Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

Published: October 16, 2018 doi: 10.3791/58016
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Virus Research, The Westmead Institute for Medical Research, University of Sydney

Summary

רצף proviral בודדים באורך מלא (היפוך) מספקת שיטה יעילה, תפוקה גבוהה עבור הגברה רצף של יחיד, ליד באורך מלא (שלמים ולא פגומה) HIV-1 הפרו-וירוס והיא מאפשרת קביעה של הפוטנציאל שלהם שכפול-כשירות. סלטות מתגבר על המגבלות של מבחני הקודם שנועדה רצף המאגר HIV-1 סמויה.

Abstract

וזמינותו Full-Length בודדים Proviral רצף (היפוך) היא שיטה יעילה, תפוקה גבוהה שנועדה להגביר את רצף יחיד, ליד באורך מלא (שלמים ולא פגומה), HIV-1 הפרו-וירוס. סלטות מאפשר קביעת ההרכב הגנטי של HIV-1 משולב בתוך אוכלוסיה התא. דרך זיהוי פגמים בתוך רצפים proviral HIV-1 המתעוררות במהלך שעתוק במהופך, כגון מחיקות פנימי גדול, עצירה ברישול codons/hypermutation frameshift מוטציות, מוטציות/מחיקות ב- cis מתנהגים הרכיבים הנדרשים עבור virion ההבשלה, סלטות ניתן לזהות משולב הפרו-וירוס מסוגל שכפול. וזמינותו סלטות יכול להיות מנוצל כדי לזהות הפרו-וירוס HIV-1 חסר פגמים אלה, ולכן הם פוטנציאל שכפול-מוסמך. פרוטוקול סלטות כרוך: פירוק של תאים נגועים ב- HIV-1, מקונן PCR של יד הפרו-וירוס HIV-1 באורך מלא (באמצעות תחל ממוקד 5 HIV-1' ו 3' משמאל לימין), טיהור DNA, כימות, ספריית הכנה עבור הדור הבא רצף (הגדרות), הגדרות, דה נובו הרכבה של proviral contigs, השלילה פשוטה לזיהוי שכפול-המוסמכת הפרו-וירוס. סלטות מספק יתרונות על פני שיטות מסורתיות שנועדה רצף משולב הפרו-וירוס HIV-1, כגון רצף יחיד-proviral. סלטות מגביר את רצף ליד הפרו-וירוס באורך מלא הפעלת שכפול כשירות להיות נחוש, ואתה משתמש גם פחות תחל ההגברה מונע את ההשלכות של אי התאמות פריימר. סלטות הוא כלי שימושי להבנת הנוף גנטי של משולב HIV-1 הפרו-וירוס, בעיקר בתוך המאגר סמויה, עם זאת, ניצול שלו יכול להאריך יישום שבו נדרש ההרכב הגנטי של HIV-1 משולב.

Introduction

אפיון גנטי של המאגר HIV-1 סמויה, אשר נמשכת אצל אנשים על טיפול תרופתי לטווח ארוך (אמנות), היה חיוני להבנה כי הרוב המכריע של הפרו-וירוס משולבת הם פגומים, פסול השכפול1 , 2. במהלך התהליך של שעתוק במהופך, שגיאות הציג לתוך הרצף proviral משולב. כמה מנגנונים ליצור רצפים proviral פגומים כוללים את מועדת לטעויות האנזים רוורס טרנסקריפטאז HIV-13, תבנית מיתוג4, ו/או APOBEC-induced hypermutation5,6. שני מחקרים שנערכו לאחרונה מצאו כי כ- 5% של הפרו-וירוס HIV-1 מבודד מאנשים על אמנות לטווח ארוך גנטית לא נפגעו, או פוטנציאל שכפול-מוסמך, עשוי לתרום הריבאונד מהירה ב- HIV-1 רמות פלזמה עם הפסקת לאמנות 1 , 2 , 7. הקודם מחקרים זיהו כי שכפול-המוסמכת הפרו-וירוס HIV-1 מתעקש ותמימה. ואת נח זיכרון CD4+ T תא קבוצות משנה (כולל המרכזי, המעבר בתאי T הזיכרון אפקטור), המציין את החשיבות מיקוד אלה תאים בעתיד מיגור אסטרטגיות2,8,9.

בתחילת תובנות בחלוקת, דינמיקה ותחזוקה של המאגר HIV-1 החבויים הושגו דרך הניצול של שיטות רצף יחיד-proviral (SPS) המאפיינות אזורים תת-גנומית של הגנום HIV-110 גנטית ,11,12,13. SPS הוא כלי רב-תכליתי, היכולת רצף provirus יחיד של HIV-1 מ בתוך תא בודד נגועים. SPS זאת, אין אפשרות לקבוע את השכפול-כשירות של הפרו-וירוס, מאז זה רק רצף sub-גנומית אזורים ומתגעגע הפרו-וירוס המכילים מחיקות גדולות בתוך אתרי קישור פריימר. מחקר קודם הראה SPS מגזים בהערכת גודל המאגר שכפול-המוסמכת על ידי 13 - ל 17 פי דרך באופן סלקטיבי רצף שלם אזורים תת-גנומית2.

להתייחס למגבלות של SPS, הו. et al. 4 וברונר. et al. 1 פיתח מבחני לרצף ליד הפרו-וירוס HIV-1 באורך מלא. פעולה זו מותרת התדירות של שלמים גנטית, ולא פוטנציאל שכפול-המוסמכים, HIV-1 הפרו-וירוס אצל אנשים על אמנות לטווח ארוך נקבע. אלה מבחני מוגבר, רציף (via סנגר רצף) אזורים תת-גנומית שהורכבו ואז להשיג provirus HIV-1 של רצף (שלמים או פגום). שלוש מגבלות של גישה זו הם: 1) השימוש תחל רצף מרובים מגביר את הסיכון בשוגג היכרות עם פגמים לתוך הרצף proviral, 2) פריימר אי-התאמות עשוי למנוע הגברה של הפרו-וירוס מסוים, ולעתים קרובות 3) לא ניתן לפתור כל רצף proviral עקב טכני השיטות האלה.

כדי להתגבר על המגבלות של קיימים מבחני proviral רצף באורך מלא של HIV-1, פיתחנו Full -Length אניוהקבוצתית Proviral Sequencing (היפוך) וזמינותו. סלטות הוא רצף הדור הבא (הגדרות)-assay מבוסס אשר מגביר את רצף ליד באורך מלא (שלמים או פגומים) HIV-1 הפרו-וירוס באופן תפוקה גבוהה ויעילה. סלטות מספק יתרונות מבחני הקודם, כיוון שהוא מגביל את מספר תחל מנוצל; לכן, זה מקטין את הסיכוי פריימר אי-התאמות, אשר עשוי להגביל את אוכלוסיית הפרו-וירוס שנתפסו או שלא במתכוון להציג פגמים לתוך רצף ויראלי. סלטות הוא גם פחות טכנית מאתגר יותר מבחני הקודם והיא כוללת 6 צעדים עיקריים: תאים 1) פירוק של נגוע ב- HIV-1, 2) הגברה של יחיד הפרו-וירוס HIV-1 באמצעות PCR מקוננים בנטילת הגבלת דילול באמצעות תחל ספציפי עבור שנשמרת מאוד HIV-1 5' ואזור 3' U5 LTR (איור 1 א'), 3) טיהור, כימות של מוצרים מוגבר, 4) הכנת ספריה הפרו-וירוס מוגבר על המיתרים, 5) הגדרות, ו-6) דה נובו הרכבה של הפרו-וירוס ברצף כדי לקבל את contigs של כל אחד provirus בודדים.

רצפים שנוצרו על-ידי היפוך יכול לעבור השלילה מחמירים כדי לזהות את אלה אשר ומתפקד פוטנציאל שכפול-כשיר מבחינה גנטית (איור 1C)2. הפרו-וירוס גנטית ללא פגע חסרי כל פגמים ידועה והתוצאה בדור של provirus פסול השכפול. פגמים אלה כוללים: היפוך רצפים, מחיקות פנימי גדול, עצירה hypermutation/ברישול codons, frameshifts או מוטציות בגן 5' אריזה אות או מרכזי אחוי התורם (MSD).

Figure 1
איור 1: השלבים הקריטיים וזמינותו רצף proviral בודדים באורך מלא (היפוך). (א) ה-HIV-1 DNA הגנום עם אתרי מחייב פריימר 5' 3' U5 LTR ואזורים המשמשים סלטות כדי להגביר ליד באורך מלא (פגום ולא תקין) HIV-1 הפרו-וירוס באמצעות PCR מקוננים. הפריסה (B) של צלחת PCR 96-ובכן, המכיל מדגם 80 וולס (20 בארות כל דילול), בארות בקרה שלילית 4 ושליטה חיובי 1. טוב. (ג) תהליך של אלימינציה המשמש לזיהוי שלמים גנטית, ולא פוטנציאל שכפול-המוסמכים, HIV-1 הפרו-וירוס. דמות זו שונתה מ. Hiener et al. 2 . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי סקירה מוסדי-של אוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו ורובע מערב סידני מקומית בריאות, הכולל Westmead המכון למחקר רפואי.

1. פירוק של תאים נגועים ב- HIV-1

הערה: תאים עשוי להיות מבודד דם היקפיים, דוגמאות leukapheresis, ביופסיה מח עצם או ביופסיה רקמות. אולי ניתן למיין אוכלוסיות תאים באמצעות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS).

  1. הכנת מאגר פירוק המכיל 10 מ מ טריס-HCl, 0.5% Nonidet P–40, 0.5% Tween-20, ו- 0.3 מ"ג/מ"ל proteinase K. כדי צניפה תא, להוסיף 100 µL פירוק מאגר לכל עונה 1 פרק 106 תאים. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב. דגירה ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה ואחריו 85 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות lyse התאים ולשחרר דנ א גנומי PCR הגברה.
    הערה: פירוק תאים מספיקה להשיג את ה-DNA גנומי של הגברה. אין בידוד ה-DNA או טיהור נדרש. הפרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה, דנ א גנומי שניתן לאחסן ב-20 ° C ללא הגבלת זמן.

2. הגברה של הפרו-וירוס DNA HIV-1 יחידה באמצעות PCR מקוננים

  1. לערבב את ריאגנטים עבור PCR בסיבוב הראשון (PCR1) המופיעים בטבלה 1 (ראה טבלה של חומרים). להוסיף µL 38 של מיקס מאסטר וולס 85 (דוגמאות 80, פקדים שלילית 4, שליטה חיובית 1) של צלחת PCR 96-ובכן (בעקבות הפריסה באיור 1B). לייעד את הצלחת הזו, 'PCR1'.
מגיב ריכוז סופי נפח לצלחת PCR1 (µL) נפח לצלחת PCR2 (µL)
פריימר לפנים 1 מיקרומטר 32.3 23.8
פריימר הפוכה 1 מיקרומטר 32.3 23.8
מאגר (10 x) 1 x 323 238
MgSO4 (50 מ מ) 2 מ מ 129.2 95.2
dNTP (10 מ מ) 0.2 מ מ 64.6 47.6
Dna פולימראז (U 5/µL) 0.025 U/ΜL 16.2 11.9
הנדסה גנטית H2O 2632.5 1939.7

טבלה 1: ריאגנטים ואמצעי אחסון עבור ה-PCR מאסטר mixes.

הערה: צבעי יסוד המשמשים PCR1 הם:
BLOuterF: 5'-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-3' (HXB2 למקם 623-649)
BLOuterR: 5'-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTC-3' (HXB2 הצב 9662-9686)

  1. לאחר הכנת המיקס מאסטר, להעביר את הצלחת PCR1 אזור נקי המיועד התוספת של הדנ א.
    1. באופן סדרתי שתדללו הדנ א 1:3 על 1:81 עם טריס-HCl (5 מ"מ, pH 8), מתכונן 45 µL כל דילול (מספיק בארות 20 עבור כל דילול). להוסיף 2 µL של ה-DNA גנומי מדולל µL היטב ו-2 בכל דגימה של טריס-HCl (5 מ מ, pH 8) לשלוט בכל שלילי ובכן (בעקבות הפריסה באיור 1B). חותם כל הבארות של צלחת PCR1, למעט החיובי לשלוט, באמצעות חותם ברור דבק (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: דילולים המומלצת לעיל מגישים רק כמדריך המוצא לקביעת דילול מובילים. דילולים יהיה תלוי הריכוז של DNA משולב HIV-1 בתוך הדגימות.
  2. להעביר שטח המיועד התוספת של בקרה חיובית. להוסיף 2 µL של שליטה חיובית (pNL4-3 מדולל על עותקים5 10/µL...) אל הפקד חיובי טוב של צלחת PCR1, לאטום את הצלחת. בקצרה לסובב את הצלחת PCR1 PCR צלחת טווה או צנטריפוגה (400 x g עבור 10 s בטמפרטורת החדר) כדי להוריד את כל תוכן שיורית ומהצדדים של הבארות.
  3. להפעיל את הצלחת PCR1 thermocycler: 94 ° C למשך 2 דקות; ואז 94 ° C ל 30 s, 64 ° C ל 30 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במשך 3 מחזורים; 94 ° C ל 30 s, 61 ° C ל 30 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במשך 3 מחזורים; 94 ° C ל 30 s, 58 ° C ל 30 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במשך 3 מחזורים; 94 ° C ל 30 s, 55 ° C ל 30 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות 21 מחזורים; ואז 68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (סה כ 30 מחזורים). . תחזיק על 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה, הצלחת PCR1 נשמרים ב 4 ° C עד 2 ימים.
  4. מערבבים את ריאגנטים עבור השלב השני של ה-PCR (PCR2) המופיעים בטבלה 1. להוסיף 28 µL וולס 85 (דוגמאות 80, פקדים שלילית 4, שליטה חיובית 1) של צלחת PCR 96-ובכן חדשה (בעקבות הפריסה באיור 1B). לייעד את הצלחת הזו, 'PCR2'.

הערה: צבעי יסוד המשמשים PCR2 הם:
275F: 5'-ACAGGGACCTGAAAGCGAAAG-3' (HXB2 למקם 646-666)
280R: 5'-CTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACG-3' (HXB2 למקם 9650-9676)

  1. בקצרה לסובב את הצלחת PCR1 PCR צלחת טווה או צנטריפוגה (400 x g עבור 10 s בטמפרטורת החדר) כדי להוריד את כל תוכן שיורית ומהצדדים של הבארות. מוסיפים 80 µL של טריס-HCl (5 מ מ, pH 8) כל טוב של הלוח PCR1.
    1. העברה µL 2 של צלחת PCR1 לצלחת PCR2 באמצעות פיפטה רב-ערוצי. ודא דגימות מועברים טוב טוב (קרי, 2 µL מ טוב A1 של PCR1 צלחת מועבר גם A1 של PCR2 צלחת). חותם את הצלחת PCR2 באמצעות חותם ברור דבק (ראה טבלה של חומרים).
    2. בקצרה לסובב את הצלחת PCR2 PCR צלחת טווה או צנטריפוגה (400 x g עבור 10 s בטמפרטורת החדר) כדי להוריד את כל תוכן שיורית ומהצדדים של הבארות. חותם את הצלחת PCR1 עם חום איטום סרט לאחסון לטווח ארוך ב-20 ° C (ראה טבלה של חומרים).
  2. להפעיל את הצלחת PCR2 thermocycler: 94 ° C למשך 2 דקות; ואז 94 ° C ל 30 s, 64 ° C ל 30 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במשך 3 מחזורים; 94 ° C ל 30 s, 61 ° C ל 30 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במשך 3 מחזורים; 94 ° C ל 30 s, 58 ° C ל 30 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות במשך 3 מחזורים; 94 ° C ל 30 s, 55 ° C ל 30 s, 68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות מחזורים 31; ואז 68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות (סה כ 40 מחזורים). . תחזיק על 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול פה, הצלחת PCR2 נשמרים ב 4 ° C עד 2 ימים.
  3. בקצרה לסובב את הצלחת PCR2 PCR צלחת טווה או צנטריפוגה כדי להוריד את כל תוכן שיורית ומהצדדים של הבארות. להוסיף כל טוב באמצעות פיפטה רב-ערוצי µL 60 של טריס-HCl (5 מ מ, pH 8).
    1. לרוץ µL 15 של כל טוב על 2 x 48-ובכן precast 1% agarose ג'ל המכיל אתידיום ברומיד (0.1\u20120.3 µg/mL, ראה טבלה של חומרים). להשתמש בסולם עם מגוון עד 10 kb (ראה טבלה של חומרים). הצג באופן חזותי כדי לזהות הבארות המכיל את המוצר מוגבר וגדלים המשוער שלהם. לשמור את התמונה ג'ל.
      הערה: ודא שהפקד חיובי טוב מכיל מוצר מוגבר. אם הבארות שליטה שלילי מכילות מוצר מוגבר, שקול הזיהום והתעלם על צלחת.
  4. לקבוע דילול שבה לא יותר מ 30 אחוז מהבארות הן חיוביות עבור מוצר מוגבר.
    הערה: זה דילול מובילים שבו רוב (80%) של בארות מכיל מוצר מוגבר מתבנית אחת. דילול זה צריך להיות מוכן, המשמשות מותני הבאים כדי להשיג עוד proviral amplicons. שיא הגודל המשוער של כל מוצר מוגבר.

3. דנ א וטיהור כמת

  1. בקצרה לסובב את הצלחת PCR2 PCR צלחת טווה או צנטריפוגה כדי להוריד את כל תוכן שיורית ומהצדדים של הבארות. העברת 40 µL מן הבארות המכיל מוגבר המוצר (או תחתיו דילול מובילים) צלחת חדשה 96-ובכן midi (עם נפח טוב של 0.8 מ ל, ראה טבלה של חומרים).
    הערה: רשום מקוריים וחדשים גם המיקום של כל מוצר מוגבר בגיליון כרשומה של כל מוצר מוגבר היה לסדרם.
  2. לטהר את מוגבר מוצרים הדנ א באמצעות הוא לטיהור PCR חרוז מגנטיים מבוססי קיט (ראה טבלה של חומרים) כדי להסיר תחל, נוקלאוטידים, אנזימים, שמנים ומלחים. לפני שמתחילים, להביא beads מגנטי לטמפרטורת החדר ולהכין טריים 80% אתנול. השתמש בעצות פיפטה חדש בעת הצורך למנוע זיהום צולב של דגימות די אן איי.
    1. מערבולת beads מגנטי כדי להבטיח שהם נמצאים resuspended ביסודיות. באמצעות פיפטה רב-ערוצי, להוסיף µL 40 של מוצר מוגבר בצלחת 96-ובכן midi 0.8 מ ל 40 µL של חרוזים. פיפטה בעדינות לאורך 10 פעמים כדי לערבב. לחלופין, לערבב את הפתרון על ידי איטום המשטח ואז לוחץ על microplate מטרף-1,800 rpm עבור 2 דק Incubate בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
    2. המקום הלוחית מגנטי לעמוד (ראה טבלה של חומרים) עבור 2 דק להסיר ולמחוק supernatant.
    3. רחץ חרוזים על-ידי הוספת 200 µL של 80% אתנול בכל טוב עם הלוחית על דוכן העדים. תקופת דגירה בטמפרטורת החדר של הסרה ס' 30 וזורקים את תגובת שיקוע. חזור על פעם אחת. באמצעות פיפטה רב-ערוצי עם טיפים בסדר, להסיר כל אתנול עודף בעקבות לשטוף את השני. עם הלוחית על דוכן העדים, לאפשר את החרוזים מהאוויר להתייבש במשך 15 דקות.
    4. הסר את הלוחית של העמדה. להוסיף 30 µL • תנאי מאגר (ראה טבלה של חומרים) כדי מכל קידוח. פיפטה בעדינות לאורך 10 פעמים כדי לערבב. לחלופין, לערבב את הפתרון על ידי איטום המשטח ואז לוחץ על microplate מטרף-1,800 rpm עבור 2 דק Incubate בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    5. מניחים את הצלחת על דוכן מגנטי עבור 2 דק בעזרת פיפטה רב-ערוצי, להעביר 25 µL של תגובת שיקוע (DNA מטוהרים) צלחת חדשה של ה-PCR 96-ובכן. להבטיח כי הדגימות מועברים טוב-כדי-טוב (קרי, תגובת שיקוע של A1 טוב בצלחת 0.8 מ ל מועבר A1 טוב צלחת 96-ובכן חדש).
      הערה: 5 uL של המדגם eluted נשאר מאחור כדי להבטיח אין בהעברת חרוזים טיהור שיורית.
  3. לקבוע ולהקליט את הריכוז המשוער של כל מוצר ה-DNA מוגבר בעקבות טיהור באמצעות ספקטרופוטומטרים (ספיגת באורך-גל של 260 ננומטר).
    הערה: מדידת ריכוז המשוער של כל מוצר מוגבר נחוצה בשלב זה כדי להבטיח. בלי דוגמיות אבדו במהלך השלבים טיהור, כי ריכוז המשוער הוא בטווח של העקומה סטנדרטיים המשמשים את (השלב הבא 0.001 – 1 ng/µL של ה-DNA ב 100 µL של אמצעי אחסון). ניתן להשהות את הפרוטוקול פה, דגימות נקי שניתן לאחסן ב-20 ° C עד 6 חודשים.
  4. לכמת את הריכוז של ה-DNA של כל מוצר מטוהרים באמצעות כימות של dsDNA קיט (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: פעולה זו כרוכה באמצעות עיקול רגיל כדי לקבוע ריכוז dsDNA במדגם. הערכה כוללת מאגר (10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 7.5), למדה dsDNA, ובתנאים של הפלורסנט. שמור כל ריאגנטים על קרח. מכסים את הצינור המכיל צבע עם רדיד כדי להימנע מחשיפה לאור. למדוד את הריכוז של כל מוצר מוגבר דולר.
    1. מאגר שתדללו ל- x 1 סטרילי DNase חינם H2O. הוסף 99 µL של מאגר כדי מספר מתאים של בארות ריק (3 פעמים מספר המוצרים מוגבר כדי למדוד, עיין בטבלה 2 עבור פריסה של דוגמה) של צלחת תרביות רקמה בתחתית שטוח. להוסיף 100 µL מאגר 3 בארות ריק.
    2. עבור כל מוצר מוגבר למדוד, להוסיף 1 µL של ה-DNA מטוהרים (מתוך שלב 3.2.5) שהפקידים כל טוב המכיל מאגר (לקבלת פריסה של דוגמה, ראה טבלה 2 ).
    3. לשם הכנת תקנים, לדלל lamda dsDNA 10-fold מ- ng/µL 2 עד 0.002 ng / µL. להוסיף 100 µL של כל dsDNA סטנדרטי 3 בארות.
      הערה: בעקבות צעד 3.4.4, הריכוז הסופי של הסטנדרטים בטווח של 1 עד 0.001 ng/µL
    4. לדלל את 1:200 הפלורסנט עם מאגר. להוסיף במהירות 100 µL לכל טוב המכיל דוגמת כדורי סרק, סטנדרטים. מערבבים למעלה ולמטה עם פיפטה. כיסוי לצלחת עם נייר כסף כדי למנוע מגע עם אור.
    5. לקרוא את פליטת קרינה פלואורסצנטית על קורא microplate (עירור-480 ננומטר, פליטה-520 ננומטר). תוצאות שיא בגיליון אלקטרוני.
    6. לקבוע את הריכוז של dsDNA בכל מדגם באמצעות המדידות פלורסצנטיות הקליט. להחסיר את קרינה פלואורסצנטית נמדד הבארות ריק מן המדגם סטנדרטים. לקבוע את קרינה פלואורסצנטית הממוצע עבור כל דגימה וכל הרגילה של triplicates. צייר עיקול רגיל המבוסס על המדידות פלורסצנטיות בסטנדרטים גבוהים. לקבוע את הריכוז של הדגימות יחסית הסטנדרטים.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A תקן (1 ng/mL) תקן (0.1 ng/mL) תקן (0.01 ng/mL) תקן (0.001 ng/mL) ריק
100 מ 100 מ 100 מ 100 מ מאגר 100 מ
B תקן (1 ng/mL) תקן (0.1 ng/mL) תקן (0.01 ng/mL) תקן (0.001 ng/mL) ריק
100 מ 100 מ 100 מ 100 מ מאגר 100 מ
C תקן (1 ng/mL) תקן (0.1 ng/mL) תקן (0.01 ng/mL) תקן (0.001 ng/mL) ריק
100 מ 100 מ 100 מ 100 מ מאגר 100 מ
D דוגמה 1: דוגמה 2: דוגמה 3: דוגמה 4: דוגמה 5: דוגמה 6: דוגמה 7: דוגמת 8: דוגמת 9: דוגמת 10: דוגמת 11: דוגמת 12:
DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99
E דוגמה 1: דוגמה 2: דוגמה 3: דוגמה 4: דוגמה 5: דוגמה 6: דוגמה 7: דוגמת 8: דוגמת 9: דוגמת 10: דוגמת 11: דוגמת 12:
DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99
F דוגמה 1: דוגמה 2: דוגמה 3: דוגמה 4: דוגמה 5: דוגמה 6: דוגמה 7: דוגמת 8: דוגמת 9: דוגמת 10: דוגמת 11: דוגמת 12:
DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99 DNA 1 מ"ל + מאגר מ ל 99
G
H

טבלה 2: דוגמה פריסה של 96-ובכן צלחת על כימות של dsDNA.

  1. לדלל כל מוצר מטוהרים (שהושג בשלב 3.2.5) עם H2O ל- 0.2 ng/µL.

4. רצף ספריית הכנה

  1. להתכונן מוגבר וטיהר הדנ א proviral המיתרים באמצעות הכנה ספריה של DNA המיתרים קיט (ראה טבלה של חומרים). בצע את הוראות היצרן עבור כל tagmentation, הגברה PCR, ניקיון [פרט לכך אמצעי האחסון התגובה כולל ה-DNA קלט (מתוך שלב 3.5) יכול להיות חצוי כדי להרחיב את השימוש בספריה הכנה ריאגנטים].
  2. לנרמל את ספריות באופן ידני באמצעות כימות ספריית הגדרות מבוסס qPCR קיט (ראה טבלה של חומרים) כדי לקבוע ריכוז provirus בודדים. לשלב ספריות provirus בודדים בכמויות equimolar כדי ריכוז סופי של 4 nM, או כפי שמוגדר על-ידי ספק השירות רצף.
    הערה: הפרוטוקול ניתן להשהות כאן ויאוחסנו במאגר הספריה ב-20 ° C.
  3. לכמת הספרייה במאגר הסופי באמצעות ערכת כמת dsDNA אותו בשימוש בשלב 3.4. בצע הוראות היצרן. לקבוע את אורך קטע הממוצע על-ידי הפעלת µL 1 של הספרייה במאגר במערכת ממוכנת אלקטרופורזה שימוש נאות של קיט (ראה את הטבלה של חומרים). השתמש הריכוז הממוצע שבר אורכי כדי לקבוע את molarity של הספרייה במאגר.
  4. לשלב 5 µL של הספרייה במאגר עם 5 µL של 0.2 N NaOH כדי denature את הספרייה. להוסיף 5 µL של 200 מ מ טריס-HCl כדי לנטרל. לדלל לספריה ו־12-5 בערב עם מאגר הכלאה צוננת (זמין עם ערכת הכנה ספריית דנ א) מייד לפני רצף הסופי.
  5. לבצע רצף לזווג-end נוקלאוטיד (nt) 2 x 150 על פלטפורמת המיתרים המתאימים (ראה טבלה של חומרים).
    הערה: כאשר ספריות proviral 96 אינדקס לכל הפעלה, זה מניב כ-20 מיליון קריאות סוף-לזווג לכל הפעלה או 200,000 קורא לכל ספריית provirus בודדים עבור ניתוח בעקבות מבטל את ריבוב. שלבים 4.4 ו- 4.5 מבוצעות בדרך כלל על ידי מתקן רצף.

5. דה נובו הרכבה של הפרו-וירוס HIV-1 ברצף

הערה: כדי להשיג את הרצף הגנטי של כל provirus מוגבר, contigs הם התאספו דה נובו מ קריאות לזווג-end. פלטפורמות רבות (למשל, CLC גנומיקה עבודה, שעליו מונחים14), מאפשרים את העיצוב של זרימות עבודה מותאמות אישית להרכבה de novo . תוכנות קוד פתוח אחרות כגון FastQC15, Trimmomatic16, Cutadapt17פלאש18 גם יכול להיות מנוצל עבור עיבוד קריאות, כמו גם כלים כגון Bowtie219 ו עלה20 עבור מיפוי קריאה ו- דה נובו הרכבה. השלבים עבור ההרכבה דה נובו של HIV-1 contigs באמצעות פלטפורמה מסחריים ספציפיים (ראה את הטבלה של חומרים) מתוארים להלן (איור 2). זרימת עבודה מותאמת אישית קובץ זמין על פי בקשה.

  1. ייבוא רצפים של בדיקת איכות: ייבוא הרצף לזווג קורא (בפורמט fastq.gz) לתוך התוכנה, אשר אז ישולבו כפי שנקבע אחת הקריאות לזווג. ליצור רצף ח QC, לבחון את איכות הנתונים שלך.
  2. בקרת איכות
    1. לבצע קיצוץ קריאה על פי הדו ח QC. להסיר כל מתאם רצפי נוקלאוטידים רב-משמעי. לקצץ 15 5' ו שני 3' מסוף נוקלאוטידים. ביטול קורא נוקלאוטידים פחות מ- 50 אורך. השתמש מגבלה האיכות המחמירים של 0.001 המתאים ציון phred QC של 30.
  3. מיזוג זוגות חופפים
    1. טופס יחיד קריאות מורחבים על-ידי מיזוג לזווג קדימה, להפוך קריאות עם אזורים חופפים.
  4. דה נובו הרכבה
    1. להשתמש את האסמבלר מקורית של דה נובו גנומיקה CLC עם word (או k-mer) בגודל של 30 nt וגודל הבועה המרבי של 65 nt להרכיב subsample אקראית של 10,000 קריאות לזווג שאינם חופפים. הכיסוי הצפוי עבור contig דה נובו התאספו הוא ~ 200 x לרצף ~ 9 kb.
      הערה: יצירת תת-דגימה זו יכול להפחית את הנטל חישובית כך מחשבים שולחניים רגילים ביותר יכול להתמודד עם מכלול של ניתוח, ונתן את clonality של כל provirus (ספריה אחת הוא אחד provirus), זה אינו מגביל את הגיוון.
  5. מיפוי מחדש של כל קורא ל- contigs
    1. כדי לקבל את רצף קונצנזוס הרוב הסופי של כל provirus, מיפוי קריאה מלאה לקבוע את contig דה נובו התאספו. לקבל רק contigs עם כיסוי ממוצע מינימלי של 1,000 x ולהבטיח שהאורך הסופי contig מתאים לגודל של הלהקה על הג'ל agarose המקורי (שלב 2.8.1). שמור את רצף קונצנזוס הרוב הסופית .fasta.
      הערה: רוב contigs יכול להיות התכנסו באמצעות השלבים לעיל. עם זאת, במקרים מסוימים, עבור provirus יחיד, contigs מרובים עם כיסוי דומים הם התאספו. בנסיבות אלה, contigs מיושרים ליד באורך מלא (~ 9 kb) רצף הסכמה של אותו משתתף, שהורכבו באופן ידני לתוך contig יחיד. כל קורא ממופים ואז contig באופן ידני שהורכב וקיבל הקונצנזוס הסופי אם הקריאה עיתוד אפילו במהלך ההרכבה לא יחיד נוקלאוטיד פולימורפיזמים (SNPs) > 40% נוכחים.
  6. בקרת איכות נוספת
    1. כדי להבטיח כל contig מייצג של provirus יחיד, ואינו ההגברה של הפרו-וירוס מרובות בתוך לבאר בודדת, מסך לקרוא כיסוי וקראו וריאנט של contig הסופית.
    2. בתבניות מרובות proviral נוכח במהלך ה-PCR מזוהים לעתים קרובות על ידי כיסוי קריאה מאוד לא אחידה (בגלל הגברה שיתוף של הפרו-וירוס בגדלים שונים) כאשר מיפוי קונצנזוס באורך מלא מהמשתתף אותו, או על ידי הנוכחות של SNPs עם התדירות של > 40% (ראה התוצאות נציג, איור 4). להתעלם אוכלוסיות מעורבות בניתוח עוקבות.
  7. יישור
    1. לייבא הקונצנזוס הסופי של כל רצף proviral רצף במלונות תוכנות כגון מולקולרית אבולוציונית גנטיקה ניתוח (מגה) 721. יישר כל רצף באופן ידני כדי שרצף הפניה HXB2. לקצץ 5' ומסתיים 3' למיקום 666-9650 של HXB2 כדי להסיר רצפים של פריימר.
    2. לייצא את רשימת רצף בתבנית fasta, ואז ליישר באמצעות MAFFT גרסה 722, עם עריכה ידנית במקומות המתאימים להשיג את היישור הסופי.
      הערה: אם לא יהיו מיושרות כל רצפי, תחילה להפוך משלים הרצף. אם הרצף עדיין לא מתיישבת לבצע חיפוש הפיצוץ כדי להבטיח הרצף HIV-1. זה אפשרי להגביר את אי-HIV-1 תבניות ואת אלה ניתן לזהות בשלב זה. אם רצפים HIV-1 אך לא יהיו מיושרות, שקול את הנוכחות של היפוכים (ראה שלב 6.1).

6. קביעת כשירות פוטנציאל שכפול הרצפים Proviral HIV-1

הערה: כדי לזהות רצפים של שלמים גנטית, ולא פוטנציאל שכפול-מוסמך, הפרו-וירוס HIV-1 שמחמירים השלילה היא בעקבות (איור 1C). רצפים proviral חסר היפוכים, מחיקות פנימי גדול, ברישול להפסיק codons / hypermutation, frameshift מוטציות, ו/או פגמים האות באתר או אריזה של MSD נחשבים ומתפקד פוטנציאל שכפול-כשיר מבחינה גנטית.

  1. היפוכים
    1. במהלך שלב יישור, לזהות היפוכים. היפוכים הם אזורים איפה הרצף אינו מיושר עם ההפניה HXB2 אלא אם האזור הוא הפוך המלווים.
      הערה: בהתאם ליישום של הנתונים, רצפים המכיל היפוכים ייתכן שתצטרך להיות מושמט משני ניתוח נוסף.
  2. מחיקות פנימי גדול
    1. לזהות את contigs עם מחיקות פנימי גדול (> 600 bp) בשלב יישור. אלא אם כן המחיקה יושב בתוך nef, ניתן להגדיר את הרצף כפגום.
      הערה: כל רצפי עם מחיקות פנימי < 600 bp תזוהה על-ידי חותך ג'ין (שלב 6.3.1) כבעל רצפי הגן לא שלם.
  3. Codons עצירה ברישול, frameshift מוטציות ומחיקה
    1. לבדוק את כל contigs של אורך > נוקלאוטידים 8400 לנוכחות של עצירה ברישול codons, frameshifts, רצפי הגן לא שלם באמצעות את לוס אלמוס הלאומית מעבדה HIV רצף מסד הנתונים ג'ין החותך כלי23.
      הערה: הכלי ג'ין קאטר מחלק את רצף proviral לתוך הגנים מחסום פה, פול פוט, ערנית, vpr, tat, rev, vpu, מעטפה, nef, ומתרגם אותם כדי חומצות אמינו. ג'ין חותך אז מסכי לנוכחות של עצירה codons, frameshift מוטציות (בגלל שהתוספות או המחיקות). Contigs המכילים עצירה codons או frameshifts בגן כלשהו, למעט nef24, מסווגים כפגום. ג'ין חותך גם מזהה רצפי הגן לא שלם ואת כל הפרו-וירוס עם מחיקה < 600 יכול להיות פלסטיניות פרטיות bp בגן שאינו nef כפגום עקב מחיקה פנימיים גדולים.
  4. Hypermutation
    1. ליצור קונצנזוס של הרצף הנותרים proviral באורך מלא באמצעות לוס אלמוס הלאומית מעבדה HIV רצף מסד הנתונים קונצנזוס יצרנית כלי (maker פשוטה הקונצנזוס)25. הוסף את רצף קונצנזוס לחלק העליון של ישור המכיל רק את הנותרים באורך מלא proviral רצפים. באמצעות יישור זה כלי לוס אלמוס המעבדה הלאומית HIV רצף Hypermut מסד נתונים26 כדי לזהות APOBEC-induced hypermutation G-A ברצף proviral באורך מלא הנותרים.
  5. פגמים MSD ושידור אריזה
    1. לבדוק כל אחד contigs הנותרים פגמים של MSD, האות אריזה (אזור HXB2 670-810), ההופכים את רצף proviral פגום4. חפש מוטציה באתר MSD (רצף GT, HXB2 744-745) או כל מחיקה בארבעת גזע לולאות של האות אריזה (SL1 (HXB2 691-734), SL2 SL3 (HXB2 736-754), (HXB2 766-779), ו- SL4 (HXB2 790-810)).

Representative Results

וזמינותו סלטות מגביר, רצף יחיד, ליד הפרו-וירוס HIV-1 באורך מלא. הפרוטוקול כרוך 6 צעדים כדי להשיג ליד רצפים proviral באורך מלא. השלבים הבאים כוללים: פירוק של תאים, PCR מקוננים באורך מלא (שלמים ולא פגומה) HIV-1 הפרו-וירוס, טיהור DNA, כימות, קביעת רצף ספריית הכנה, המיתרים, נגוע, דה נובו הרכבה של וסודרו הפרו-וירוס. בסוף כל שלב יכול להיחשב מחסום שבו האיכות של המוצר (למשל הוגדל DNA, DNA מטוהרים, רצף ספריה או רצף) יכול להיות מוערך לפני השלב הבא. סקירה כללית של המבדק הופיעה בסוף כל שלב, התוצאות הצפויות המותווה להלן.

בעקבות PCR מקוננים, מוצרים מוגבר מופעלים על 1% agarose ג'ל (איור 3). איכות הראשונית ה-PCR יכול להיקבע על ידי ביקורת הפקדים שליליים או חיוביים. בקרה שלילית בארות המכיל מוצר מוגבר להצביע על זיהום ולציין בארות בקרה חיובית חסר של מוצר מוגבר הגברה לא מספיקות. בשלב הבא, בארות המכיל מוצר מוגבר שנבחרו עבור רצף. כדי להימנע בארות המכילים תערובות של הפרו-וירוס מוגבר מרובים, רק בארות המכיל מוצר מוגבר רצים מובילים דילול נחשבים עבור רצף. על-פי התפלגות פואסון, דילול מובילים נמצא כאשר 30% של בארות הן חיוביות עבור מוצר מוגבר. בשלב זה דילול, יש 80% סיכוי הבארות הללו מכילים provirus מוגבר של יחיד. בנוסף, ניתן לאבחן בארות המכיל הפרו-וירוס מוגבר מרובים באורכים שונים בשלב זה כמו להקות מרובים יופיעו על הג'ל. לא צריך להיות נבחרה הבארות הללו עבור קביעת רצף (איור 3).

בעקבות טיהור של מוגבר הפרו-וירוס שנבחר עבור רצף, כימות מבטיחה שום דנ א proviral אובדים במהלך שלב טיהור. אם ריכוז הדנ א provirus מוגבר < 0.2 ng/µL, המדגם הנותרים ב PCR2 הצלחת יכול להיטהר. מחסום דומה מתרחש בעקבות הכנה הספרייה, שבו כל ספריה בודדים לכמת. פעולה זו מבטיחה הפרו-וירוס בודדים יש כבר דוקטור מפוצלים, מתויג, מוגבר לפני רצף. ספריות proviral בודדים הם איחדו בכמויות equimolar כדי ריכוז ספריית הסופי של 4 nM (או כפי שמוגדר על ידי המתווכת רצף). אם הריכוז של ספריית proviral בודדים הוא נמוך מדי, זה יכול ייכללו ממאגר ספריית רצף או הספרייה הפרט מוכן שוב. בדיקה אחרונה של הריכוז של הספרייה במאגר מבוצע לפני רצף יחד עם המאשרת את אורך קטע הממוצע.

פעולות בקרת איכות לפני השלב הרכבה דה נובו מבטיחה את האיכות הקריאות נהגו להרכיב את contig proviral הסופי. השלבים הבאים כוללים: הסרה של מתאם רצפים, קיצוץ של 5' ו- 3' נוקלאוטידים, מגבלה האיכות המחמירים, ועל התעלמות קריאות קצרות. CLC גנומיקה עבודה, שעליו מונחים יכול לספק דוחות בקרת איכות יכול לשמש לפני כדי להעריך את איכות הראשונית של קריאות, מדריך זמירה הגדרות, ולאחר מכן לאחר כדי לקבוע אם הגזם היה מספיק כדי להסיר אזורים באיכות נמוכה. בנוסף, להרכבה דה נובו , איכות contigs התאספו יכול להיות מוערך על עומק מספיק (> 1000 X), שויון של כיסוי (איור 4A). ניתן גם לזהות אוכלוסיות מעורבות בשלב זה. תערובות של הפרו-וירוס באורך מלא (~ 9 kb) מרובות מזוהים באמצעות הנוכחות של SNPs מרובים עם תדירות של יותר מ-40%, ואילו תערובות של קצר (מכיל פעולת מחיקה פנימי גדול), הפרו-וירוס באורך מלא יכול להיות מזוהה על ידי לא אחיד לקרוא סיקור בעקבות מיפוי הפניה באורך מלא מהמשתתף אותו (איור 4B).

בהתאם ליישום, היישור הסופי, ניתן לאבחן באמצעות כלים כגון ggtree זמינים כחבילה "r: A שפה וסביבה עבור מחשוב סטטיסטי"27. במחקר שנערך לאחרונה, סלטות היה מנוצל כדי רצף HIV-1 הפרו-וירוס מהזיכרון תמימה, המרכזי, המעבר, ו אפקטור CD4+ T תאים מבודדים מאנשים על אמנות לטווח ארוך, במטרה לזהות אם קבוצות משנה לתא מסוים הראה גבוה יותר הפרופורציות של שלמים גנטית ולא כשיר פוטנציאל שכפול HIV-12. . הנה, ייצוג חזותי של הרצף מבודד משתתף אחד של מחקר זה (משתתפת 2026) מוצג (איור 5). המשתתף, הרוב (97%) של רצפי היו פגומים, עם רצפי שלמים שנמצאו אפקטור וזיכרון המעבר CD4+ T תאים. כלי ויזואליזציה זה שימושי עבור מציג את מספר רצפי עם מחיקות פנימי גדול ומיקומם הגנום. זה יכול להיות מוערת בהמשך כדי לציין רצפים עם עצירה ברישול codons, frameshift מוטציות מחיקות/מוטציות MSD האתר ו/או אריזה אות.

אחד היישומים של וזמינותו סלטות הוא הזיהוי של שלמים גנטית ולא כשיר פוטנציאל שכפול HIV-1 הפרו-וירוס. במחקר שנערך לאחרונה של רצפי 531 מבודד CD4+ T תאים 6 המשתתפים על אמנות לטווח ארוך, 26 (5%) שלמים גנטית HIV-1 הפרו-וירוס היו מזוהה2. הפרו-וירוס נותרת פגומה כלל אלה עם היפוך רצפים (6%), מחיקות פנימי גדול (68 אחוז), עצירה ברישול codons/hypermutation (9%), frameshift מוטציות (1%) פגמים אריזה האות ו/או מוטציות באתר MSD (11%) .

Figure 2
איור 2: סקירה של זרימת עבודה עבור דה נובו הרכבה של הפרו-וירוס HIV-1. השלבים העיקריים בתהליך העבודה כוללים: 1) רצף לקרוא בקרת איכות, 2) מיזוג זוגות חופפים, 3) דה נובו הרכבה ולאחר 4) מיפוי בניין הקונצנזוס היו בצבע אדום, כחול, ירוק וכתום, בהתאמה. דמות זו שונתה מ. Hiener et al. 2 . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: דוגמה ג'ל agarose של ה-PCR מוגבר הפרו-וירוס HIV-1- וולס 1, 2, 3, 6, 9 ו-10 מכילים מוגבר הפרו-וירוס HIV-1. 10 טוב מכיל את provirus עם מחיקה פנימי גדול, 2 טוב מכיל הגברה משותף של שני הפרו-וירוס HIV-1 באורכים שונים (תערובת) ומכיל 12 ובכן בקרה חיובית. הערה האחוזים של בארות המכיל מוצר מוגבר הוא 60%, הנמצא מעל האחוז הנדרש כדי לבודד תבניות יחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: דוגמה פלט של מיפוי קריאה. דוגמה (A) הוכחת אפילו כיסוי עקב ההגברה של provirus HIV-1 באורך מלא יחיד. בעקבות הרכבה דה נובו , ימופו כל קורא contig התאספו כדי לייצר רצף קונצנזוס. פלטפורמת תוכנה מאפשר את קריאות ממופה שייבדקו מספיק ואפילו כיסוי. דוגמה (B) הוכחת שיתוף הגברה של שני הפרו-וירוס HIV-1 באורכים שונים (תערובת). כדי לקבוע תערובות, קריאות הן למפות רצף ההתייחסות באורך מלא (~ 9 kb) מהמשתתף אותו וקרא מיפוי בדק. הנוכחות של כיסוי לא אחיד מציין תערובת. איור זה מתרבה באישור Qiagen14. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: דוגמה ויזואליזציה של HIV-1 רצפים proviral מבודד CD4+ T תא קבוצות משנה של הפרט על אמנות לטווח ארוך. בודדים HIV-1 רצפים proviral מיוצגים על ידי קווים אופקיים. דמות זו שונתה מ. Hiener et al. 2 . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

סלטות וזמינותו היא שיטה תפוקה גבוהה ויעילה עבור הגברה, רצף יחיד, ליד הפרו-וירוס HIV-1 באורך מלא. גורמים רבים, צעדים קריטיים בפרוטוקול המשפיעים בהתאם למספר ואיכות של הרצף שהושג זוהו. ראשית, מספר התאים ותדירות זיהום ב- HIV-1 של האוכלוסייה תא להשפיע על המספר של הפרו-וירוס מוגבר. לדוגמה, בפרסום הקודם, רצפים רבים חצי לערך, התקבלו מספר זהה של תמים CD4+ T תאים בהשוואה אפקטור זיכרון CD4+ T תאים. זאת משום תמים תאים בדרך כלל יש תדירות זיהום נמוכה יותר מאשר תאי זיכרון אפקטור2. שנית, פירוק תאים עדיפה על עמודה מבוססי החילוץ שיטות לקבלת דנ א גנומי כפי אין סיכון של איבוד DNA בתהליך החילוץ. לבסוף, כמו כל assay מבוססי ה-PCR, מניעת זיהום הוא קריטי. אזורים נקיים מופרדים צריך להיקרא להכנת תערובות מאסטר, טיפול ה-DNA גנומי, הוספת פקדים חיובית, טיהור DNA כימות ואת ספריית הכנה. זה חשוב במיוחד עבור מבחני עותק יחיד כמו זה המוצג כאן.

מימוש וזמינותו סלטות לכלול תחילה להפעיל פקד חיוביים כגון pNL4-3 פלסמידים ולא משתתף דגימות. זה יאפשר לכל מראש לפתרון בעיות לשימוש של תאים חיוביים HIV-1, כפי הרצפים שהתקבלו ניתן להשוות רצפים הפניה זמין עבור פלסמידים אלה. בעת שימוש תאים חיוביים HIV-1, חשוב לשקול את סוג המשנה של HIV-1 (primers המיועדות סלטות הספציפיים סוג B) ותדירות זיהום של האוכלוסייה תא אם מעט לא הפרו-וירוס הם מוגבר. רצפים פריימר יכול להיות שונה/מחדש כדי להתאים את תתי סוגים אחרים. בנוסף, טוב המכיל פקד חיובי צריכים להיכלל בכל PCR שבוצעה.

סלטות יש להתגבר על המגבלות של מבחני רצף קודמות, לרבות SPS. באמצעות הגברה ורצף ליד הפרו-וירוס HIV-1 באורך מלא, סלטות ניתן לקבוע את כשירות-השכפול פוטנציאלי של הפרו-וירוס HIV-1. זה לא היה אפשרי באמצעות SPS, אשר וסודרו רק אזורים תת-גנומית ונבחר לכן רצפי עם אתרי קישור פריימר ללא פגע. יתר על כן, סלטות מתגבר על המגבלות הקשורות ניצול מרובים הגברה, רצף תחל כפי הועסק על ידי הקודם רצף באורך מלא מבחני1,4. דרך שני סיבובים של PCR פילוח אזורי HIV-1 LTR בשילוב עם הגדרות, סלטות מקטין את מספר ואת המורכבות של צבעי יסוד הנדרש. הטלות ולכן פחות רגישים ההשלכות של פריימר אי-התאמות, כלומר זיהוי שגוי של הפרו-וירוס פגומה וחוסר יכולת להגביר קצת הפרו-וירוס בתוך אוכלוסיה. פרוטוקול סלטות גם יעיל יותר ומאפשר תפוקה גבוהה יותר של רצף מאשר שיטות קודמות.

אין ספק, סלטות מספק יתרונות על פני שיטות קיימות אשר קובעים את ההרכב הגנטי של HIV-1 הפרו-וירוס.... עם זאת, חשוב להכיר את המגבלות של סלטות. ראשית, וזמינותו סלטות לא פותחה ככלי למדידת גודל המאגר HIV-1 סמויה, כמו ניתוח כדי לקבוע אם סלטות מגביר את כל provirus HIV-1 נוכח אוכלוסיה תא שלא הושלמו. סלטות שימושית במקום ביצוע השוואות היחסי של ההרכב של המאגר בין אוכלוסיות תאים שונים2. שנית, השכפול-כשירות של שלם הפרו-וירוס HIV-1 לא ניתן לקבוע בוודאות. בלי ניתוחים ויוו , כגון אלה המבוצעות על ידי הו. et al. 4. שלישית, סלטות לא נועד לקבוע האתר אינטגרציה של הפרו-וירוס HIV-1.

הבדלים קלים בפרוטוקול סלטות באפשרותך להגביר את היישום שלה. לדוגמה, שינויים פריימר רצפים יכול לאפשר שונים ובסוגי HIV-1 מרובים להיות מוגבר ולא רציף. רצף של פלזמה HIV-1 virions אפשרי באמצעות התוספת של סינתזה cDNA לפני ה-PCR מקוננים. ניצול עתידי של מולקולה בודדת רצף שיטות יבטל את הצורך דה נובו הרכבה.

רצף גנטי של הפרו-וירוס HIV-1 משולב הגבירה את ההבנה שלנו של המאגר HIV-1 סמויה. סלטות היא כלי חשוב עבור מחקרים עתידיים שחקרתי את הרכב ופיזור של המאגר סמויה. עם זאת, היישום של סלטות באפשרותך להרחיב מעבר המאגר. מחקרים עתידיים עשויים לנצל הטלות כדי לקבוע מטרות מסוים לטכנולוגיה CRISPR-Cas, או לסייע בזיהוי של קידוד ואזורים ללא קידוד ההופכים את הווירוס קשובים יותר השהיה היפוך סוכנים. רקומבינציה ויראלי כפי שניתן להבין טוב יותר על ידי הסתכלות על האתרים צומת של מחיקות פנימיים גדולים.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה דלייני איידס המחקר של הארגון (האתגר) כדי למצוא תרופה (1U19AI096109 ו- 1UM1AI126611-01); amfAR קונסורציום מחקר ב- HIV מיגור (ARCHE) מענק מחקר שיתופי של הקרן לחקר האיידס (amfAR 108074-50-RGRL); מרכז אוסטרלי HIV ומחקר וירולוגיה הפטיטיס (ACH2); מרכז קליפורניה בסן פרנסיסקו-GIVI לחקר האיידס (P30 AI027763); הבריאות הלאומי האוסטרלי ואת מועצת המחקר הרפואי (AAP1061681). ברצוננו להודות ד ר ג'ואי לאי גנומיקה מנהל מתקן במכון Westmead למחקר רפואי את הכשרתו ספריית הכנה ושימוש המיומנות שלו, המרכז Ramaciotti גנומיקה (אוניברסיטת של ניו סאות וויילס, סידני, אוסטרליה) לביצוע רצף. אנו להכיר בהכרת המשתתפים שתרמה דגימות במחקר זה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 Invitrogen 15568025 Dilute to 5 mM for nested PCR
Nonidet P 40 Substitute solution Sigma 98379
Tween-20 Sigma P9416
Proteinase K Solution (20 mg/mL) Promega AM2548
96 well thermocycler Any 96 well thermocycler can be used
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304011
10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] Invitrogen 11304011
50 mM MgSO4 Invitrogen 11304011
PCR Nucleotide Mix, 10 mM Promega C1141
Ultrapure H2O Invitrogen 10977023
PCR1 and PCR2 Primers Desalted. Dilute to (100 µM) with H2O
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear Axygen PCR-96M2-HS-C
Microseal 'B' Adhesive Seals BioRad MSB1001 Required to seal 96 well PCR plates
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). Diluted to 105 copies/mL and used as positive control
PCR plate spinner or benchtop centrifuge
E-GEL 48 1% Agarose Invitrogen G800801 Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide.
DirectLoad Wide Range DNA Marker Sigma D7058 Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Mother E-Base device Invitrogen EBM03 Required for running precast 48 well 1% agarose gels
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used
PlateMax Peelable Heat Sealing Axygen HS-200 Heat sealing film for long term storage
96 Well 0.8 mL Storage Plate ThermoFisher Scientific AB0765 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) Beckman Coulter A63880 Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology Sigma E7023
Magnetic Stand-96 Invitrogen AM10027
Microplate shaker Optional
Buffer EB Qiagen 19086 Elution buffer
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496 A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
Microplate reader
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-2001
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Biorad HSP9601 Required for Nextera XT DNA library preparation kit
Library Quantification Kit - Illumina/Universal Kapa Biosystems KK4824 Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)
2100 Bioanalyzer Agilent Technology Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit
High Sensistivty DNA kit Agilent Technology 5067-4626
Illumina MiSeq Platform Illumina

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruner, K. M., et al. Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection. Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).
  2. Hiener, B., et al. Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants. Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).
  3. Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication. Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).
  4. Ho, Y. C., et al. Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure. Cell. 155 (3), 540-551 (2013).
  5. Harris, R. S., et al. DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection. Cell. 113 (6), 803-809 (2003).
  6. Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein. Science. 300 (5622), 1112 (2003).
  7. Chun, T. W., et al. Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication. AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).
  8. Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).
  9. Soriano-Sarabia, N., et al. Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells. Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).
  10. Josefsson, L., et al. The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).
  11. Evering, T. H., et al. Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection. Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506 (2012).
  12. von Stockenstrom, S., et al. Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy. Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).
  13. Palmer, S., et al. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).
  14. Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from: https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench (2018).
  15. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  16. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  17. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), (2011).
  18. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  19. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  20. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
  21. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  22. Katoh, K., Standley, D. M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).
  23. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html (2018).
  24. Foster, J. L., Garcia, J. V. Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis. Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).
  25. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html (2018).
  26. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html (2018).
  27. Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data. Methods in Ecology and Evolution. , (2016).

Tags

גנטיקה בעיה 140 הדור הבא רצף HIV-1 HIV הפרו-וירוס יחיד-proviral רצף HIV-DNA השהיית שכפול-כשירות טיפול תרופתי מאגר איידס HIV משולב
הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh,… More

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh, B. A., Palmer, S. Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58016, doi:10.3791/58016 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter