Smart-seq2 仍是胰腺发育最适宜的方法。

其他物种的胰腺制备可能不同。对于人类胰腺, 胰岛可以被隔离后, 以前的协议26,27。然后, 将孤立的胰岛分离成单个细胞28 , 用这种方法进行单细胞分析。该方法可广泛应用于哺乳动物胰腺发育、疾病和再生的研究。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢国家蛋白质科学中心, 北京 (北京大学) 和北京-清华生命科学计算平台中心。这项工作得到中国科学技术部 (2015CB942800)、中国国家自然科学基金 (31521004、31471358和 31522036) 的支持, 并由北京-清华大学生命科学中心向 C. R.X. 提供资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase P Roche 11213873001
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200114
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30071.03
Dumont #4 Forceps Roboz RS-4904
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5058
30 G BD Needle 1/2" Length BD 305106
Stereo Microscope Zeiss Stemi DV4
Stereo Fluorescence microscope Zeiss Stereo Lumar V12
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424R
Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap BD-Falcon 352235
96-Well PCR Microplate Axygen PCR-96-C
Silicone Sealing Mat Axygen AM-96-PCR-RD
Thin Well PCR Tube Extragene P-02X8-CF
Cell sorter BD Biosciences BD FACSAria
Capillary pipette Sutter B100-58-10
RNaseZap Ambion AM9780
ERCC RNA Spike-In Mix Life Technologies 4456740
Distilled water Gibco 10977
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
dNTP mix New England Biolabs N0447
Recombinant RNase Inhibitor Takara 2313
Superscript II reverse transcriptase Invitrogen 18064-014
First-strand buffer (5x) Invitrogen 18064-014
DTT Invitrogen 18064-014
Betaine Sigma-Aldrich 107-43-7
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Nuclease-free water Invitrogen AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) KAPA Biosystems KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP beads Vazyme N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix Vazyme Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina Vazyme TD502 Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 for Illumina Vazyme TD203 Include 16 N6XX and 24 N8XX
High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit Advanced Analytical Technologies DNF-474
1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl
4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4
0.44 mM KH2PO4
Isolation buffer 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4
FACS buffer 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4
NaCl Sigma-Aldrich S5886
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6297
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S5136
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H4034
MgCl2 Sigma-Aldrich M2393
Oligo-dT30VN primer 5'-AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGTACT30VN-3'
TSO 5'-AAGCAGTGGTATCAAC
GCAGAGTACATrGrG+G-3'
ISPCR primers 5'-AAGCAGTGGTAT
CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Forward primer 5'-ATGGTGAAGGTC
GGTGTGAAC-3'
Gapdh Reverse primer 5'-GCCTTGACT
GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Forward primer 5'-TGGCTTCTTC
TACACACCCA-3'
Ins2 Reverse primer 5'-TCTAGTTGCA
GTAGTTCTCCA-3'

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References

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发育生物学 问题 139 胰腺 内分泌细胞 β细胞 单细胞 RNA 序列 基因表达 细胞异质性
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Li, L. C., Yu, X. X., Zhang, Y. W., Feng, Y., Qiu, W. L., Xu, C. R. Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells. J. Vis. Exp. (139), e58000, doi:10.3791/58000 (2018).

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