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Developmental Biology

एकल-कक्ष Transcriptomic विश्लेषण माउस अग्नाशय अंत; स्रावी कोशिकाओं के

Published: September 30, 2018 doi: 10.3791/58000
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1, *1,3, *1,3, 1
1College of Life Sciences, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Peking University, 2Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University, 3PKU-Tsinghua-NIBS Graduate Program, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

हम भ्रूण, नवजात और जन्मोत्तर अग्न्याशय एकल सेल आरएनए अनुक्रमण द्वारा पीछा से अंत में स्रावी कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि का वर्णन । इस विधि अग्नाशय अंत-स्रावी वंश विकास, सेल विविधता और transcriptomic गतिशीलता का विश्लेषण की अनुमति देता है ।

Abstract

अग्नाशय के अंत में स्रावी कोशिकाओं, जो टाप में संकुल रहे हैं, रक्त ग्लूकोज स्थिरता और ऊर्जा चयापचय को विनियमित. विभिन्न प्रकार के सेल टाप में, इंसुलिन स्रावित β कोशिकाओं सहित, भ्रूण के चरण के दौरान आम अंत-स्रावी progenitors से भेदभाव कर रहे हैं. अपरिपक्व स्रावी कोशिकाओं सेल प्रसार के माध्यम से विस्तार और एक लंबी जन्मोत्तर विकास अवधि के दौरान परिपक्व । हालांकि, इन प्रक्रियाओं अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं हैं । एकल सेल आरएनए-अनुक्रमण अलग कोशिका आबादी के लक्षण वर्णन के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है और सेल वंश भेदभाव रास्ते अनुरेखण । यहाँ, हम भ्रूण, नवजात और जन्मोत्तर अग्न्याशय से पृथक अग्नाशय β कोशिकाओं के एकल सेल आरएनए-अनुक्रमण के लिए एक विधि का वर्णन ।

Introduction

अग्ंयाशय स्तनधारियों में एक महत्वपूर्ण चयापचय अंग है । अग्ंयाशय अंत में स्रावी और exocrine डिब्बों के शामिल है । अग्नाशय के अंत-स्रावी कोशिकाओं, सहित इंसुलिन का उत्पादन β कोशिकाओं और ग्लूकागन उत्पादन α कोशिकाओं, आइलेट्स के टाप में एक साथ क्लस्टर और समन्वयन प्रणालीगत ग्लूकोज homeostasis को विनियमित. अंत में स्रावी कोशिकाओं के रोग मधुमेह में परिणाम है, जो एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य दुनिया भर में मुद्दा बन गया है ।

अग्नाशय स्रावी कोशिकाओं Ngn3+ progenitors से embryogenesis1के दौरान प्राप्त कर रहे हैं । बाद में, प्रसवकालीन अवधि के दौरान, अंत में स्रावी कोशिकाओं अपरिपक्व टाप बनाने के लिए पैदा करना । इन अपरिपक्व कोशिकाओं को विकसित करने के लिए जारी है और धीरे-2वयस्कों में रक्त ग्लूकोज homeostasis को विनियमित करने के लिए बड़े पैमाने पर हो जाता है जो परिपक्व टाप, बन जाते हैं ।

हालांकि transcriptional कारकों के एक समूह की पहचान की गई है कि β कोशिका विभेद को विनियमित, β कोशिकाओं के सटीक परिपक्वता मार्ग अभी भी अस्पष्ट है. इसके अलावा, β सेल परिपक्वता प्रक्रिया भी सेल संख्या विस्तार के विनियमन3,4 और सेलुलर विविधता5,6की पीढ़ी शामिल है । हालांकि, इन प्रक्रियाओं के नियामक तंत्र अच्छी तरह से अध्ययन नहीं किया गया है ।

एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है कि प्रोफ़ाइल सेल उपआबादी और ट्रेस सेल वंश विकासात्मक रास्ते7कर सकते हैं । इस तकनीक का लाभ उठाते हुए, अग्नाशय के टाप डेवलपमेंट के दौरान होने वाली मुख्य घटनाओं को एकल-कक्ष स्तर8पर समझने में किया जा सकता है । एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण प्रोटोकॉल के बीच, स्मार्ट-seq2 बेहतर संवेदनशीलता और सटीकता के साथ पूर्ण लंबाई सीडीएनए की पीढ़ी की अनुमति देता है, और कम लागत9पर मानक रिएजेंट के उपयोग. स्मार्ट-seq210अनुक्रमण के लिए एक सीडीएनए पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए लगभग दो दिन लगते हैं ।

यहाँ, हम प्रतिदीप्ति के अलगाव के लिए एक विधि का प्रस्ताव-लेबल β कोशिकाओं भ्रूण के अग्न्याशय से वयस्क Ins1-आरएफपी ट्रांसजेनिक चूहों11के लिए, प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई का उपयोग (FACS), और पर transcriptomic विश्लेषणों का प्रदर्शन सिंगल-सेल स्तर, स्मार्ट-seq2 प्रौद्योगिकी (चित्रा 1) का उपयोग कर । इस प्रोटोकॉल को सामान्य, रोग और उम्र बढ़ने राज्यों में सभी अग्नाशय अंत-स्रावी कोशिका प्रकार के transcriptomes का विश्लेषण करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है ।

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Protocol

यहां वर्णित सभी विधियों को पेकिंग विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल एवं उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. अग्ंयाशय अलगाव

  1. ई 17.5 (भ्रूण दिवस १७.५) भ्रूण के लिए:
    1. अनुमान भ्रूण दिन ०.५ जब योनि प्लग प्रकट होता है समय बिंदु के आधार पर.
    2. 2 प्रशासन सह द्वारा गर्भवती चूहों की बलि । ७०% अल्कोहल के साथ उदर फर स्प्रे ।
    3. पसलियों के लिए विस्तार जननांग क्षेत्र से कैंची के साथ एक वी के आकार का चीरा बनाओ । इस प्रक्रिया से उदर गुहा पूरी तरह खुल जाएगी ।
    4. गर्भाशय को उदर गुहा से बाहर काटना और ठंडे पंजाबियों से युक्त 10 सेमी डिश में रखें ।
    5. एक stereomicroscope के नीचे पतले-इत्तला संदंश के साथ गर्भाशय से भ्रूण को काटना, अन्य ऊतकों को निकालकर, जैसे नाल और नाल की नाल. ठंडे पंजाबियों से युक्त 10 सेमी डिश में सभी भ्रूण को रखें ।
    6. आंसू ' भ्रूण उदर गुहा खुला और कोहनी चिमटी के साथ आंत के ऊतकों बाहर खुदाई । एक 6 सेमी ब्लैक-डाउन डिश युक्त ठंड पंजाब में आंत के ऊतकों स्थानांतरण ।
    7. अग्ंयाशय पेट के ऊपरी बाएँ भाग में स्थित है और पेट, तिल्ली और ग्रहणी ( चित्र 2aमें पीला बिंदीदार रेखा)12को देता है । संदंश और पूल का उपयोग आंत ऊतक से अग्ंयाशय अलग करें अग्नाशय के ऊतकों को एक साथ 20 मिलीलीटर की शीशी जिसमें 5 मिलीलीटर की ०.५ मिलीग्राम/एमएल शीत collagenase समाधान: ०.५ मिलीग्राम/एमएल collagenase अलगाव बफर में पी (10 मिमी HEPES, 1 मिमी MgCl2 युक्त HBSS , 5 मिमी ग्लूकोज, पीएच ७.४) ।
  2. P0-P15 (जन्मोत्तर day 0-15) चूहों के लिए:
    1. बलिदान और टेप के साथ benchtop रक्षक का एक टुकड़ा करने के लिए अंगों का पालन करके माउस को ठीक । ७०% अल्कोहल के साथ उदर फर स्प्रे ।
    2. पूरी तरह से चरण 1.1.3 में वर्णित के रूप में उदर गुहा खुला । मल बाहर खींचो और माउस के बाईं ओर करने के लिए । इस प्रक्रिया ग्रहणी, गैस्ट्रिक, और अग्ंयाशय के प्लीहा पालियों का पर्दाफाश होगा । ध्यान से अग्ंयाशय के सभी पालियों काटना (चित्रा 2 बी)12 और एक साथ एक 20 मिलीलीटर की शीशी में एक साथ अग्नाशय के ऊतकों पूल ०.५ मिलीग्राम/एमएल शीत collagenase समाधान के 5 मिलीलीटर ।
  3. P18-P60 (जन्मोत्तर day 18-60) चूहों के लिए:
    1. collagenase समाधान तैयार करें । उपयोग के लिए तैयार जब तक बर्फ पर रखो ।
    2. माउस बलिदान और उदर गुहा खोलने के रूप में ऊपर उल्लेख किया है (1.1.2 चरण और 1.1.3) ।
      नोट: जिगर को चोट नहीं है, जिगर के लिए किसी भी घाव पित्त नलिका में प्रवाह दबाव को कम करने और निम्न चरण की छिड़काव क्षमता को कम करेगा ।
    3. असिरूप निकालें । मल बाहर खींचो और माउस के दाईं ओर करने के लिए, और पित्ताशय की थैली ( चित्रा 2cमें सफेद तीर) और आम पित्त नलिका का पर्दाफाश करने के लिए प्रत्येक पक्ष को छोड़ दिया और सही औसत दर्जे का जिगर की पालियों धक्का ।
    4. ऊपरी और निचले स्थान पर छोटे पोत clamps की एक जोड़ी के साथ ग्रहणी क्लैंप, साइट जहां पित्त वाहिनी ग्रहणी (चित्रा 2d) में प्रवेश करती है पार्श्व ।
      नोट: अग्न्याशय की गैस्ट्रिक या प्लीहा पालियों दबाना नहीं है । collagenase समाधान अगर clamped अगले कदम में अग्न्याशय की गैस्ट्रिक और प्लीहा पालि में प्रवाह नहीं होगा ।
    5. ०.५ मिलीग्राम/एमएल शीत collagenase समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ एक सिरिंज भरें और पित्ताशय की थैली में एक 30 ग्राम सुई डालें । ध्यान से और आसानी से, आम पित्त नलिका के माध्यम से सुई हेरफेर ।
    6. Perfuse 1-5 मिलीलीटर से ०.५ मिलीग्राम/एमएल शीत collagenase समाधान, माउस के आकार के आधार पर अग्ंयाशय । इंजेक्शन धीमी गति से और नलिका के बाहर फिसल से सुई को रोकने के लिए और उच्च तरल दबाव के तहत फटने से आंत को रोकने के लिए लगातार किया जाना चाहिए । इंजेक्शन पूरा हो गया है जब अग्ंयाशय पूरी तरह से विस्तारित है ।
    7. काटना अग्न्याशय ( चित्र 2dमें पीला बिंदीदार रेखा) उदर गुहा से बाहर छिड़काव के बाद तुरंत संदंश का उपयोग कर । एक 20 मिलीलीटर की शीशी में ऊतक प्लेस ०.५ मिलीग्राम/एमएल शीत collagenase समाधान की 5 मिलीलीटर युक्त । यदि एक समय में एक से अधिक माउस को जोड़ तोड़, चूहों एक एक करके perfuse और एक 20 मिलीलीटर की शीशी में ठंडा collagenase समाधान में ऊतकों पूल जब तक सभी चूहों को विच्छेदित किया गया है ।

2. Collagenase पाचन और टाप अलगाव

  1. 20 मिलीलीटर शीशी एक ३७ ° c पानी स्नान में अग्नाशय के ऊतकों से युक्त प्लेस और 3 मिनट के लिए गर्मी तापमान equilibrate ।
  2. धीरे से एक और 3 से 5 मिनट के लिए ट्यूब हिला । अग्नाशय के ऊतकों को पूरी तरह से फुलाया जाता है, तो यह अंत में समान रूप से फैलाया जाता है जब तक यह धीरे-छोटे ऊतक टुकड़ों में अलग कर देना जाएगा । पाचन समय अग्ंयाशय आकार और छिड़काव दक्षता के आधार पर भिंन होता है ।
  3. एक नया ५० एमएल केंद्रापसारक ट्यूब में एक ०.२५ mm नायलॉन छलनी के माध्यम से पचा उत्पाद फ़िल्टर । के माध्यम से एक 20 मिलीलीटर बर्फ से युक्त सिरिंज का उपयोग छलनी धोने से ठंडा पंजाबियों ।
  4. ई 17.5-P15 अग्ंयाशय के लिए, चरण ३.१ पर जाएं ।
  5. P18-P60 अग्ंयाशय के लिए, 1 मिनट के लिए २०० x g पर केंद्रापसारक और supernatant को त्यागें । ठंडे पंजाबियों के साथ ऊतक फिर से निलंबित ।
  6. एक 6 सेमी काले-नीचे पकवान में ऊतक निलंबन के 5 मिलीलीटर डालो । अग्नाशय के टाप छोटे हैं, कॉम्पैक्ट, दूधिया सफेद संरचनाओं और कोष्ठकी ऊतक ढीला और पारदर्शी सफेद है । एक २०० μL पिपेट के साथ टाप उठाओ और उंहें एक १.५ मिलीलीटर ठंड पंजाबियों की एक छोटी राशि युक्त ट्यूब में स्थानांतरण ।

3. अग्नाशय के ऊतकों या टाप के Trypsin पाचन

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए २०० x g पर अग्नाशय के ऊतकों या टाप युक्त ट्यूब केंद्रापसारक और गोली परेशान बिना supernatant त्यागें ।
  2. पुनः ०.२५% trypsin-EDTA और एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में मशीन के साथ गोली स्थगित । गर्मी के 4 मिनट के बाद, धीरे और कभी-कभार महाप्राण (पिपेट) 1 मिनट के लिए २०० μL युक्तियों का उपयोग कर ।
    नोट: ई के लिए 17.5-पी 3 अग्ंयाशय, जोड़ें 1 मिलीलीटर trypsin-EDTA । पी 4-P15 अग्ंयाशय के लिए, 3 मिलीलीटर trypsin-EDTA जोड़ें । 100-300 टाप के लिए, 1 मिलीलीटर trypsin-EDTA जोड़ें । ऊतक की मात्रा के अनुसार trypsin-EDTA की मात्रा समायोजित करें ।
  3. ठंड भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और कोमल भंवर से मिश्रण की 0.4 x मात्रा जोड़कर पाचन बंद करो ।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए २५० x g पर केंद्रापसारक । गोली परेशान बिना supernatant त्यागें ।
  5. २०० μL शीत FACS बफर के साथ कोशिकाओं को फिर से निलंबित (1% FBS, पीएच ७.४) युक्त HBSS । एक 5 मिलीलीटर FACS ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं स्थानांतरण ।
  6. जल्दी से FACS ट्यूब स्पिन सेल निलंबन के लिए फिल्टर के माध्यम से पारित करने के लिए अपच बड़े ऊतक मलबे को दूर करने की अनुमति । ट्यूब में सिंगल सेल सस्पेंशन अब FACS छंटाई के लिए तैयार है ।

4. सिंगल सेल Lysis

  1. कक्ष lysis बफ़र तैयार करें ।
    नोट: लामिना प्रवाह के साथ एक यूवी निष्फल हुड के तहत सभी प्रयोगों प्रदर्शन करते हैं । सभी ट्यूबों, प्लेट्स और पिपेट टिप्स चाहिए RNase-/DNase-free. उपयोग करने से पहले RNase दूर समाधान के साथ डाकू और पिपेट को दूषित ।
    1. गल बर्फ पर रिएजेंट: dNTP (10 मिमी), oligo-डीटी प्राइमर (10 माइक्रोन), और ERCC स्टॉक समाधान (1:20) ।
    2. ERCC को पतला करने के लिए 1:5 x 105 nuclease-नि: शुल्क पानी के साथ ।
    3. आवश्यक कक्ष lysis बफ़र की मात्रा परिकलित करें । जोड़ें ०.१ μL के RNase अवरोध करनेवाला (४० U/μL), १.९ μL का ०.२% (vol/ट्राइटन X-१००, 1 μL of dNTP, 1 μL-dT प्राइमरी, और ०.०५ oligo पतला μL के लिए प्रत्येक कोशिका के लिए ४.०५ ERCC की एक अंतिम मात्रा ।
    4. Aliquot ०.२ मिलीलीटर पतली दीवार 8 धारी पीसीआर ट्यूबों या ९६-अच्छी तरह से प्लेटों में सेल lysis बफर । ट्यूब या प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए केंद्रापसारक ।
      नोट: ०.२ मिलीलीटर पतली दीवार 8-धारी पीसीआर ट्यूबों पर ७५०० x g और ९६-ठीक प्लेटों में ८०० x g पर निंनलिखित चरणों में ।
  2. एकल-कक्ष उठा और lysis ।
    1. मैन्युअल रूप से उठाओ FACS हल Ins1-आरएफपी+ एकल कोशिकाओं में FACS बफर 8 पट्टी पीसीआर ट्यूबों का उपयोग कर एक 30 – 40 µm केशिका पिपेट, या सीधे सॉर्ट Ins1-आरएफपी+ एकल कोशिकाओं में ९६-well प्लेट्स. एकल कक्ष वाली मात्रा को ०.३ μL से कम माना जाता है.
      नोट: आगे तितर बितर ऊंचाई का प्रयोग करें (FSC-एच) बनाम फॉरवर्ड तितर बितर क्षेत्र (FSC-a) नक़ल भेदभाव के लिए गेटिंग रणनीति, FSC-एच बनाम साइड स्कैटर क्षेत्र (SSC-a) मलबे और प्रतिदीप्ति गेटिंग के लिए Ins1 के लिए-आरएफपी+ सेल (आंकड़ा 3-3) छँटाई । खरीदना विधि के लिए, एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब ३०० μL FACS बफर युक्त में लक्ष्य कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें । उपयुक्त अंतिम एकाग्रता है 5 – 10 कोशिकाओं/μL. तदनुसार बफ़र वॉल्यूम समायोजित करें । थाली संग्रह विधि के लिए, साधन के मैनुअल निम्नलिखित एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुआं में एक एकल सेल सॉर्ट. 7 , 13
    2. भंवर ट्यूबों या प्लेटों कोशिकाओं लाइसे और आरएनए जारी करने के लिए । 30 एस के लिए ट्यूबों या प्लेटें 4 डिग्री सेल्सियस पर और तुरंत बर्फ पर उंहें जगह ।
      नोट: कोशिकाओं को एक सप्ताह के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।

5. सिंगल सेल सीडीएनए प्रवर्धन

  1. रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) ।
    1. गल आरटी रिएजेंट (टेबल 1) बर्फ पर ।
    2. 3 मिनट के लिए ७२ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन और तुरंत ट्यूबों या प्लेटें बर्फ पर कम से कम 1 मिनट के लिए डाल दिया । संक्षेप में ट्यूबों या प्लेटें 30 एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
      नोट: सभी गर्मी के लिए एक १०५ ° c गरम ढक्कन के साथ एक थर्मल साइकिल चालक का प्रयोग करें ।
    3. तालिका 1में बताए गए अनुसार सभी प्रतिक्रियाओं के लिए RT मिश्रण तैयार करें.
    4. ५.७ μL आरटी के मिश्रण का वितरण प्रत्येक नमूने को 10 μL की कुल करने के लिए मात्रा लाने के लिए । धीरे मिश्रण भंवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए केंद्रापसारक ।
    5. एक थर्मल साइकिल चालक में नमूनों प्लेस और इस प्रकार के रूप में आर टी कार्यक्रम शुरू: ९० मिनट के लिए ४२ ° c, 10 चक्र (2 मिनट के लिए ५० ° c, 2 मिनट के लिए ४२ ° c), ७० ° c 15 मिनट के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ ।
  2. पीसीआर पूर्व प्रवर्धन ।
    1. बर्फ पर पीसीआर रिएजेंट (तालिका 2) गल ।
    2. तालिका 2में वर्णित के रूप में सभी प्रतिक्रियाओं के लिए पीसीआर मिश्रण तैयार करें ।
    3. प्रत्येक नमूने के लिए पीसीआर मिक्स 15 μL का वितरण करें, जिसमें प्रथम-किनारा प्रतिक्रियाएं शामिल हैं । धीरे मिश्रण भंवर और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए केंद्रापसारक ।
    4. एक थर्मल साइकिल चालक में नमूने प्लेस और निंनलिखित पीसीआर कार्यक्रम शुरू: ९८ ° c 3 मिनट के लिए, 18 चक्र (९८ ° c के लिए 20 s, ६७ ° c के लिए 15 एस, ७२ ° c 6 मिनट के लिए), ७२ ° c 5 मिनट के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें ।
      नोट: पीसीआर उत्पाद 4 डिग्री सेल्सियस से कम एक सप्ताह के लिए या पर-20 ° c/-८० ° c के लिए 6 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  3. पीसीआर शुद्धि ।
    1. पिछले चरण से प्रत्येक नमूने के लिए फिर से निलंबित डीएनए शुद्धिकरण मोती (1x) के 25 μL जोड़ें और भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । तो, जल्दी से कमरे के तापमान पर ट्यूब या प्लेटें स्पिन तरल इकट्ठा करने के लिए, लेकिन मोतियों के निपटान से बचने के ।
      नोट: Equilibrate डीएनए शुद्धि मोती 15 मिनट और भंवर के लिए कमरे के तापमान के लिए अच्छी तरह से उपयोग करने से पहले ।
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
    3. एक उपयुक्त चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब या प्लेट रखें जब तक समाधान स्पष्ट है, तो ध्यान से हटाने और supernatant त्यागें ।
    4. जोड़ें २०० μL हौसले से तैयार ८०% इथेनॉल के लिए मोती धोने जबकि चुंबकीय स्टैंड में, 30 एस के लिए मशीन, तो ध्यान से हटाने और इथेनॉल समाधान त्यागें ।
      नोट: ८०% (vol/इथेनॉल समाधान नए सिरे से हर बार तैयार किया जाना चाहिए ।
    5. दोहराएं चरण 5.3.4 के लिए एक कुल दो बहाकर ।
    6. ध्यान से निकालें और छोड़ शेष इथेनॉल समाधान और हवा सूखी मोती जबकि ट्यूब या प्लेट चुंबकीय स्टैंड पर है ।
      नोट: अधिकतम रेफरेंस दक्षता सुनिश्चित करने के लिए मोतियों को सूखने से बचें ।
    7. nuclease के 11 μL जोड़ें-नि: शुल्क पानी को मोतियों से elute डीएनए लक्ष्य को अच्छी तरह से भंवर करके मिला लें । फिर, जल्दी से ट्यूब या प्लेट स्पिन और समाधान स्पष्ट है जब तक एक चुंबकीय स्टैंड पर यह जगह है । एक नई पीसीआर ट्यूब के लिए नमूने के 10 μL हस्तांतरण ।
      नोट: सीडीएनए आकार वितरण का पता लगाने के आधार पर शुद्धि के एक दौर के बाद dimers मौजूद हैं, तो पूरी तरह से dimers को दूर करने के लिए फिर से शुद्ध । dimers नमूना में रहने के लिए अनुमति दी तो सीडीएनए उपज परिकलन को प्रभावित कर सकते हैं ।
  4. सीडीएनए की गुणवत्ता की जांच ।
    1. बेतरतीब ढंग से एक fluorometer का उपयोग कर सीडीएनए कुल उपज का पता लगाने के लिए नमूने चुनें ।
    2. वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) (चित्रा 4E) द्वारा मार्कर जीन अभिव्यक्ति स्तर का मूल्यांकन करें । ४० बार पतला करने के लिए नमूने के 1 μL निकालें और एक ३८४-well प्लेट का उपयोग कर qPCR प्रदर्शन । तालिका 3में वर्णित के रूप में qPCR मिश्रण तैयार करें । सायक्लिंग शर्तें: ९५ ° c 10 मिनट के लिए, ४५ चक्र (९५ ° c 10 s के लिए, ६० ° c 15 s के लिए, ७२ ° c 15 s के लिए) ।
    3. बेतरतीब ढंग से एक समानांतर केशिका ट्रो साधन का उपयोग कर आकार वितरण का पता लगाने के लिए नमूने चुनें ।

6. सीडीएनए पुस्तकालय निर्माण

  1. Tn5 transposase द्वारा Tagmentation प्रतिक्रिया ।
    1. fluorometer का उपयोग कर 5.4.2 चरण से qPCR-चयनित कक्षों की सीडीएनए कुल प्राप्ति का पता लगाएँ । का प्रयोग करें 2 प्रारंभिक सामग्री के रूप में सीडीएनए के एनजी ।
    2. tagmentation रिएक्शन रिएजेंट (टेबल 4) बर्फ पर गल जाए ।
    3. तालिका 4में वर्णित के रूप में एक ०.२ मिलीलीटर पतली दीवार 8 धारी पीसीआर ट्यूब में tagmentation प्रतिक्रिया तैयार है, और भंवर द्वारा ध्यान से मिश्रण । फिर, जल्दी से कमरे के तापमान पर समाधान स्पिन ।
    4. 10 मिनट के लिए ५५ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की मशीन और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ ।
    5. तुरंत प्रतिक्रिया को रोकने के लिए tagmented डीएनए युक्त प्रत्येक नमूने के लिए 5x टीएस के 2 μL जोड़ें । भंवर द्वारा ध्यान से मिश्रण है, और फिर जल्दी से कमरे के तापमान पर समाधान नीचे स्पिन ।
    6. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मिश्रण की मशीन । डीएनए को अंतिम संवर्धन पीसीआर के लिए तुरंत कार्रवाई की जानी चाहिए ।
  2. एडाप्टर-ligated अंशों का प्रवर्धन ।
    1. बर्फ पर पीसीआर रिएजेंट (टेबल 5) गल जाए ।
    2. , 5 टेबलमें वर्णित के रूप में संवर्धन पीसीआर मिश्रण तैयार है, और भंवर से ध्यान से मिश्रण । फिर, जल्दी से कमरे के तापमान पर समाधान स्पिन ।
    3. निंन प्रोग्राम का उपयोग करके पीसीआर निष्पादित करें: ७२ ° c 10 मिनट के लिए, ९८ ° c 30 s, 8 चक्र के लिए (९८ ° c 15 s के लिए, ६० ° c के लिए 30 s, ७२ ° c 3 मिनट के लिए), ७२ ° c 5 मिनट के लिए और 4 ° c पर रखें ।
      नोट: चक्र की संख्या अपेक्षित पुस्तकालय डीएनए राशि पर निर्भर करता है ।
  3. आकार चयन के साथ पीसीआर शुद्धि ।
    1. जोड़ें 14 μL के पुनः निलंबित डीएनए शुद्धि मोती (०.७ एक्स) पिछले कदम से प्रत्येक नमूने के लिए और भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । फिर, जल्दी से कमरे के तापमान पर ट्यूब स्पिन तरल इकट्ठा करने के लिए, लेकिन मोतियों के निपटान से बचने के ।
      नोट: Equilibrate डीएनए शुद्धि मोती 15 मिनट और भंवर के लिए कमरे के तापमान के लिए अच्छी तरह से उपयोग करने से पहले ।
    2. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
    3. समाधान स्पष्ट है जब तक एक उपयुक्त चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब प्लेस, ध्यान से एक नया ट्यूब पट्टी करने के लिए supernatant हस्तांतरण और पिछले ट्यूब धारी त्यागें ।
    4. फिर से निलंबित डीएनए शोधन मोतियों की 3 μL जोड़ें (0.15 x) ट्यूब धारी में प्रत्येक नमूने के लिए और भंवर द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । फिर, जल्दी से कमरे के तापमान पर ट्यूब स्पिन ।
    5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
    6. एक उपयुक्त चुंबकीय स्टैंड पर ट्यूब या प्लेट रखें जब तक समाधान स्पष्ट है, तो ध्यान से हटाने और supernatant त्यागें ।
    7. जोड़ें २०० μL हौसले से तैयार ८०% इथेनॉल के लिए मोती धोने जबकि चुंबकीय स्टैंड में, 30 एस के लिए मशीन, तो ध्यान से हटाने और इथेनॉल समाधान त्यागें ।
      नोट: ८०% (vol/इथेनॉल समाधान नए सिरे से हर बार तैयार किया जाना चाहिए ।
    8. दोहराएं चरण 6.3.7 के लिए एक कुल दो बहाकर ।
    9. ध्यान से निकालें और छोड़ शेष इथेनॉल समाधान और हवा सूखी मोती जबकि ट्यूब या प्लेट चुंबकीय स्टैंड पर है ।
      नोट: अधिकतम रेफरेंस दक्षता सुनिश्चित करने के लिए मोतियों को सूखने से बचें ।
    10. nuclease के 11 μL जोड़ें-नि: शुल्क पानी को मोतियों से elute डीएनए लक्ष्य को अच्छी तरह से भंवर करके मिला लें । फिर, जल्दी से ट्यूब या प्लेट स्पिन और समाधान स्पष्ट है जब तक एक चुंबकीय स्टैंड पर यह जगह है । एक नई ट्यूब धारी के लिए नमूने के 10 μL हस्तांतरण ।
  4. अंतिम सीडीएनए पुस्तकालय की गुणवत्ता की जांच ।
    1. एक fluorometer का उपयोग कर प्रत्येक पुस्तकालय की एकाग्रता को मापने और एक समानांतर केशिका ट्रो साधन का उपयोग कर आकार वितरण की जाँच करें ।
      नोट: डीएनए उपज आमतौर पर 15 के बीच है-प्रत्येक पुस्तकालय के लिए एनजी 25 । २५० बीपी से लेकर ४५० बीपी तक के अंशों को मनाया जाएगा । यदि dimers शुद्धि के बाद रहते हैं, के रूप में आकार वितरण की जांच की पुष्टि की, 1 एक्स डीएनए शुद्धि मोती एक और समय के साथ शुद्ध ।
  5. लाइब्रेरी पूलिंग
    1. लगभग टुकड़ा आकार, पूल प्रत्येक नमूने से डीएनए के बराबर मात्रा के आधार पर, सुनिश्चित करना है कि उनमें से कोई भी N6XX और N8XX एडेप्टर का एक ही संयोजन होते हैं ।

7. डीएनए अनुक्रमण

  1. एक उच्च-प्रवाह अनुक्रमण प्रणाली का उपयोग कर ५१ बीपी एकल अंत अनुक्रमण करने के लिए बारकोड पुस्तकालयों विषय । निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद sequencing निष्पादित करें । प्रत्येक कक्ष की sequencing गहराई के बारे में १,०००,००० पढ़ता औसत8पर, कक्ष14प्रति कम से ५००,००० पढ़ता है ।

8. Bioinformatics िरा

  1. अनुक्रमण गुणवत्ता मूल्यांकन और संरेखण ।
    1. निंन पैरामीटर के साथ FastQC (v 0.11.3)15 का उपयोग करके sequenced पढ़ता की गुणवत्ता का मूल्यांकन करें: "FastQC--निकालें-o output_dir input_fastq" ।
    2. ERCC आदेश "कैट mm10. एफए ERCC. एफए > mm10_ERCC. एफए" का उपयोग कर दृश्यों के साथ माउस जीनोम विलय ।
    3. बिल्ड bowtie2 (v 2.2.5)16 अनुक्रमणिका निंन पैरामीटर के साथ: "bowtie2-बिल्ड mm10_ERCC. एफए mm10_ERCC" ।
    4. निम्न पैरामीटर के साथ tophat2 (v 2.1.0)17 का उपयोग कर पढ़ता संरेखित करें: "tophat2-o output_dir-G जीन. gtf--transcriptome-index trans_index mm10_ERCC input_fastq".
  2. जीन अभिव्यक्ति का स्तर बढ़ाता है ।
    1. प्रत्येक जीन का उपयोग HTSeq (v 0.6.0)18 निम्नलिखित मापदंडों के साथ के लिए गणना मैप किया गया पढ़ता: ' ' HTSeq-गणना-f bam-r pos-s no-a 30 accepted_hits. bam जीन. gtf > read_count. txt ' '.
    2. प्रति मिलियन (TPM)19टेप करने के लिए जीन अभिव्यक्ति के स्तर को सामान्य ।
  3. कोशिकाओं की गुणवत्ता नियंत्रण ।
    1. ५००,००० से कम मैप किए गए पढ़ता या ४,००० से कम जीन (TPM > 1) वाले कक्षों को शामिल न करे ।
      नोट: बहिष्करण की कसौटी कक्ष प्रकार और अनुक्रम गहराई पर निर्भर करता है.
    2. अंत में स्रावी मार्करों व्यक्त कोशिकाओं को बनाए रखने (उदाहरण के लिए, β कोशिकाओं के लिएIns1 , α कोशिकाओं के लिए Gcg ), और गैर-स्रावी मार्करों व्यक्त कोशिकाओं को बाहर (जैसे, ल्यूकोसाइट्स के लिए Spi1).
  4. प्रिंसिपल घटक विश्लेषण (पीसीए)
    1. ERCC स्पाइक के अनुसार अत्यधिक चर जीन की पहचान-ins, पहले20वर्णित के रूप में ।
    2. पीसीए प्रदर्शन का उपयोग कर समारोह "पीसीए" में आर पैकेज FactoMineR (v 1.31.4)21, log2 के साथ (TPM + ०.१) अत्यधिक चर जीन की.
    3. ggplot2 (v 2.0.0)22के साथ पीसीए परिणाम कल्पना ।
  5. पदानुक्रम clustering ।
    1. उच्चतम प्रमुख घटक के साथ जीन की पहचान (पीसी) "dimdesc" समारोह FactoMineR (वी 1.31.4)21का उपयोग कर लोड हो रहा है ।
    2. पदानुक्रम क्लस्टरिंग का उपयोग करते हुए फ़ंक्शन "हीटमैप .2" में R पैकेज gplots (v 3.0.1)23, के साथ log2 (TPM + 1) उच्च PC लोड जीन के सापेक्ष मान ।

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Representative Results

अग्ंयाशय भ्रूण, नवजात और जन्मोत्तर चूहों (चित्रा 2a और बी b) से विच्छेदित किया गया । जन्मोत्तर दिन 18 से अधिक पुराने चूहों के लिए, पाचन प्रभाव छिड़काव की डिग्री पर निर्भर करता है; इसलिए, इंजेक्शन टाप अलगाव (फिगर 2c-2E और टेबल 6) के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम है । के रूप में ज्यादा collagenase के रूप में इस कदम के दौरान अग्ंयाशय को भरने के लिए संभव था इंजेक्शन था । पूरी तरह से फुलाया अग्ंयाशय चित्र 2dमें दिखाया गया है । यदि छिड़काव (चित्रा 2E) सफल नहीं है, लेकिन नमूना कीमती है, अग्ंयाशय के लिए छोटे टुकड़ों में फाड़ा जा सकता है बाद में पर्याप्त पाचन के लिए ।

छिड़काव के बाद, अग्नाशय के ऊतकों को छोटे टुकड़ों में पचा गया था के लिए जारी टाप (चित्रा 2F) । FACS छंटाई समय कम करने के लिए, हम पहले से ही टाप उठा द्वारा अंत में स्रावी कोशिकाओं को समृद्ध । टाप के आकार माउस उंर और पाचन तीव्रता के आधार पर भिंन हो सकते हैं । कभी-कभार, टाप शेप में गोल नहीं होते । टाप कलर और कॉम्पैक्ट स्टेट (फिगर 2जी और टेबल 6) के अनुसार चुने जाने चाहिए । यदि ट्रांसजेनिक माउस तनाव एक रिपोर्टर जीन है, जैसे अंत में स्रावी कोशिकाओं के लिए GFP या आरएफपी के रूप में, टाप भी एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत उठाया जा सकता है ।

Ins1-आरएफपी+ कोशिकाओं FACS छँटाई (चित्रा3-3 सी), और फिर एकल कोशिकाओं एकल सेल आरएनए-seq (चित्रा 3d) के लिए एक केशिका पिपेट का उपयोग कर उठाया गया द्वारा शुद्ध थे. सफलतापूर्वक प्रवर्धित सीडीएनए ५०० बीपी के ऊपर एक पूर्ण लंबाई होनी चाहिए और १.५ केबी से 2 केबी को समृद्ध किया जाना चाहिए । इसके अलावा, वहां आमतौर पर एक 500-600 बीपी संवर्धन सीडीएनए के Ins1-आरएफपी+ कोशिकाओं है, जो इंसुलिन टेप (चित्रा 4a) का प्रतिनिधित्व कर सकते है में मनाया जाता है । हालांकि, वहां रहे है कुछ असामांय स्थितियों मनाया10 (तालिका 6) । उदाहरण के लिए, १०० bp के पास सीडीएनए अंश प्राइमरी dimers (फिगर 4B) हैं, जो कि आमतौर पर अत्यधिक प्राइमरों के कारण होते हैं, जिन्हें डीएनए शुद्धिकरण कदम को दोहरा कर हटाया जाना चाहिए. प्राइमरी dimers के अस्तित्व के कुल सीडीएनए पैदावार है, जो निंनलिखित पुस्तकालय निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है की गणना को प्रभावित कर सकते हैं । १०० बीपी और ५०० बीपी के बीच सीडीएनए टुकड़े आमतौर पर नीचा सीडीएनए (चित्रा 4c), जो खराब सेल स्थिति या reagent समस्याओं, जैसे RNase संदूषण के कारण होता है प्रतिनिधित्व करते हैं । इस शर्त के तहत हमें डीएनए क्षरण के कारण की पहचान करनी चाहिए और गड़बड़ी को बाहर करना चाहिए । उदाहरण के लिए, अच्छी कोशिका स्थिति सुनिश्चित करने के लिए, ऊतकों को पचा जाना चाहिए और कोशिकाओं को जल्दी और धीरे से सुलझाया जाना चाहिए, और ऑपरेशनों को किसी भी प्रकार के प्रदूषकों से बचने के लिए सावधानी से किया जाना चाहिए ।

अनुक्रमण के लिए सीडीएनए पुस्तकालयों की शुद्धि के बाद, हम नमूने के लिए डीएनए शोधन मोतियों के विभिन्न अनुपात को जोड़ने के लिए निर्देशों का पालन करके विभिन्न आकारों के सीडीएनए टुकड़े प्राप्त किया. उदाहरण के लिए, हम २५० bp से ४५० bp को जोड़कर 0.7 x और 0.15 x डीएनए शुद्धि मोतियों को शुद्धिकरण के पहले और दूसरे दौर में क्रमशः (फिगर 4d) सीडीएनए प्राप्त कर सकते हैं । इस चरण में एक उच्च सफलता दर है । हालांकि, अगर वहाँ लगभग १०० बीपी के टुकड़े कर रहे हैं, यह dimers (तालिका 6) को दूर करने के लिए 1x डीएनए शुद्धि मोतियों के साथ फिर से पुस्तकालयों को शुद्ध करने के लिए सुझाव दिया है । unremoveed डीएनए ठहराव तिरछा होगा और नमूना पूलिंग परिणाम, जो प्रत्येक नमूने से असमान डेटा अधिग्रहण में परिणाम को प्रभावित करेगा ।

हम bioinformatics दृष्टिकोण (चित्रा 5) के साथ sequencing डेटा का विश्लेषण किया. sequencing गुणवत्ता स्कोर sequencing गुणवत्ता मूल्यांकन (आरेख 5B) के दौरान 30 से अधिक होना चाहिए । संरेखण के बाद, 80-90% पढ़ता संदर्भ जीनोम के लिए मैप किया जा करने के लिए अपेक्षित हैं । अनुप्रवाह विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता वाले कक्षों को प्राप्त करने के लिए, हम से कम ५००,००० मैप की गई पुस्तकें या ४,००० से कम पता लगाया जीन (चित्रा 5C और 5d) के साथ कोशिकाओं को छोड़ दिया । पीसीए और पदानुक्रमित क्लस्टरिंग के बाद, हम कोशिकाओं के विभिन्न समूहों की विशेषता और जीन है कि विषम विभिन्न8समूहों में व्यक्त किए गए थे की पहचान की.

Figure 1
चित्रा 1: एकल सेल आरएनए के लिए योजनाबद्ध अवलोकन-माउस अग्नाशय अंत: स्रावी कोशिकाओं के seq. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: अग्ंयाशय विच्छेदन, छिड़काव और टाप उठा । (एक) एक ई 17.5 भ्रूण (ऊपरी) से भ्रूण अग्नाशय के ऊतकों (कम) के विच्छेदन । पीला बिंदीदार रेखा अग्नाशय के ऊतकों demarcates । स्केल बार = १,००० µm. (ख) एक P10 माउस (बाएं) से जन्मोत्तर अग्नाशय के ऊतकों (दाएं) के विच्छेदन । स्केल बार = १,००० µm. (c-d) से पहले एक P60 माउस के अग्नाशय के ऊतकों (c) और उसके बाद (d) छिड़काव. पीला बिंदीदार रेखा अग्नाशय के ऊतकों demarcates । सफेद तीर पित्ताशय की थैली को इंगित करता है । (ङ) एक P60 माउस के आंशिक रूप से perfused अग्नाशय के ऊतकों । लाल तीर अग्न्याशय की अच्छी तरह से perfused क्षेत्र को इंगित करता है । नीले तीर अग्ंयाशय के खराब perfused क्षेत्रों को इंगित करता है । (च) अग्नाशय के ऊतकों से पहले (ऊपरी) और बाद में (लोअर) collagenase पाचन । (छ) collagenase डाइजेस्ट अग्नाशय के ऊतकों से जारी किए गए थे कि टाप करने के लिए तीर बिंदु । स्केल बार = २०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: मैन्युअल रूप से एक खुर्दबीन के नीचे एक 30 – 40 µm केशिका पिपेट के साथ कोशिकाओं उठा. (A-C) Ins1-आरएफपी+ कोशिकाओं की छंटाई के लिए Step-वार FACS गेटिंग । (घ) उज्ज्वल हलकों कोशिकाओं का संकेत है और ट्यूब एक केशिका पिपेट है । बेहतर आकृति विज्ञान (तीर) वाले कक्षों को चुनें और संकुल कक्षों (Arrowhead) पर ध्यान न दें. स्केल बार = २०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: एक समानांतर केशिका ट्रो साधन द्वारा Ins1-आरएफपी+ कोशिकाओं के सीडीएनए और पुस्तकालय आकार वितरण की गुणवत्ता का पता लगाने । (क) सफलतापूर्वक पूर्व प्रवर्धित सीडीएनए का प्रतिनिधि परिणाम. आम तौर पर, सीडीएनए प्रोफाइल एक ~ 1.5 – 2 केबी पीक के साथ ५०० बीपी से ऊपर होना चाहिए । (ख) एक प्राइमरी डिमर चोटी के साथ पूर्व परिवर्धित सीडीएनए के प्रतिनिधि परिणाम. प्राइमरी डिमर पीक लगभग १०० बीपी है । (ग) १०० बीपी और ५०० बीपी के बीच के टुकड़ों के साथ पूर्व परिवर्धित सीडीएनए की रुपरेखा सीडीएनए क्षरण की संभावना को इंगित करती है । (घ) इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित शुद्धिकरण कदमों के बाद २५० बीपी और ४५० बीपी के बीच लेकर सीडीएनए पुस्तकालय का आकार वितरण. (ङ) qPCR (बाएँ) और संबंधित sequencing डेटा (दाएँ) द्वारा सीडीएनए लाइब्रेरीज़ में Ins2 की अभिव्यक्ति का स्तर. x-अक्ष विशिष्ट 8 एकल कक्ष नमूनों का प्रतिनिधित्व करते हैं । y -अक्ष (बाएँ) Gapdh (सीटीGapdh-सीटीIns2 + 6) के सापेक्ष सामान्यीकृत ΔCt का प्रतिनिधित्व करता है और y-अक्ष (दाएँ) Ins2 से संबंधित Gapdh के सामान्य अभिव्यक्ति स्तर का प्रतिनिधित्व करता है (लॉग2(TPM Ins2 /TPMGapdh)) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5: एकल-कक्ष transcriptome डेटा का Bioinformatics विश्लेषण । (क) पाइपलाइन का bioinformatics िरा. (ख) के सभी ठिकानों में अनुक्रमण गुणवत्ता स्कोर पढ़ता है । (C) मैप की गई पठन गणना का वितरण । (घ) पया जीन गणना का वितरण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

घटक मात्रा (µ एल)
रिवर्स transcriptase (२०० यू/µ एल) ०.५
RNase अवरोधक ०.२५
पहले-किनारा बफर (5x) 2
डीटीटी (१०० मिमी) ०.५
Betaine (5 मी) 2
MgCl२ (१ मी.) ०.०६
त्सो (१०० µ मी) ०.१
Nuclease-मुफ्त पानी ०.२९
कुल ५.७

तालिका 1: RT एजेंट मिश्रण घटक प्रत्येक नमूने के लिए एक ५.७ µ l प्रतिक्रिया में ।

घटक मात्रा (µ एल)
पहली किनारा प्रतिक्रिया 10
डीएनए पोलीमरेज़ (2x ReadyMix) १२.५
पीसीआर प्राइमर है (10 µ मीटर) ०.२५
Nuclease-मुफ्त पानी २.२५
कुल 25

तालिका 2: पीसीआर पूर्व प्रवर्धन रिएजेंट मिश्रण घटकों में एक 25 µ l प्रतिक्रिया प्रत्येक नमूने के लिए

घटक मात्रा (µ एल)
SYBR ग्रीन मास्टर मिक्स 5
प्राइमरी (5 µ मी) ०.५
Nuclease-मुफ्त पानी २.५
सीडीएनए 2
कुल 10

तालिका 3: एक मानक ३८४-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर एक 10 µ एल रिएक्शन में qPCR रिएजेंट मिक्स घटकों ।

घटक मात्रा (µ एल)
5x TTBL १.६
2 एनजी सीडीएनए चर
ddH२हे चर
TTE मिश्रण V5 2
कुल 8

तालिका 4: प्रत्येक नमूने के लिए एक 8 µ l प्रतिक्रिया में Tagmentation एजेंट मिश्रण घटक ।

घटक मात्रा (µ एल)
ddH२हे १.६
पिछले चरण का उत्पाद 10
5x टैब 4
N6XX 2
N8XX 2
Tae ०.४
कुल 20

तालिका 5: संवर्धन पीसीआर एजेंट मिश्रण प्रत्येक नमूने के लिए एक 20 µ एल प्रतिक्रिया में घटक ।

चरण समस्या संभावना समाधान
1.3.4 clamps की फिसल आंत की बाहरी सतह मध्य द्रव और collegenase टपकाना की छोटी राशि के अस्तित्व की वजह से गीला है धीरे ग्रहणी दीवार और अन्य अंग दीवारों कपास झाड़ू के साथ उदर गुहा में स्वैप
1.3.6 आंत फट तरल दबाव आंत में बहुत अधिक है इंजेक्शन की गति को धीमा
२.६ टाप exocrine ऊतक के लिए छड़ी जब उठा टाप Insufficent पाचन पाचन अवधि को लम्बा और मिलाते हुए ताकत
५.३ सीडीएनए उपज कम होने के बाद पीसीआर प्रवर्धन कोशिकाएं हैं खराब हालत में कोशिकाओं को ताजा और अच्छी हालत में रखें
५.४ या ६.४ प्राइमरी dimers को देखा जा सकता है अत्यधिक प्राइमर डीएनए शुद्धि मोतियों के साथ एक और समय सीडीएनए शुद्ध (0.8:1 या 1:1 अनुपात)
५.४ नीचा सीडीएनए बाद पीसीआर प्रवर्धन कोशिकाओं की खराब गुणवत्ता या दूषित रिएजेंट कोशिकाओं को अच्छी हालत में रखें या रिएजेंट चेंज करें
६.३ पुस्तकालय निर्माण के बाद डीएनए की राशि कम बहुत कम पीसीआर चक्र या सीडीएनए की गुणवत्ता अच्छी नहीं है के चक्र की संख्या में वृद्धि या पुस्तकालय निर्माण से पहले सीडीएनए गुणवत्ता सुनिश्चित

तालिका 6: समस्या निवारण ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम अग्नाशय β कोशिकाओं के एकल सेल अभिव्यक्ति प्रोफाइल का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी और आसान करने के लिए उपयोग विधि का प्रदर्शन किया । इस विधि से भ्रूण, नवजात और जन्मोत्तर अग्न्याशय से अंत में स्रावी कोशिकाओं को अलग करने के लिए और एकल सेल transcriptomic विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

सबसे महत्वपूर्ण कदम अच्छी हालत में एकल β कोशिकाओं का अलगाव है । पूरी तरह से perfused अग्न्याशय बाद पाचन करने के लिए बेहतर जवाब । अपर्याप्त छिड़काव, जो आमतौर पर पृष्ठीय अग्न्याशय में होता है, एक कम टाप यील्ड में परिणाम होगा. छिड़काव के बाद, पाचन समय और झटकों तीव्रता विशेष ध्यान देने की आवश्यकता है । अधिक पाचन, लंबे समय से मशीन समय और जोरदार झटकों से जिसके परिणामस्वरूप, टुकड़ों में टाप तोड़ सकते हैं । अपर्याप्त पाचन पूरी तरह से आसन्न ऊतकों से टाप को अलग नहीं करेगा । अग्ंयाशय के पाचन के बाद, टाप के बजाय घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा उठा हाथ से शुद्ध थे । हालांकि घनत्व ढाल केंद्रापसारक टाप को समृद्ध कर सकते हैं, कई छोटे टाप या कोष्ठकी ऊतक के साथ जुड़े टाप गलती से खारिज कर रहे हैं । कोष्ठकी ऊतक उठा से बचने के लिए प्रयास करें, जो असक्षम trypsin पाचन के कारण हो सकता है और β कोशिकाओं की शुद्धता को कम.

जैविक परिवर्तनशीलता और बैच प्रभाव भेद के लिए स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति आवश्यक हैं । यदि दो जैविक प्रतिकृति पीसीए में एक समान पैटर्न है और क्लस्टरिंग परिणामों में समान उप समूहों में शामिल हैं, इन नमूनों विश्वसनीय जैविक परिवर्तनशीलता प्रकट हो सकता है. अंयथा, अतिरिक्त जैविक प्रतिकृति परिणाम की पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं । इस तरह के अग्ंयाशय के रूप में एक चयापचय अंग के लिए, circadian घड़ी24 के साथ जुड़े सेल राज्य बैच मतभेद के लिए खाते में हो सकता है । इस समस्या को हल करने के लिए, हम दिन के एक ही समय में सभी नमूनों को एकत्रित करने की सलाह देते हैं ।

इस approach की सीमा कम प्रवाह है क्योंकि हम प्रत्येक कक्ष के लिए एक लायब्रेरी का निर्माण करने के लिए है । प्रतिक्रिया में अत्यधिक प्राइमरों के कारण, सीडीएनए से पहले और बाद में पुस्तकालय निर्माण के बाद आम तौर पर पूरी तरह से प्राइमरी dimers को दूर करने के लिए दो बार शुद्ध किया जाना चाहिए । इन प्रक्रियाओं समय लेने वाली हैं । हाल ही में, एक संशोधित प्रोटोकॉल25 बताया गया था कि कुछ हद तक इस समस्या का समाधान हो सकता है । इस प्रोटोकॉल में, कक्ष-विशिष्ट बारकोड उल्टे प्रतिलेखन चरण के दौरान सीडीएनए अंशों को लेबल कर देता है । इसलिए, प्रत्येक कोशिका के सीडीएनए एक साथ परित किया जा सकता है और फिर शुद्ध हो, पुस्तकालय निर्माण के बाद । यह संशोधन काफी पुस्तकालय निर्माण के प्रवाह को बढ़ाता है । हालांकि, इस संशोधित विधि कम संवेदनशील है और सेल प्रति कम जीन का पता लगाता है । इसके अलावा, इस विधि एक 3 ' कम पढ़ा कवरेज के साथ गिनती विधि है । इसलिए, स्मार्ट-seq2 अभी भी अग्नाशय के विकास के लिए सबसे उपयुक्त तरीका है ।

अंय प्रजातियों से अग्नाशय तैयारी अलग हो सकता है । मानव अग्ंयाशय के लिए, टाप पिछले प्रोटोकॉल26,27निंनलिखित अलग किया जा सकता है । फिर, पृथक टाप एकल कक्षों में असंबद्ध जा सकते हैं28 और इस विधि का उपयोग करके एकल-कक्ष विश्लेषण निष्पादित करें । इस विधि व्यापक रूप से स्तनधारी अग्नाशय के विकास, रोगों और पुनर्जनन के अनुसंधान के लिए लागू किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम राष्ट्रीय प्रोटीन विज्ञान, बीजिंग (पेकिंग विश्वविद्यालय) और जीवन विज्ञान कंप्यूटिंग मंच के लिए पेकिंग-Tsinghua केंद्र के लिए केंद्र का धंयवाद । इस काम को चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (2015CB942800), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१५२१००४, ३१४७१३५८, और ३१५२२०३६), और पेकिंग-Tsinghua केंद्र से जीवन विज्ञान के लिए सी के लिए वित्त पोषण के द्वारा समर्थित किया गया था R.X.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase P Roche 11213873001
Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200114
Fetal bovine serum (FBS) Hyclone SH30071.03
Dumont #4 Forceps Roboz RS-4904
Dumont #5 Forceps Roboz RS-5058
30 G BD Needle 1/2" Length BD 305106
Stereo Microscope Zeiss Stemi DV4
Stereo Fluorescence microscope Zeiss Stereo Lumar V12
Centrifuge Eppendorf 5810R
Centrifuge Eppendorf 5424R
Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap BD-Falcon 352235
96-Well PCR Microplate Axygen PCR-96-C
Silicone Sealing Mat Axygen AM-96-PCR-RD
Thin Well PCR Tube Extragene P-02X8-CF
Cell sorter BD Biosciences BD FACSAria
Capillary pipette Sutter B100-58-10
RNaseZap Ambion AM9780
ERCC RNA Spike-In Mix Life Technologies 4456740
Distilled water Gibco 10977
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284
dNTP mix New England Biolabs N0447
Recombinant RNase Inhibitor Takara 2313
Superscript II reverse transcriptase Invitrogen 18064-014
First-strand buffer (5x) Invitrogen 18064-014
DTT Invitrogen 18064-014
Betaine Sigma-Aldrich 107-43-7
MgCl2 Sigma-Aldrich 7786-30-3
Nuclease-free water Invitrogen AM9932
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) KAPA Biosystems KK2601
VAHTS DNA Clean Beads XP beads Vazyme N411-03
Qubit dsDNA HS Assay Kit Invitrogen Q32854
AceQ qPCR SYBR Green Master Mix Vazyme Q121-02
TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina Vazyme TD502 Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE
TruePrep Index Kit V3 for Illumina Vazyme TD203 Include 16 N6XX and 24 N8XX
High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit Advanced Analytical Technologies DNF-474
1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl
4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4
0.44 mM KH2PO4
Isolation buffer 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4
FACS buffer 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4
NaCl Sigma-Aldrich S5886
KCl Sigma-Aldrich P9541
NaHCO3 Sigma-Aldrich S6297
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S5136
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G5767
HEPES Sigma-Aldrich H4034
MgCl2 Sigma-Aldrich M2393
Oligo-dT30VN primer 5'-AAGCAGTGGTATCAA
CGCAGAGTACT30VN-3'
TSO 5'-AAGCAGTGGTATCAAC
GCAGAGTACATrGrG+G-3'
ISPCR primers 5'-AAGCAGTGGTAT
CAACGCAGAGT-3'
Gapdh Forward primer 5'-ATGGTGAAGGTC
GGTGTGAAC-3'
Gapdh Reverse primer 5'-GCCTTGACT
GTGCCGTTGAAT-3'
Ins2 Forward primer 5'-TGGCTTCTTC
TACACACCCA-3'
Ins2 Reverse primer 5'-TCTAGTTGCA
GTAGTTCTCCA-3'

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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