Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए निकट पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 वायरस के प्रवर्धन

Published: October 16, 2018 doi: 10.3791/58016
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Virus Research, The Westmead Institute for Medical Research, University of Sydney

Summary

पूर्ण लंबाई व्यक्तिगत वायरल अनुक्रमण (फ्लिप्स) पूर्ण लंबाई के निकट (बरकरार और दोषपूर्ण) एचआईवी-1 वायरस के प्रवर्धन और अनुक्रमण के लिए एक कुशल और उच्च प्रवाह विधि प्रदान करता है और उनकी क्षमता के निर्धारण के लिए अनुमति देता है प्रतिकृति-योग्यता । फ्लिप्स पिछले परख अव्यक्त एचआईवी अनुक्रम-1 जलाशय डिजाइन की सीमाओं पर काबू पा जाता है ।

Abstract

पूर्ण लंबाई व्यक्तिगत वायरल अनुक्रमण (फ्लिप्स) परख एक कुशल और उच्च प्रवाह को बढ़ाना और अनुक्रम एकल, पूर्ण लंबाई के पास (बरकरार है और दोषपूर्ण), एचआईवी-1 वायरस के पास डिजाइन विधि है । फ्लिप एक सेल जनसंख्या के भीतर एकीकृत एचआईवी-1 के आनुवंशिक संरचना का निर्धारण की अनुमति देता है । एचआईवी के भीतर दोषों की पहचान के माध्यम से-1 वायरल अनुक्रम है कि रिवर्स प्रतिलेखन के दौरान उठता है, ऐसे बड़े आंतरिक विलोपन के रूप में, बचके stop codons/hypermutation, frameshift उत्परिवर्तनों, और उत्परिवर्तनों/सीआईएस में विलोपन अभिनय तत्वों की आवश्यकता विरिअन परिपक्वता के लिए, फ्लिप्स प्रतिकृति के अक्षम एकीकृत वायरसों की पहचान कर सकते हैं । फ्लिप परख एचआईवी की पहचान करने के लिए उपयोग किया जा सकता है-1 वायरस है कि इन दोषों की कमी है और इसलिए संभावित प्रतिकृति सक्षम । फ्लिप्स प्रोटोकॉल शामिल हैं: एचआईवी के lysis-1 संक्रमित कोशिकाओं, निकट पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 वायरस (एचआईवी-१ ५ ' और 3 ' लीटर), डीएनए शुद्धिकरण और ठहराव, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय तैयारी (NGS), NGS, के लिए लक्षित प्राइमरों के नेस्टेड पीसीआर का उपयोग de नोवो असेंबली के वायरल contigs, और प्रतिकृति सक्षम वायरस की पहचान करने के लिए उंमूलन की एक सरल प्रक्रिया । फ्लिप्स पारंपरिक ऐसे एकल-वायरल अनुक्रमण के रूप में एचआईवी-1 वायरस, अनुक्रम के लिए डिजाइन तरीकों पर लाभ प्रदान करता है । प्रवर्धक और पूर्ण लंबाई के पास जुगाड़ के पास reviews प्रतिकृति क्षमता को सक्षम करने के लिए निर्धारित किया जाना है, और भी कम प्रवर्धन प्राइमरों का उपयोग करता है, प्राइमर बेमेल के परिणामों को रोकने । फ्लिप्स एकीकृत एचआईवी के आनुवंशिक परिदृश्य को समझने के लिए एक उपयोगी उपकरण है, विशेष रूप से अव्यक्त जलाशय के भीतर 1 वायरस, तथापि, इसके उपयोग किसी भी आवेदन जिसमें एकीकृत एचआईवी की आनुवंशिक संरचना-1 की आवश्यकता है के लिए विस्तार कर सकते हैं ।

Introduction

अव्यक्त एचआईवी के आनुवंशिक लक्षण-1 जलाशय, जो दीर्घकालिक एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (कला) पर व्यक्तियों में बनी हुई है समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि एकीकृत वायरस के बहुमत दोषपूर्ण और प्रतिकृति हैं-अक्षम1 , 2. रिवर्स प्रतिलेखन की प्रक्रिया के दौरान, त्रुटियों को एकीकृत वायरल अनुक्रम में पेश कर रहे हैं । कुछ तंत्र है कि दोषपूर्ण वायरल अनुक्रम उत्पंन त्रुटि प्रवण एचआईवी-1 रिवर्स transcriptase एंजाइम3, टेंपलेट4स्विचन, और/या APOBEC-प्रेरित hypermutation5,6शामिल हैं । दो हाल के अध्ययनों से पता चला है कि लगभग एचआईवी के 5%-1 दीर्घकालिक कला पर व्यक्तियों से अलग वायरस आनुवंशिक रूप से बरकरार हैं, और संभावित प्रतिकृति-सक्षम है, और तेजी से खुशहाली लौटने लगी एचआईवी में योगदान कर सकते है-कला की समाप्ति पर 1 प्लाज्मा स्तर 1 , 2 , 7. पिछले अध्ययनों की पहचान की है कि प्रतिकृति सक्षम एचआईवी-1 वायरस भोली और आराम स्मृति CD4+ टी सेल सबसेट में जारी रहती है (केंद्रीय, संक्रमणकालीन और प्रभाव स्मृति टी कोशिकाओं सहित), के महत्व का संकेत भविष्य उंमूलन रणनीतियों2,8,9में इन कोशिकाओं को लक्षित ।

वितरण, गतिशीलता और अव्यक्त एचआईवी-1 जलाशय के रखरखाव में प्रारंभिक अंतर्दृष्टि एकल-वायरल sequencing (एसपीएस) तरीकों कि आनुवंशिक रूप से उप-जीनोमिक क्षेत्रों एचआईवी-1 जीनोम10 की विशेषताएं के उपयोग के माध्यम से प्राप्त किया गया ,११,१२,१३. एसपीएस एक बहुमुखी उपकरण है, एक एकल संक्रमित कोशिका के भीतर से एक एकल एचआईवी-1 वायरस अनुक्रम में सक्षम है । हालांकि, एसपीएस प्रतिकृति-की क्षमता का निर्धारण करने में असमर्थ है, क्योंकि यह केवल उप जीनोमिक क्षेत्रों अनुक्रम और याद करते है कि प्राइमर बंधन साइटों के भीतर बड़े विलोपन शामिल है । एक पिछले अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि एसपीएस 13-से 17-के लिए सक्षम जलाशय के आकार का अनुमान है चुनिंदा अनुक्रमण बरकरार उप जीनोमिक क्षेत्रों2के माध्यम से गुना ।

एसपीएस की सीमाओं का पता करने के लिए, हो एट अल । 4 और ब्रूनर एट अल. 1 पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 वायरस के पास अनुक्रम को परख विकसित की है । यह आनुवंशिक रूप से बरकरार की आवृत्ति की अनुमति दी, और संभावित प्रतिकृति-सक्षम, एचआईवी-1 दीर्घकालिक कला पर व्यक्तियों में वायरस निर्धारित किया जाना है । इन परख प्रवर्धित और (सैंज अनुक्रमण के द्वारा) उप जीनोमिक क्षेत्रों है कि तो (बरकरार या दोषपूर्ण) एचआईवी-1 वायरस के एक अनुक्रम प्राप्त इकट्ठे हुए थे अनुक्रम । इस दृष्टिकोण की तीन सीमाएं हैं: 1) कई sequencing प्राइमरों का उपयोग अनजाने में वायरल अनुक्रम में दोष शुरू करने का खतरा बढ़ जाता है, 2) प्राइमर बेमेल विशेष रूप से वायरस के प्रवर्धन को रोका जा सकता है, और 3) अक्सर पूरे वायरल अनुक्रम इन तरीकों की तकनीकी के कारण हल नहीं किया जा सकता है ।

मौजूदा पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 वायरल अनुक्रमण परख की सीमाओं को दूर करने के लिए, हम एफull-Length मैंndividual पीroviral एसequencing (फ्लिप्स) परख विकसित की है । फ्लिप्स एक उच्च प्रवाह और कुशल तरीके से पूर्ण लंबाई (बरकरार या दोषपूर्ण) एचआईवी-1 के पास परिवर्धित और दृश्यों जो प्रवर्धक और एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS)-आधारित परख है । फ्लिप्स पिछले परख पर लाभ प्रदान करता है, के रूप में यह उपयोग प्राइमरों की संख्या सीमा; इसलिए, यह प्राइमर बेमेल है, जो की आबादी को सीमित कर सकते है की संभावना कम हो जाती है पर कब्जा कर लिया या अनजाने में एक वायरल अनुक्रम में दोषों का परिचय । फ्लिप्स भी कम तकनीकी तौर पर पिछले परख से चुनौतीपूर्ण है और 6 मुख्य कदम शामिल है: 1) एचआईवी के lysis-1 संक्रमित कोशिकाओं, 2) एकल एचआईवी के प्रवर्धन-1 नेस्टेड पीसीआर के माध्यम से वायरस अत्यधिक संरक्षित के लिए विशिष्ट प्राइमरी का उपयोग कर सीमित पर प्रदर्शन किया एचआईवी-१ ५ ' और 3 ' U5 बाएं से दाएं क्षेत्र (आंकड़ा 1a), 3) शुद्धि और प्रवर्धित उत्पादों के ठहराव, 4) NGS के लिए प्रवर्धित वायरस के पुस्तकालय की तैयारी, 5) NGS, और 6) के लिए प्रत्येक के contigs प्राप्त करने के लिए sequenced वायरस के de नोवो असेंबली व्यक्तिगत वायरस ।

फ्लिप द्वारा उत्पंन अनुक्रम उन्मूलन के एक कड़े प्रक्रिया से गुजरना कर सकते है जो उन की पहचान करने के लिए जो आनुवंशिक रूप से बरकरार है और संभावित प्रतिकृति-सक्षम (चित्रा 1C)2। आनुवंशिक रूप से बरकरार है, जो एक प्रतिकृति अक्षम वायरस की पीढ़ी में परिणाम सभी ज्ञात दोषों की कमी है । इन दोषों में शामिल हैं: उलटा दृश्यों, बड़े आंतरिक विलोपन, hypermutation/बचके रोक codons, frameshifts, या 5 ' पैकेजिंग संकेत या प्रमुख ब्याह दाता (एमएसडी) साइट में उत्परिवर्तनों ।

Figure 1
चित्रा 1: पूर्ण लंबाई व्यक्तिगत वायरल अनुक्रमण में महत्वपूर्ण कदम (फ्लिप्स) परख । (क) एचआईवी-1 में प्राइमर बाध्यकारी साइटों के साथ डीएनए जीनोम ' और 3 ' U5 लीटर फ्लिप द्वारा इस्तेमाल के लिए पूरी लंबाई के पास बढ़ाना (दोषपूर्ण और बरकरार) एचआईवी-1 वायरस नेस्टेड पीसीआर के माध्यम से । (ख) एक ९६-well पीसीआर प्लेट का लेआउट ८० नमूना कुओं (प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए 20 कुओं), 4 नकारात्मक नियंत्रण कुओं, और 1 सकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से युक्त । (ग) आनुवंशिक रूप से बरकरार की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया उंमूलन की प्रक्रिया, और संभावित प्रतिकृति-सक्षम, एचआईवी-1 वायरस । यह आंकड़ा Hiener एट अल से संशोधित किया गया है । 2 . कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Protocol

सभी विधियां यहां वर्णित कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के सैन फ्रांसिस्को और पश्चिमी सिडनी स्थानीय स्वास्थ्य जिला है, जो चिकित्सा अनुसंधान के लिए Westmead संस्थान में शामिल है पर संस्थागत समीक्षा बोर्डों द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. एचआईवी-1-संक्रमित कोशिकाओं के Lysis

नोट: कोशिकाओं परिधीय रक्त, leukapheresis नमूने, अस्थि मज्जा बायोप्सी, या ऊतक बायोप्सी से अलग किया जा सकता है । सेल आबादी प्रतिदीप्ति सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) का उपयोग कर हल किया जा सकता है.

  1. 10 मिमी Tris-एचसीएल, ०.५% Nonidet पी-४०, ०.५% के बीच-20, और ०.३ मिलीग्राम/एमएल proteinase K युक्त एक lysis बफर तैयार करें । एक सेल गोली करने के लिए, 1 x 106 कोशिकाओं के प्रति lysis बफर के १०० µ एल जोड़ें । पिपेट ऊपर और नीचे मिश्रण करने के लिए । 1 घंटे के लिए ५५ ° c पर मशीन 15 मिनट के लिए ८५ डिग्री सेल्सियस के बाद के लिए कोशिकाओं को लाइसे और पीसीआर प्रवर्धन के लिए जीनोमिक डीएनए जारी ।
    नोट: सेल lysis प्रवर्धन के लिए जीनोमिक डीएनए प्राप्त करने के लिए पर्याप्त है । कोई डीएनए अलगाव या शुद्धि की आवश्यकता है । प्रोटोकॉल इस बिंदु पर रोका जा सकता है और जीनोमिक डीएनए-20 डिग्री सेल्सियस अनिश्चित काल तक संग्रहित किया जा सकता है ।

2. नेस्टेड पीसीआर के माध्यम से एकल एचआईवी-1 डीएनए वायरस का प्रवर्धन

  1. प्रथम राउंड पीसीआर (PCR1) 1 तालिका में सूचीबद्ध के लिए रिएजेंट मिश्रण ( सामग्री की तालिकादेखें) । जोड़ें ३८ µ मास्टर मिश्रण के एल ८५ कुओं (८० नमूनों, 4 नकारात्मक नियंत्रण, 1 सकारात्मक नियंत्रण) के एक ९६-well पीसीआर प्लेट ( चित्र 1bमें लेआउट का पालन करें) । इस थाली ' PCR1 ' नामित ।
अभिकर्मक अंतिम एकाग्रता PCR1 प्लेट के लिए वॉल्यूम (µ l) PCR2 प्लेट के लिए वॉल्यूम (µ l)
फॉरवर्ड प्राइमर 1 µ m ३२.३ २३.८
रिवर्स प्राइमर 1 µ m ३२.३ २३.८
बफर (10x) 1x ३२३ २३८
MgSO4 (५० मिमी) 2 मिमी १२९.२ ९५.२
dNTP (10 मिमी) ०.२ एमएम ६४.६ ४७.६
DNA पोलीमरेज़ (5 U/µ l) ०.०२५ यू/µ एल १६.२ ११.९
Ultrapure एच२ओ २६३२.५ १९३९.७

तालिका 1: रिएजेंट और पीसीआर मास्टर के लिए खंड घोला जा सकता है ।

नोट: PCR1 के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों हैं:
BLOuterF: ५ '-AAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAG-३ ' (HXB2 वरून 623-649)
BLOuterR: ५ '-TGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGTC-३ ' (HXB2 वरून 9662-9686)

  1. मास्टर मिश्रण तैयार करने के बाद, जीनोमिक डीएनए के अलावा के लिए नामित एक स्वच्छ क्षेत्र के लिए PCR1 प्लेट ले जाएँ.
    1. प्रश्नपत्र पतला जीनोमिक डीएनए 1:3 से 1:81 Tris-एचसीएल (5 मिमी, पीएच 8) के साथ, प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए ४५ µ एल की तैयारी (प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए 20 कुओं के लिए पर्याप्त) । एक नमूना अच्छी तरह से पतला जीनोमिक डीएनए के 2 µ एल जोड़ें और Tris-एचसीएल के 2 µ एल (5 मिमी, पीएच 8) के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से ( चित्र 1bमें लेआउट का पालन करें) । PCR1 प्लेट के सभी कुओं सील, अच्छी तरह से सकारात्मक नियंत्रण को छोड़कर, एक स्पष्ट चिपकने वाला सील का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
      नोट: उपर्युक्त कमजोर पड़ने की सिफारिश की अंत बिंदु कमजोर पड़ने का निर्धारण करने के लिए एक प्रारंभिक गाइड के रूप में ही सेवा । कमजोर पड़ने के नमूनों के भीतर एकीकृत एचआईवी-1 डीएनए की एकाग्रता पर निर्भर करेगा ।
  2. एक सकारात्मक नियंत्रण के अलावा के लिए नामित क्षेत्र में ले जाएं । सकारात्मक नियंत्रण के 2 µ एल जोड़ें (pNL4-3 पतला करने के लिए 105 प्रतियां/µ l) PCR1 प्लेट की अच्छी तरह से सकारात्मक नियंत्रण करने के लिए और प्लेट सील. संक्षेप में PCR1 प्लेट एक पीसीआर प्लेट स्पिनर में स्पिन या केंद्रापसारक (४०० x g 10 एस के लिए कमरे के तापमान पर) कुओं के किनारों से किसी भी अवशिष्ट सामग्री को नीचे खींचने के लिए ।
  3. एक thermocycler में PCR1 प्लेट भागो: 2 मिनट के लिए ९४ ° c; फिर 30 एस के लिए ९४ ° c, 30 एस के लिए ६४ ° c, 3 चक्र के लिए 10 मिनट के लिए ६८ ° c; 30 s के लिए ९४ ° c, ६१ ° c के लिए 30 s, ६८ ° c 3 चक्र के लिए 10 मिनट के लिए; 30 s के लिए ९४ ° c, ५८ ° c के लिए 30 s, ६८ ° c 3 चक्र के लिए 10 मिनट के लिए; 30 एस के लिए ९४ ° c, ५५ ° c 30 एस के लिए, ६८ ° c 21 चक्र के लिए 10 मिनट के लिए; फिर 10 मिनट के लिए ६८ ° c (30 चक्र कुल) । 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है और PCR1 प्लेट 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा ।
  4. तालिका 1में सूचीबद्ध पीसीआर (PCR2) के दूसरे राउंड के लिए रिएजेंट्स को मिलाएं । ८५ कुओं (८० नमूनों, 4 नकारात्मक नियंत्रण, 1 सकारात्मक नियंत्रण) एक नया ९६-अच्छी तरह से पीसीआर प्लेट के 28 µ एल जोड़ें ( चित्र 1bमें लेआउट का पालन करें) । इस थाली ' PCR2 ' नामित ।

नोट: PCR2 के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों हैं:
275F: ५ '-ACAGGGACCTGAAAGCGAAAG-३ ' (HXB2 वरून 646-666)
280R: ५ '-CTAGTTACCAGAGTCACACAACAGACG-३ ' (HXB2 वरून 9650-9676)

  1. संक्षेप में PCR1 प्लेट एक पीसीआर प्लेट स्पिनर में स्पिन या केंद्रापसारक (४०० x g 10 एस के लिए कमरे के तापमान पर) कुओं के किनारों से किसी भी अवशिष्ट सामग्री को नीचे खींचने के लिए । Tris-HCl (5 mM, pH 8) के ८० µ l को PCR1 प्लेट के प्रत्येक कुआं पर जोड़ें ।
    1. एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करते हुए PCR2 प्लेट के लिए PCR1 प्लेट के 2 µ l को ट्रान्सफर करें । सुनिश्चित करें कि नमूने अच्छी तरह से स्थानांतरित कर रहे हैं (यानी, PCR1 प्लेट के अच्छी तरह से a1 से 2 µ एल PCR2 प्लेट की अच्छी तरह से किया गया है) । सील PCR2 प्लेट एक स्पष्ट चिपकने वाला सील का उपयोग ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    2. संक्षेप में PCR2 प्लेट एक पीसीआर प्लेट स्पिनर में स्पिन या केंद्रापसारक (४०० x g 10 एस के लिए कमरे के तापमान पर) कुओं के किनारों से किसी भी अवशिष्ट सामग्री को नीचे खींचने के लिए । -20 डिग्री सेल्सियस पर लंबी अवधि के भंडारण के लिए एक गर्मी सील फिल्म के साथ PCR1 प्लेट सील ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. एक thermocycler में PCR2 प्लेट भागो: 2 मिनट के लिए ९४ ° c; फिर 30 एस के लिए ९४ ° c, 30 एस के लिए ६४ ° c, 3 चक्र के लिए 10 मिनट के लिए ६८ ° c; 30 s के लिए ९४ ° c, ६१ ° c के लिए 30 s, ६८ ° c 3 चक्र के लिए 10 मिनट के लिए; 30 s के लिए ९४ ° c, ५८ ° c के लिए 30 s, ६८ ° c 3 चक्र के लिए 10 मिनट के लिए; 30 एस के लिए ९४ ° c, 30 एस के लिए ५५ ° c, 31 चक्र के लिए 10 मिनट के लिए ६८ ° c; फिर 10 मिनट के लिए ६८ ° c (४० चक्र कुल) । 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है और PCR2 प्लेट 2 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा ।
  3. एक पीसीआर प्लेट स्पिनर में PCR2 प्लेट को संक्षेप में स्पिन या कुओं के किनारों से किसी भी अवशिष्ट सामग्री को नीचे खींचने के लिए । Tris-HCl (5 mM, pH 8) के ६० µ l को एक मल्टीचैनल पिपेट के उपयोग से जोड़ें ।
    1. 2 x ४८ पर प्रत्येक कुआं के 15 µ l को चलाएं-अच्छी तरह से कास्ट 1% agarose जैल युक्त ethidium ब्रोमाइड (0.1 \ u 20120.3 µ g/mL, सामग्री की तालिकादेखें) । 10 kb तक एक सीमा के साथ एक सीढ़ी का प्रयोग करें ( सामग्री की तालिकादेखें) । परिवर्धित उत्पाद और उनके अनुमानित आकार वाले कुओं की पहचान करने के लिए कल्पना करें । जेल छवि को बचाओ ।
      नोट: सुनिश्चित सकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से प्रवर्धित उत्पाद शामिल हैं । यदि नकारात्मक नियंत्रण कुओं उत्पाद प्रवर्धित होते हैं, संदूषण और उपेक्षा प्लेट पर विचार करें ।
  4. कमजोर पड़ने पर जो कुओं का कोई 30% से अधिक प्रवर्धित उत्पाद के लिए सकारात्मक है निर्धारित करते हैं ।
    नोट: यह अंत बिंदु कमजोर पड़ने जिसमें कुओं के बहुमत (८०%) एक एकल टेंपलेट से प्रवर्धित उत्पाद होते हैं । इस कमजोर पड़ने और तैयार किया जाना चाहिए बाद पीसीआर में इस्तेमाल के लिए आगे वायरल amplicons प्राप्त करते हैं । प्रत्येक प्रवर्धित उत्पाद का अनुमानित आकार रिकॉर्ड करे ।

3. डीएनए शुद्धि और ठहराव

  1. एक पीसीआर प्लेट स्पिनर में PCR2 प्लेट को संक्षेप में स्पिन या कुओं के किनारों से किसी भी अवशिष्ट सामग्री को नीचे खींचने के लिए । स्थानांतरण ४० µ एल संवर्धित उत्पाद से युक्त (पर या अंत बिंदु कमजोर पड़ने के नीचे) एक नया ९६-अच्छी तरह से मिडी प्लेट (०.८ मिलीलीटर की एक अच्छी तरह से मात्रा के साथ, सामग्री की तालिकादेखने के लिए) ।
    नोट: प्रत्येक प्रवर्धित उत्पाद का एक रिकॉर्ड के रूप में एक स्प्रेडशीट में प्रत्येक प्रवर्धित उत्पाद की मूल और नई अच्छी स्थिति को अनुक्रम में लिखें ।
  2. एक चुंबकीय मनका आधारित पीसीआर शोधन किट का उपयोग कर परिवर्धित डीएनए उत्पादों को शुद्ध (सामग्री की तालिका देखें) को दूर करने के लिए प्राइमरों, न्यूक्लियोटाइड, एंजाइमों, तेल और लवण । शुरू करने से पहले, कमरे के तापमान के लिए चुंबकीय मोती लाने और ताजा ८०% इथेनॉल तैयार करते हैं । डीएनए नमूनों के क्रॉस संदूषण से बचने के लिए उपयुक्त होने पर नए पिपेट सुझावों का उपयोग करें ।
    1. भंवर चुंबकीय मोती सुनिश्चित करने के लिए वे अच्छी तरह से resuspend कर रहे हैं । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, ०.८ एमएल ९६ अच्छी तरह से मिडी प्लेट में प्रवर्धित उत्पाद के ४० µ एल को मोतियों की ४० µ एल जोड़ें. धीरे पिपेट ऊपर और नीचे 10 बार मिश्रण करने के लिए । वैकल्पिक रूप से, थाली सील तो १,८०० rpm पर 2 min. के लिए 5 मिनट के तापमान पर मशीन के लिए एक microplate शेखर पर मिलाते हुए समाधान मिश्रण ।
    2. एक चुंबकीय स्टैंड पर प्लेट प्लेस ( सामग्री की तालिकादेखें) 2 मिनट के लिए निकालें और supernatant त्यागें ।
    3. स्टैंड पर प्लेट के साथ एक अच्छी तरह से ८०% इथेनॉल के २०० µ एल जोड़कर मोती धोने । 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर मशीन निकालें और supernatant को छोड़ें । एक बार दोहराएं । ठीक सुझावों के साथ एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, दूसरा धोने के बाद किसी भी अतिरिक्त इथेनॉल निकालें । स्टैंड पर प्लेट के साथ, 15 मिनट के लिए सूखी हवा के लिए मोती की अनुमति दें ।
    4. स्टैंड से प्लेट हटा लें । एक अच्छी तरह से करने के लिए रेफरेंस बफर के 30 µ एल जोड़ें ( सामग्री की तालिकादेखें) । धीरे पिपेट ऊपर और नीचे 10 बार मिश्रण करने के लिए । वैकल्पिक रूप से, प्लेट सील तो 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 2 मिनट की मशीन के लिए १,८०० rpm पर एक microplate शेखर पर मिलाते हुए हल मिश्रण ।
    5. एक चुंबकीय स्टैंड पर प्लेट 2 मिनट के लिए प्लेस । एक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग, एक नया ९६-well पीसीआर प्लेट के लिए supernatant (शुद्ध डीएनए) के 25 µ एल हस्तांतरण । सुनिश्चित करें कि नमूने अच्छी तरह से स्थानांतरित कर रहे हैं-अच्छी तरह से (यानी, supernatant में अच्छी तरह से a1 की ०.८ मिलीलीटर प्लेट अच्छी तरह से नए ९६-खैर प्लेट के लिए हस्तांतरित किया जाता है).
      नोट: eluted नमूना के 5 उल पीछे अवशिष्ट शुद्धि मोतियों की कोई हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए छोड़ दिया है ।
  3. निर्धारित करने और एक spectrophotometer (२६० एनएम की तरंग दैर्ध्य पर अवशोषित) का उपयोग शुद्धि के बाद प्रत्येक प्रवर्धित डीएनए उत्पाद की अनुमानित एकाग्रता रिकॉर्ड ।
    ध्यान दें: प्रत्येक प्रवर्धित उत्पाद की अनुमानित एकाग्रता को मापने के लिए इस स्तर पर आवश्यक है कि कोई नमूने शुद्धीकरण चरणों के दौरान खो रहे हैं और लगभग एकाग्रता मानक वक्र की सीमा के भीतर है अगले चरण में इस्तेमाल किया ( 0.001 – 1 एनजी/µ एल डीएनए में १०० µ l की मात्रा). प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है और साफ नमूनों 6 महीने तक के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  4. एक dsDNA ठहराव किट का उपयोग कर एक शुद्ध उत्पाद के डीएनए की एकाग्रता यों तो (सामग्री की तालिका देखें) ।
    नोट: यह एक नमूना में dsDNA की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक मानक वक्र का उपयोग शामिल है । किट बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल, 1 मिमी EDTA, पीएच ७.५), एक lamda dsDNA मानक, और एक फ्लोरोसेंट डाई शामिल हैं । बर्फ पर सभी रिएजेंट रखें । प्रकाश के लिए जोखिम से बचने के लिए पंनी के साथ डाई युक्त ट्यूब कवर । तपसिल में प्रत्येक प्रवर्धित उत्पाद की एकाग्रता को मापने ।
    1. पतला करने के लिए बफर में 1x बाँझ DNase नि: शुल्क एच2ओ. जोड़ें ९९ µ एल बफर के खाली कुओं की एक उचित संख्या के लिए (3 बार प्रवर्धित उत्पादों की संख्या को मापा जा करने के लिए, एक उदाहरण के लेआउट के लिए तालिका 2 देखें) एक फ्लैट नीचे ऊतक संस्कृति की थाली । 3 रिक्त कुओं के लिए बफर के १०० µ एल जोड़ें ।
    2. प्रत्येक प्रवर्धित उत्पाद के लिए मापा जा करने के लिए, शुद्ध डीएनए के 1 µ एल जोड़ने (कदम 3.2.5 से) तपसिल में प्रत्येक अच्छी तरह से बफर युक्त (एक उदाहरण के लिए तालिका 2 देखें लेआउट) ।
    3. मानकों को तैयार करने के लिए, पतला lamda dsDNA 10 गुना से 2 एनजी/µ एल करने के लिए ०.००२ एनजी/µ एल जोड़ें १०० µ प्रत्येक dsDNA मानक के एल 3 कुओं के लिए ।
      नोट: चरण 3.4.4 के बाद, मानकों के अंतिम एकाग्रता 1 से ०.००१ एनजी/µ एल से लेकर होगा
    4. बफर के साथ फ्लोरोसेंट डाई 1:200 पतला । जल्दी से प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त नमूना, कारतूस, और मानकों के लिए १०० µ एल जोड़ें । ऊपर और नीचे एक पिपेट के साथ मिश्रण । प्रकाश के साथ संपर्क से बचने के लिए पंनी के साथ प्लेट को कवर ।
    5. एक microplate रीडर पर प्रतिदीप्ति उत्सर्जन पढ़ें (४८० एनएम पर उत्तेजना, उत्सर्जन पर ५२० एनएम) । किसी स्प्रेडशीट में परिणाम रिकॉर्ड करना ।
    6. दर्ज की प्रतिदीप्ति माप का उपयोग कर प्रत्येक नमूने में dsDNA की एकाग्रता का निर्धारण । नमूना और मानकों से खाली कुओं में मापा प्रतिदीप्ति घटाना. प्रत्येक नमूना और triplicates से मानक के लिए औसत प्रतिदीप्ति निर्धारित करें । मानकों के प्रतिदीप्ति मापन के आधार पर एक मानक वक्र ड्रा । मानकों के सापेक्ष नमूनों की एकाग्रता का निर्धारण ।
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
ए मानक (1 एनजी/ मानक (०.१ एनजी/एमएल) मानक (०.०१ एनजी/एमएल) मानक (०.००१ एनजी/एमएल) रिक्त
१०० एमएल १०० एमएल १०० एमएल १०० एमएल १०० एमएल बफर
बी मानक (1 एनजी/ मानक (०.१ एनजी/एमएल) मानक (०.०१ एनजी/एमएल) मानक (०.००१ एनजी/एमएल) रिक्त
१०० एमएल १०० एमएल १०० एमएल १०० एमएल १०० एमएल बफर
सी मानक (1 एनजी/ मानक (०.१ एनजी/एमएल) मानक (०.०१ एनजी/एमएल) मानक (०.००१ एनजी/एमएल) रिक्त
१०० एमएल १०० एमएल १०० एमएल १०० एमएल १०० एमएल बफर
डी नमूना 1: नमूना 2: नमूना 3: नमूना 4: नमुना ५: नमुना ६: नमुना ७: नमूना 8: नमुना ९: नमुना १०: नमुना ११: नमुना १२:
1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर
ई नमूना 1: नमूना 2: नमूना 3: नमूना 4: नमुना ५: नमुना ६: नमुना ७: नमूना 8: नमुना ९: नमुना १०: नमुना ११: नमुना १२:
1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर
एफ नमूना 1: नमूना 2: नमूना 3: नमूना 4: नमुना ५: नमुना ६: नमुना ७: नमूना 8: नमुना ९: नमुना १०: नमुना ११: नमुना १२:
1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर 1 मिलीलीटर डीएनए + ९९ एमएल बफर
जी
एच

तालिका 2: dsDNA के ठहराव के लिए ९६-well प्लेट का उदाहरण लेआउट ।

  1. प्रत्येक शुद्ध उत्पाद को पतला (चरण 3.2.5 में प्राप्त) एच2ओ के साथ ०.२ एनजी/µ एल

4. अनुक्रमण पुस्तकालय की तैयारी

  1. एक NGS डीएनए पुस्तकालय तैयारी किट का उपयोग कर NGS के लिए प्रवर्धित और शुद्ध वायरल डीएनए तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) । सभी tagmentation, पीसीआर प्रवर्धन, और स्वच्छ कदम के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें [सिवाय इसके कि इनपुट डीएनए सहित प्रतिक्रिया संस्करणों (३.५ कदम से) को पुस्तकालय की तैयारी reagents के उपयोग का विस्तार आधा किया जा सकता है] ।
  2. मैन्युअल रूप से एक qPCR आधारित NGS पुस्तकालय ठहराव किट का उपयोग कर पुस्तकालयों को सामान्य ( सामग्री की तालिकादेखें) के लिए वायरस के व्यक्तिगत एकाग्रता का निर्धारण. equimolar मात्रा में व्यक्तिगत वायरस पुस्तकालयों 4 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता, या के रूप में sequencing सेवा प्रदाता द्वारा निर्दिष्ट करने के लिए संयोजित करें ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है और संग्रहीत लाइब्रेरी-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित है ।
  3. चरण ३.४ में उपयोग किए गए समान dsDNA ठहराव किट का उपयोग करके अंतिम पूलिंग लायब्रेरी को बढ़ाता है । निर्माता के निर्देशों का पालन करें । एक उचित किट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर एक स्वचालित ट्रो प्रणाली पर परित पुस्तकालय के 1 µ एल चला कर औसत टुकड़ा लंबाई निर्धारित करें । का उपयोग करें एकाग्रता और औसत अंश लंबाई molarity का निर्धारण करने के लिए pooled लाइब्रेरी ।
  4. ०.२ N NaOH के 5 µ l के साथ पुस्तकालय को विकृत करने के लिए 5 µ l के साथ परित पुस्तकालय का मिश्रण. २०० mM Tris-HCl के 5 µ l को बेअसर करने के लिए डालें । ठंडा संकरण बफर (डीएनए पुस्तकालय तैयारी किट के साथ उपलब्ध है) के साथ १२.५ बजे के लिए अंतिम पुस्तकालय तुरंत अनुक्रमण करने से पहले पतला ।
  5. प्रदर्शन 2 x १५० न्यूक्लियोटाइड (nt) युग्मित-end अनुक्रमण पर एक उपयुक्त NGS प्लेटफ़ॉर्म ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    नोट: जब प्रति रन ९६ वायरल पुस्तकालयों अनुक्रमित रहे हैं, इस पैदावार लगभग २०,०००,००० युग्मित-अंत प्रति भागो पढ़ता है या २००,००० प्रति व्यक्ति के लिए एक साथ चरण ४.४ और ४.५ आमतौर पर एक sequencing सुविधा द्वारा किया जाता है ।

5. डी नोवो विधानसभा के अनुक्रम एचआईवी-1 वायरस

नोट: प्रत्येक प्रवर्धित वायरस के आनुवंशिक अनुक्रम को प्राप्त करने के लिए, contigs युग्मित-अंत पढ़ता से de नोवो इकट्ठे होते हैं । कई प्लेटफार्मों (जैसे, सीएलसी जीनोमिक्स कार्यक्षेत्र14), डी नोवो विधानसभा के लिए कस्टम कार्यप्रवाह के डिजाइन की अनुमति दें । अंय ओपन सोर्स सॉफ़्टवेयर जैसे FastQC15, Trimmomatic16, Cutadapt17, और18 फ़्लैश भी संसाधन के लिए उपयोग किया जा सकता पढ़ता है, साथ ही उपकरण जैसे Bowtie219 और हुकुम20 पढ़ने के लिए मानचित्रण के लिए और de नोवो असेंबली । एचआईवी के de नोवो विधानसभा के लिए कदम-1 एक विशिष्ट वाणिज्यिक मंच का उपयोग कर contigs ( सामग्री की तालिकादेखें) नीचे उल्लिखित है (चित्रा 2) । अनुकूलित वर्कफ़्लो फ़ाइल अनुरोध पर उपलब्ध है ।

  1. आयात अनुक्रम और गुणवत्ता की जांच: युग्मित अनुक्रम पढ़ता (fastq. gz प्रारूप में) में सॉफ्टवेयर है, जो फिर युग्मित पढ़ता के एकल सेट के रूप में संयुक्त किया जाएगा आयात । एक अनुक्रम QC रिपोर्ट जनरेट करें और अपने डेटा की गुणवत्ता की जांच ।
  2. गुणवत्ता नियंत्रण
    1. QC रिपोर्ट के अनुसार ट्रिमिंग करने के लिए पढ़ें । किसी भी एडेप्टर अनुक्रम और अस्पष्ट न्यूक्लियोटाइड निकालें । ट्रिम पंद्रह 5 ' और दो 3 ' टर्मिनल न्यूक्लियोटाइड । छोड़ें ५० न्यूक्लियोटाइड से कम लंबाई में पढ़ता है । 30 के एक QC phred स्कोर करने के लिए इसी ०.००१ की एक कड़े गुणवत्ता सीमा का उपयोग करें ।
  3. अतिव्यापी जोड़े विलय
    1. मर्ज करके प्रपत्र एकल विस्तारित पढ़ता आगे युग्मित और अधिव्याप्त क्षेत्रों के साथ रिवर्स पढ़ता है ।
  4. De नोवो असेंबली
    1. एक शब्द के साथ देशी सीएलसी जीनोमिक्स डी नोवो कोडांतरक का प्रयोग करें (या k-मेर) आकार के 30 nt और ६५ nt का एक अधिकतम बबल आकार को इकट्ठा करने के लिए १०,००० गैर अतिव्यापी युग्मित के एक यादृच्छिक नमूना पढ़ता है । de नोवो contig के लिए अपेक्षित कवरेज ~ 200x ~ 9 kb अनुक्रम के लिए है ।
      नोट: यह उपनमूना अभिकलनी बोझ को कम कर सकते है इस तरह कि सबसे मानक डेस्कटॉप कंप्यूटर विधानसभा और विश्लेषण संभाल कर सकते हैं, और प्रत्येक वायरस के clonality दिया (एक पुस्तकालय एक वायरस है), यह विविधता की सीमा नहीं है ।
  5. contigs करने के लिए सभी पढ़ता Re-मैपिंग
    1. प्रत्येक वायरस के अंतिम बहुमत आम सहमति अनुक्रम प्राप्त करने के लिए, पूर्ण पढ़ें सेट करने के लिए डी नोवो इकट्ठे contig नक्शा. 1, 000x की न्यूनतम औसत कवरेज के साथ केवल contigs स्वीकार करें और अंतिम contig लंबाई मूल agarose जेल (step 2.8.1) पर बैंड के आकार से मेल खाती है । अंतिम बहुमत आम सहमति अनुक्रम एक. फसता फ़ाइल के रूप में सहेजें ।
      नोट: अधिकांश contigs उपरोक्त चरणों का उपयोग कर इकट्ठा किया जा सकता है । हालांकि, कुछ मामलों में, एक एकल वायरस के लिए, एक समान कवरेज के साथ एकाधिक contigs इकट्ठा कर रहे हैं । इन परिस्थितियों में, contigs एक ही भागीदार से एक के पास पूर्ण लंबाई (~ 9 केबी) आम सहमति अनुक्रम के लिए गठबंधन कर रहे है और मैंयुअल रूप से एक एकल contig में इकट्ठे हुए । सभी पढ़ता है तो मैंयुअल रूप से इकट्ठे contig और अंतिम सहमति स्वीकार किए जाते है यदि पढ़ें कवरेज विधानसभा भर में भी है और कोई भी न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं (SNPs) > ४०% उपस्थित है के लिए मैप कर रहे हैं ।
  6. आगे गुणवत्ता नियंत्रण
    1. प्रत्येक contig सुनिश्चित करने के लिए एक भी वायरस का प्रतिनिधित्व करता है, और एक ही अच्छी तरह से, स्क्रीन पढ़ें कवरेज और अंतिम contig के संस्करण कॉलिंग के भीतर एकाधिक वायरस के प्रवर्धन के कारण नहीं है ।
    2. कई वायरल पीसीआर के दौरान मौजूद टेंपलेट्स अक्सर बहुत असमान पढ़ने के कवरेज के द्वारा की पहचान कर रहे है (सह के कारण अलग आकार के वायरस के प्रवर्धन) जब एक ही भागीदार है, या एक साथ SNPs की उपस्थिति से एक पूर्ण लंबाई आम सहमति के लिए मानचित्रण की आवृत्ति > 40% (प्रतिनिधि परिणाम, चित्रा 4देखें) । बाद में विश्लेषण में मिश्रित आबादी उपेक्षा ।
  7. संरेखण
    1. इस तरह के आणविक विकासवादी आनुवंशिकी विश्लेषण (मेगा) के रूप में दृश्य सॉफ्टवेयर अनुक्रम में प्रत्येक वायरल अनुक्रम के अंतिम सहमति आयात 721। प्रत्येक अनुक्रम को मैंयुअल रूप से HXB2 संदर्भ अनुक्रम में संरेखित करें । ट्रिम 5 ' और 3 ' HXB2 के पदों 666-9650 को समाप्त करने के लिए प्राइमरी दृश्यों को हटा दें ।
    2. फसता प्रारूप में अनुक्रम सूची निर्यात करें और फिर MAFFT संस्करण 722का उपयोग कर संरेखित करें, जहां अंतिम संरेखण प्राप्त करने के लिए उपयुक्त मैनुअल संपादन के साथ ।
      नोट: किसी भी अनुक्रम संरेखित नहीं करते हैं, तो पहले रिवर्स अनुक्रम पूरक । अनुक्रम अभी भी नहीं संरेखित करता है, तो अनुक्रम एचआईवी-1 सुनिश्चित करने के लिए एक विस्फोट खोज निष्पादित करें । यह गैर-एचआईवी-1 टेम्पलेट्स बढ़ाना संभव है और इस अवस्था में इन की पहचान की जा सकती है. यदि अनुक्रम एचआईवी-1 रहे हैं, लेकिन संरेखित नहीं है, उलटा की उपस्थिति पर विचार (६.१ कदम देखें) ।

6. एचआईवी की संभावित प्रतिकृति क्षमता का निर्धारण-1 वायरल अनुक्रम

नोट: आनुवंशिक रूप से बरकरार के अनुक्रम की पहचान करने के लिए, और संभावित प्रतिकृति-सक्षम, एचआईवी-1 को बालश्रम की एक कड़े प्रक्रिया का पालन किया है (चित्रा 1C) । unversionings की कमी, बड़े आंतरिक विलोपन, बचके बंद codons/hypermutation, frameshift उत्परिवर्तनों, और/या एमएसडी साइट या पैकिंग संकेत में दोषों आनुवंशिक रूप से बरकरार है और संभवतः प्रतिकृति सक्षम माना जाता है ।

  1. व्युत्क्रम
    1. संरेखण चरण के दौरान, उलटा पहचानें । व्युत्क्रम क्षेत्र हैं, जहां अनुक्रम संदर्भ HXB2 करने के लिए संरेखित नहीं है जब तक कि, जब तक कि क्षेत्रों के पीछे पूरित है ।
      नोट: डेटा के अनुप्रयोग के आधार पर, अनुक्रम वाले वर्शन को आगे के विश्लेषण से छोड़े जाने की आवश्यकता हो सकती है.
  2. बड़े आंतरिक हटाए गए
    1. संरेखण चरण में बड़े आंतरिक विलोपन (> 600 bp) के साथ contigs की पहचान करें । जब तक nefके भीतर विलोपन बैठता है, अनुक्रम को दोषपूर्ण के रूप में परिभाषित किया जा सकता है ।
      नोट: कोई भी अनुक्रम आंतरिक हटाए गए के साथ < 600 bp की पहचान की जाएगी जीन कटर द्वारा (step 6.3.1) अपूर्ण जीन अनुक्रम होने के रूप में ।
  3. बचके रोक codons, frameshift उत्परिवर्तनों और विलोपन
    1. लंबाई के सभी contigs की जांच करें > 8400 न्यूक्लियोटाइड की उपस्थिति के लिए बचके स्टॉप codons, frameshifts और अपूर्ण जीन लॉस एलामोस राष्ट्रीय प्रयोगशाला एचआईवी अनुक्रम डाटाबेस का उपयोग कर अनुक्रम जीन कटर उपकरण23.
      नोट: जीन कटर उपकरण जीन चुप, पोल, vif, vpr, जैसे, rev, vpu, env, और nefमें वायरल अनुक्रम विभाजित है, और उंहें अमीनो एसिड के लिए अनुवाद । जीन कटर तो रोक codons और frameshift उत्परिवर्तनों की उपस्थिति के लिए स्क्रीन (संमिलन या विलोपन के कारण) । Contigs युक्त स्टॉप codons या frameshifts किसी भी जीन में, nef24को छोड़कर, दोषपूर्ण के रूप में वर्गीकृत किया जाता है. जीन कटर भी अपूर्ण जीन दृश्यों और nef के अलावा एक जीन में एक विलोपन < 600 बीपी के साथ किसी भी वायरस की पहचान करता है एक बड़ी आंतरिक विलोपन के कारण दोषपूर्ण के रूप में पुनर्वर्गीकृत किया जा सकता है ।
  4. Hypermutation
    1. शेष पूर्ण लंबाई वायरल लॉस एलामोस राष्ट्रीय प्रयोगशाला एचआईवी अनुक्रम डाटाबेस आम सहमति निर्माता उपकरण (सरल आम सहमति निर्माता)25का उपयोग कर दृश्यों का एक आम सहमति उत्पंन करते हैं । केवल शेष पूर्ण लंबाई वाले वायरल अनुक्रम वाले किसी संरेखण के शीर्ष पर आम सहमति अनुक्रम जोड़ें । इस संरेखण और लॉस एलामोस राष्ट्रीय प्रयोगशाला एचआईवी अनुक्रम डेटाबेस Hypermut उपकरण26 का उपयोग APOBEC-प्रेरित जी की पहचान करने के लिए-एक hypermutation शेष पूर्ण लंबाई में वायरल अनुक्रम ।
  5. एमएसडी और पैकेजिंग सिग्नल में दोष
    1. एमएसडी और पैकेजिंग सिग्नल (HXB2 क्षेत्र 670-810) जो वायरल अनुक्रम दोषपूर्ण4प्रदान में दोषों के लिए शेष contigs में से प्रत्येक का निरीक्षण । एमएसडी साइट में एक बिंदु उत्परिवर्तन के लिए देखो (अनुक्रम GT, HXB2 744-745) या पैकेजिंग सिग्नल के चार स्टेम छोरों में किसी भी विलोपन (SL1 (HXB2 691-734), SL2 (HXB2 736-754), SL3 (HXB2 766-779), और SL4 (HXB2 790-810)) ।

Representative Results

फ्लिप्स परख प्रवर्धक और अनुक्रम एकल, पूर्ण लंबाई एचआईवी के पास-1 वायरस । प्रोटोकॉल पूर्ण लंबाई वायरल दृश्यों के पास प्राप्त करने के लिए 6 कदम शामिल है । इन चरणों में शामिल हैं: संक्रमित कोशिकाओं के lysis, पूर्ण लंबाई की नेस्टेड पीसीआर (बरकरार और दोषपूर्ण) एचआईवी-1 वायरस, डीएनए शुद्धि और ठहराव, sequencing पुस्तकालय तैयारी, NGS, और de नोवो sequenced वायरसों की विधानसभा । हर कदम के अंत में एक चौकी पर विचार किया जा सकता है, जिसमें उत्पाद की गुणवत्ता (जैसे परिवर्धित डीएनए, शुद्ध डीएनए, अनुक्रमण लाइब्रेरी या अनुक्रम) अगले चरण से पहले मूल्यांकन किया जा सकता है । प्रत्येक चरण के अंत में किए गए मूल्यांकन का ओवरव्यू और अपेक्षित परिणाम नीचे उल्लिखित है.

नेस्टेड पीसीआर, प्रवर्धित उत्पादों के बाद एक 1% agarose जेल (चित्रा 3) पर चला रहे हैं । पीसीआर की प्रारंभिक गुणवत्ता नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के निरीक्षण के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । नकारात्मक नियंत्रण कुओं संवर्धक उत्पाद से युक्त संकेत संदूषण और सकारात्मक नियंत्रण कुओं प्रवर्धित उत्पाद के अनुपस्थित अपर्याप्त प्रवर्धन संकेत मिलता है । अगला, प्रवर्धित उत्पाद युक्त कुओं अनुक्रमण के लिए चुना जाता है । कुओं से बचने के लिए कई प्रवर्धित वायरस के मिश्रण युक्त, केवल कुओं से युक्त उत्पाद अंत बिंदु कमजोर पड़ने पर चलाने के अनुक्रमण के लिए माना जाता है । Poisson वितरण के अनुसार, अंत बिंदु कमजोर पड़ने पाया जाता है जब कुओं के 30% प्रवर्धित उत्पाद के लिए सकारात्मक हैं । इस कमजोर पड़ने पर, वहां एक ८०% मौका इन कुओं एक भी प्रवर्धित वायरस होते हैं । इसके अतिरिक्त, कुओं विभिंन लंबाई के कई प्रवर्धित वायरस युक्त इस स्तर पर visualized किया जा सकता है के रूप में कई बैंड जेल पर दिखाई देगा । इन कुओं sequencing (चित्रा 3) के लिए चयनित नहीं किया जाना चाहिए ।

sequencing के लिए चयनित प्रवर्धित वायरस की शुद्धि के बाद, ठहराव कोई वायरल डीएनए शुद्धि चरण के दौरान खो जाता है सुनिश्चित करता है । यदि एक प्रवर्धित वायरस के डीएनए एकाग्रता है < 0.2 एनजी/µ l, PCR2 थाली में शेष नमूना शुद्ध किया जा सकता है । एक समान चेकपॉइंट लायब्रेरी तैयारी, जिसमें प्रत्येक व्यक्ति लायब्रेरी quantified है, के बाद होती है । यह सुनिश्चित करता है व्यक्तिगत वायरस उचित खंडित किया गया है, टैग और अनुक्रमण से पहले परिलक्षित । व्यक्तिगत वायरल पुस्तकालयों equimolar मात्रा में 4 एनएम के एक अंतिम पुस्तकालय एकाग्रता को परित (या के रूप में sequencing प्रदाता द्वारा निर्दिष्ट) हैं । एक व्यक्ति वायरल पुस्तकालय की एकाग्रता बहुत कम है, तो यह sequencing पुस्तकालय पूल से बाहर रखा जा सकता है, या अलग से तैयार पुस्तकालय फिर से । एक अंतिम जांच pooled पुस्तकालय की एकाग्रता की औसत टुकड़ा लंबाई की पुष्टि के साथ अनुक्रमण करने से पहले किया जाता है ।

de नोवो विधानसभा चरण से पहले गुणवत्ता नियंत्रण चरणों अंतिम वायरल contig को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया पढ़ता की गुणवत्ता सुनिश्चित करता है. इन चरणों में शामिल हैं: एडाप्टर अनुक्रम को हटाने, 5 ' और 3 ' न्यूक्लियोटाइड, एक कड़े गुणवत्ता की सीमा, और लघु पढ़ता की अवहेलना । सीएलसी जीनोमिक्स कार्यक्षेत्र गुणवत्ता नियंत्रण रिपोर्ट प्रदान कर सकता है जो पहले पढ़ता है और ट्रिमिंग सेटिंग्स की प्रारंभिक गुणवत्ता का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, और तब यह निर्धारित करने के बाद कि क्या ट्रिमिंग कम गुणवत्ता वाले क्षेत्रों को निकालने के लिए पर्याप्त थी । इसके अतिरिक्त, डी नोवो विधानसभा के लिए, इकट्ठे contigs की गुणवत्ता पर्याप्त गहराई (> 1000X) और कवरेज की समता (चित्रा 4a) के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है । मिश्रित आबादी वाले इस मुकाम पर भी पहचाना जा सकता है. एकाधिक पूर्ण लंबाई (~ 9 केबी) के मिश्रण से अधिक ४०% की आवृत्ति के साथ कई SNPs की उपस्थिति के माध्यम से की पहचान कर रहे हैं, जबकि कम के मिश्रण (एक बड़े आंतरिक विलोपन युक्त) और पूर्ण लंबाई वाले वायरस असमान द्वारा पहचाना जा सकता है एक ही भागीदार (चित्रा 4B) से एक पूर्ण लंबाई संदर्भ के लिए मानचित्रण निंनलिखित कवरेज पढ़ें ।

आवेदन के आधार पर, अंतिम संरेखण जैसे ggtree में एक पैकेज के रूप में उपलब्ध उपकरण का उपयोग कर visualized किया जा सकता है "R: एक भाषा और पर्यावरण सांख्यिकीय कंप्यूटिंग के लिए"27। हाल के एक अध्ययन में, फ्लिप्स, भोली, सेंट्रल, संक्रमणकालीन, और प्रभावता स्मृति CD4+ टी लंबी अवधि के कला पर व्यक्तियों से अलग कोशिकाओं से एचआईवी-1 के लिए, उद्देश्य के साथ अगर विशेष सेल उपसमुच्चय की पहचान करने के लिए अधिक दिखाया के लिए उपयोग किया गया था उच्च आनुवंशिक रूप से बरकरार है और संभावित प्रतिकृति-सक्षम एचआईवी-12के अनुपात । यहां, इस अध्ययन के एक भागीदार से पृथक अनुक्रम के दृश्य प्रतिनिधित्व (प्रतिभागी २०२६) प्रस्तुत किया है (चित्रा 5) । इस भागीदार में, बहुमत (९७%) अनुक्रम के दोषपूर्ण थे, बरकरार अनुक्रम के साथ प्रभाव और संक्रमणकालीन स्मृति CD4+ टी कोशिकाओं में पाया । इस दृश्य उपकरण बड़े आंतरिक विलोपन और जीनोम में उनकी स्थिति के साथ अनुक्रम की संख्या दिखाने के लिए उपयोगी है । यह आगे व्याख्या की जा सकती है बचके स्टॉप codons, frameshift उत्परिवर्तनों के साथ दृश्यों का संकेत है, और हटाए गए/एमएसडी साइट और/या पैकेजिंग संकेत में उत्परिवर्तनों ।

एक आवेदन फ्लिप परख के आनुवंशिक रूप से बरकरार है और संभवतः प्रतिकृति सक्षम एचआईवी-1 वायरस की पहचान है । ५३१ के हाल के एक अध्ययन में CD4+ टी कोशिकाओं से अलग लंबी अवधि कला पर 6 प्रतिभागियों से, 26 (5%) आनुवंशिक रूप से बरकरार एचआईवी-1 वायरस2की पहचान की गई । शेष दोषपूर्ण वायरस उलटा दृश्यों के साथ उन शामिल (6%), बड़े आंतरिक विलोपन (६८%), बचके stop codons/hypermutation (9%), frameshift उत्परिवर्तनों (1%), और पैकेजिंग संकेत में दोषों और/या एमएसडी साइट में उत्परिवर्तनों (11%) .

Figure 2
चित्रा 2: डी नोवो असेंबली के लिए कार्यप्रवाह का एचआईवी-1 वायरस का अवलोकन. वर्कफ़्लो में प्रमुख चरणों में शामिल हैं: 1) अनुक्रम पठन गुणवत्ता नियंत्रण, 2) अतिव्यापी जोड़े विलय, 3) de नोवो विधानसभा, और 4) पुनर्मानचित्रण और आम सहमति निर्माण क्रमशः लाल, नीला, हरा और नारंगी रंग का हो गया है । यह आंकड़ा Hiener एट अल से संशोधित किया गया है । 2 . कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: पीसीआर के उदाहरण agarose जेल परिवर्धित एचआईवी-1 वायरस । वेल्स 1, 2, 3, 6, 9 और 10 को परिवर्धित एचआईवी-1 वायरस होते हैं । अच्छी तरह से 10 एक बड़ी आंतरिक विलोपन के साथ एक वायरस होता है, अच्छी तरह से 2 शामिल है सह दो एचआईवी के प्रवर्धन-1 अलग लंबाई (मिश्रण) के वायरस, और अच्छी तरह से 12 सकारात्मक नियंत्रण शामिल हैं । नोट कुओं का प्रतिशत प्रवर्धित उत्पाद युक्त ६०% है, जो एकल टेम्पलेट्स को अलग करने के लिए आवश्यक प्रतिशत से ऊपर है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: पठन मैपिंग का उदाहरण आउटपुट । (एक) एक भी पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 वायरस के प्रवर्धन के कारण कवरेज का प्रदर्शन उदाहरण । de नोवो असेंबली के बाद, सभी पढ़ता एक आम सहमति अनुक्रम बनाने के लिए इकट्ठे contig करने के लिए मैप किए गए हैं । सॉफ्टवेयर मंच के लिए पर्याप्त और भी कवरेज के लिए निरीक्षण किया जा करने के लिए मैप पढ़ता अनुमति देता है । (ख) विभिन्न लंबाई के दो एचआईवी-1 विषाणुओं के सह-प्रवर्धन का प्रदर्शन उदाहरण (मिश्रण). मिश्रण का निर्धारण करने के लिए, पढ़ता एक पूर्ण-लंबाई (~ 9 kb) संदर्भ अनुक्रम से एक ही भागीदार और पठन मैपिंग का निरीक्षण करने के लिए मैप की जाती हैं । असमान कवरेज की उपस्थिति एक मिश्रण को इंगित करता है । यह आंकड़ा14Qiagen से अनुमति के साथ reproduced है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एचआईवी के उदाहरण दृश्य-1 वायरल एक व्यक्ति से लंबी अवधि के कला पर CD4+ टी सेल सबसेट से अलग अनुक्रम । व्यक्तिगत एचआईवी-1 वायरल अनुक्रम क्षैतिज लाइनों द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । यह आंकड़ा Hiener एट अल से संशोधित किया गया है । 2 . कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

फ्लिप्स परख बढ़ाना और अनुक्रमण एकल के लिए एक कुशल और उच्च प्रवाह विधि, पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 के पास वायरस है । संख्या और प्राप्त अनुक्रम की गुणवत्ता को प्रभावित करने वाले प्रोटोकॉल में कई कारकों और महत्वपूर्ण चरणों की पहचान की गई है । सबसे पहले, कोशिकाओं की संख्या और एचआईवी-1 कोशिका जनसंख्या के संक्रमण की आवृत्ति को प्रभावित करने वाले वायरस की संख्या का प्रभाव । उदाहरण के लिए, पिछले प्रकाशन में, लगभग आधे के रूप में कई दृश्यों का एक ही नंबर से प्राप्त किया गया था भोली CD4+ टी कोशिकाओं की तुलना में प्रभाव स्मृति CD4+ टी कोशिकाओं. यह इसलिए है क्योंकि भोली कोशिकाओं आमतौर पर प्रभाव स्मृति कोशिकाओं2से एक कम संक्रमण आवृत्ति है । दूसरे, कोशिका lysis जीनोमिक डीएनए प्राप्त करने के लिए कॉलम आधारित निष्कर्षण तरीकों के लिए बेहतर है के रूप में वहां निष्कर्षण प्रक्रिया में डीएनए खोने का कोई खतरा नहीं है । अंत में, किसी भी पीसीआर आधारित परख के साथ के रूप में, प्रदूषण को रोकने के महत्वपूर्ण है । अलग साफ क्षेत्रों मास्टर घोला जा सकता है की तैयारी के लिए नामित किया जाना चाहिए, जीनोमिक डीएनए से निपटने, सकारात्मक नियंत्रण जोड़ने, डीएनए शुद्धि और ठहराव, और पुस्तकालय की तैयारी. यह एक यहां प्रस्तुत के रूप में एक प्रतिलिपि परख के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है ।

फ्लिप्स परख के कार्यांवयन पहले ऐसे pNL4 के रूप में एक सकारात्मक नियंत्रण चल शामिल होना चाहिए-3 plasmids बजाय भागीदार नमूने । यह एचआईवी के उपयोग से पहले किसी भी समस्या निवारण के लिए अनुमति देगा-1 सकारात्मक कोशिकाओं, के रूप में प्राप्त अनुक्रम इन plasmids के लिए उपलब्ध संदर्भ दृश्यों की तुलना में किया जा सकता है । जब एचआईवी-1 सकारात्मक कोशिकाओं का उपयोग कर, यह महत्वपूर्ण है एचआईवी-1 उपप्रकार (फ्लिप्स के लिए डिज़ाइन किया गया प्राइमरों के लिए डिजाइन उप प्रकार बी के लिए विशिष्ट हैं) और कोशिका की आबादी के संक्रमण आवृत्ति यदि कोई वायरस से परिलक्षित कर रहे हैं । प्राइमरी दृश्यों अंय उपप्रकारों के मिलान के लिए संशोधित/ इसके अतिरिक्त, एक अच्छी तरह से युक्त एक सकारात्मक नियंत्रण हर पीसीआर में शामिल किया जाना चाहिए ।

फ्लिपों एसपीएस सहित पिछले अनुक्रमण परख की सीमाओं को दूर किया है । के माध्यम से बढ़ाना और पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 वायरस के पास अनुक्रमण, फ्लिप संभावित प्रतिकृति-एचआईवी की क्षमता-1 वायरस निर्धारित कर सकते हैं । यह संभव एसपीएस, जो केवल उप जीनोमिक क्षेत्रों अनुक्रम और इसलिए बरकरार प्राइमर बंधन साइटों के साथ दृश्यों के लिए चयनित का उपयोग नहीं किया गया । इसके अलावा, फ्लिप्स कई प्रवर्धन और अनुक्रमण प्राइमरों का उपयोग करने के साथ जुड़े सीमाओं पर काबू पाता है, के रूप में पिछले पूर्ण लंबाई अनुक्रमण परख1,4द्वारा नियोजित किया गया था । NGS के साथ संयुक्त एचआईवी-1 लीटर क्षेत्रों को लक्षित पीसीआर के दो दौर के माध्यम से, फ्लिप आवश्यक संख्या और प्राइमरों की जटिलता कम हो जाती है । फ्लिप्स इसलिए कम प्राइमर बेमेल के परिणामों के लिए अतिसंवेदनशील है, अर्थात् दोषपूर्ण वायरसों की गलत पहचान और एक आबादी के भीतर कुछ वायरस बढ़ाना अक्षमता... फ्लिप्स प्रोटोकॉल भी अधिक कुशल है और पिछले तरीकों की तुलना में अनुक्रमण के एक उच्च प्रवाह के लिए अनुमति देता है ।

जाहिर है, फ्लिप्स मौजूदा तरीकों पर लाभ प्रदान करता है कि एचआईवी के आनुवंशिक संरचना-1 वायरस का निर्धारण । हालांकि, यह फ्लिप की सीमाओं को स्वीकार करने के लिए महत्वपूर्ण है । सबसे पहले, फ्लिप परख अव्यक्त एचआईवी के आकार को मापने के लिए एक उपकरण के रूप में विकसित नहीं किया गया है-1 जलाशय, विश्लेषण के रूप में निर्धारित करने के लिए कि क्या फ्लिप हर एचआईवी-1 एक सेल आबादी में मौजूद वायरस प्रवर्धक पूरा नहीं किया गया है । फ्लिप्स अलग कोशिका आबादी2के बीच जलाशय की संरचना की तुलना रिश्तेदार बनाने के लिए बजाय उपयोगी है । दूसरे, प्रतिकृति बरकरार एचआईवी की क्षमता-1 वायरस के बिना निश्चितता के साथ निर्धारित नहीं किया जा सकता है vivo विश्लेषण में , ऐसे हो एट अल द्वारा प्रदर्शन के रूप में । 4. तीसरे, फ्लिप एचआईवी के एकीकरण साइट-1 वायरस का निर्धारण करने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है ।

फ्लिपर्स प्रोटोकॉल के लिए मामूली बदलाव अपने आवेदन को बढ़ा सकते हैं । उदाहरण के लिए, प्राइमरी दृश्यों में परिवर्तन अलग और कई एचआईवी-1 उपप्रकार को परिवर्धित और अनुक्रम की अनुमति दे सकते हैं । प्लाज्मा एचआईवी-1 virions के अनुक्रमण सीडीएनए संश्लेषण के अलावा नेस्टेड पीसीआर से पहले के माध्यम से संभव है । एकल अणु sequencing विधियों का भविष्य उपयोग de नोवो असेंबली की आवश्यकता को समाप्त करेगा ।

एकीकृत एचआईवी के आनुवंशिक अनुक्रमण-1 वायरस अव्यक्त एचआईवी-1 जलाशय की हमारी समझ में वृद्धि हुई है । फ्लिपों संरचना और अव्यक्त जलाशय के वितरण elucidating भविष्य के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है । हालांकि, फ्लिप के आवेदन जलाशय से परे का विस्तार कर सकते हैं । भविष्य के अध्ययन CRISPR-कैस प्रौद्योगिकी के लिए विशेष लक्ष्य निर्धारित करने के लिए फ्लिप का उपयोग कर सकते हैं, या कोडिंग और गैर कोडिंग क्षेत्रों जो वायरस और अधिक विलंबता reversing एजेंटों के लिए उत्तरदायी बनाने की पहचान में सहायता करते हैं । बड़े आंतरिक विलोपन के जंक्शन स्थलों को देखकर वायरल का पुनर्संयोजन बेहतर समझा जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के लिए एक इलाज खोजने के लिए (1U19AI096109 और 1UM1AI126611-01) लेन-देने एड्स अनुसंधान उद्यम (हिम्मत) का समर्थन किया था; एचआईवी उन्मूलन पर एक amfAR अनुसंधान कंसोर्टियम (आर्क) एड्स अनुसंधान के लिए फाउंडेशन से सहयोगात्मक अनुसंधान अनुदान (amfAR 108074-50-RGRL); ऑस्ट्रेलियन सेंटर फॉर एचआईवी एण्ड हेपेटाइटिस वायरोलॉजी रिसर्च (2); UCSF-GIVI सेंटर फॉर एड्स रिसर्च (P30 AI027763); और ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (AAP1061681) । हम पुस्तकालय की तैयारी और उसकी सुविधा के उपयोग में अपने प्रशिक्षण के लिए चिकित्सा अनुसंधान के लिए Westmead संस्थान में Dr. जॉय लाइ, जीनोमिक्स सुविधा प्रबंधक का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, और जीनोमिक्स के लिए Ramaciotti केंद्र (ंयू साउथ वेल्स, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया के विश्वविद्यालय) अनुक्रमण के संचालन के लिए । हम आभार प्रतिभागियों जो इस अध्ययन के लिए नमूने दान के साथ स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 Invitrogen 15568025 Dilute to 5 mM for nested PCR
Nonidet P 40 Substitute solution Sigma 98379
Tween-20 Sigma P9416
Proteinase K Solution (20 mg/mL) Promega AM2548
96 well thermocycler Any 96 well thermocycler can be used
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen 11304011
10x High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] Invitrogen 11304011
50 mM MgSO4 Invitrogen 11304011
PCR Nucleotide Mix, 10 mM Promega C1141
Ultrapure H2O Invitrogen 10977023
PCR1 and PCR2 Primers Desalted. Dilute to (100 µM) with H2O
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear Axygen PCR-96M2-HS-C
Microseal 'B' Adhesive Seals BioRad MSB1001 Required to seal 96 well PCR plates
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). Diluted to 105 copies/mL and used as positive control
PCR plate spinner or benchtop centrifuge
E-GEL 48 1% Agarose Invitrogen G800801 Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide.
DirectLoad Wide Range DNA Marker Sigma D7058 Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted
Mother E-Base device Invitrogen EBM03 Required for running precast 48 well 1% agarose gels
Gel Doc EZ Gel Documentation System BioRad 1708270 Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used
PlateMax Peelable Heat Sealing Axygen HS-200 Heat sealing film for long term storage
96 Well 0.8 mL Storage Plate ThermoFisher Scientific AB0765 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) Beckman Coulter A63880 Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106)
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology Sigma E7023
Magnetic Stand-96 Invitrogen AM10027
Microplate shaker Optional
Buffer EB Qiagen 19086 Elution buffer
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen P11496 A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration
Microplate reader
Nextera XT DNA Library Preparation Kit Illumina FC-131-1096
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-2001
Hard-Shell 96-Well PCR Plates Biorad HSP9601 Required for Nextera XT DNA library preparation kit
Library Quantification Kit - Illumina/Universal Kapa Biosystems KK4824 Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029)
2100 Bioanalyzer Agilent Technology Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit
High Sensistivty DNA kit Agilent Technology 5067-4626
Illumina MiSeq Platform Illumina

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruner, K. M., et al. Defective proviruses rapidly accumulate during acute HIV-1 infection. Nature Medicine. 22 (9), 1043-1049 (2016).
  2. Hiener, B., et al. Identification of Genetically Intact HIV-1 Proviruses in Specific CD4(+) T Cells from Effectively Treated Participants. Cell Reports. 21 (3), 813-822 (2017).
  3. Abram, M. E., Ferris, A. L., Shao, W., Alvord, W. G., Hughes, S. H. Nature, position, and frequency of mutations made in a single cycle of HIV-1 replication. Journal of Virology. 84 (19), 9864-9878 (2010).
  4. Ho, Y. C., et al. Replication-competent noninduced proviruses in the latent reservoir increase barrier to HIV-1 cure. Cell. 155 (3), 540-551 (2013).
  5. Harris, R. S., et al. DNA deamination mediates innate immunity to retroviral infection. Cell. 113 (6), 803-809 (2003).
  6. Lecossier, D., Bouchonnet, F., Clavel, F., Hance, A. J. Hypermutation of HIV-1 DNA in the absence of the Vif protein. Science. 300 (5622), 1112 (2003).
  7. Chun, T. W., et al. Rebound of plasma viremia following cessation of antiretroviral therapy despite profoundly low levels of HIV reservoir: implications for eradication. AIDS. 24 (18), 2803-2808 (2010).
  8. Chomont, N., et al. HIV reservoir size and persistence are driven by T cell survival and homeostatic proliferation. Nature Medicine. 15 (8), 893-900 (2009).
  9. Soriano-Sarabia, N., et al. Quantitation of replication-competent HIV-1 in populations of resting CD4+ T cells. Journal of Virology. 88 (24), 14070-14077 (2014).
  10. Josefsson, L., et al. The HIV-1 reservoir in eight patients on long-term suppressive antiretroviral therapy is stable with few genetic changes over time. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (51), E4987-E4996 (2013).
  11. Evering, T. H., et al. Absence of HIV-1 evolution in the gut-associated lymphoid tissue from patients on combination antiviral therapy initiated during primary infection. Public Library of Science Pathogens. 8 (2), e1002506 (2012).
  12. von Stockenstrom, S., et al. Longitudinal Genetic Characterization Reveals That Cell Proliferation Maintains a Persistent HIV Type 1 DNA Pool During Effective HIV Therapy. Journal of Infectious Diseases. 212 (4), 596-607 (2015).
  13. Palmer, S., et al. Multiple, linked human immunodeficiency virus type 1 drug resistance mutations in treatment-experienced patients are missed by standard genotype analysis. Journal of Clinical Microbiology. 43 (1), 406-413 (2005).
  14. Qiagen. CLC Genomics Version 10. , Available from: https://www.qiagenbioinformatics.com/products/clc-genomics-workbench (2018).
  15. Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  16. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  17. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet.journal. 17 (1), (2011).
  18. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies. Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  19. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  20. Bankevich, A., et al. SPAdes: a new genome assembly algorithm and its applications to single-cell sequencing. Journal of Computational Biology. 19 (5), 455-477 (2012).
  21. Kumar, S., Stecher, G., Tamura, K. MEGA7: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 7.0 for Bigger Datasets. Molecular Biology and Evolution. 33 (7), 1870-1874 (2016).
  22. Katoh, K., Standley, D. M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability. Molecular Biology and Evolution. 30 (4), 772-780 (2013).
  23. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Gene Cutter tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/GENE_CUTTER/cutter.html (2018).
  24. Foster, J. L., Garcia, J. V. Role of Nef in HIV-1 replication and pathogenesis. Advances in Pharmacology. 55, 389-409 (2007).
  25. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Consensus Maker tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/CONSENSUS/consensus.html (2018).
  26. Laboratory, L. A. N. HIV Sequence Database - Hypermut tool. , Available from: https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HYPERMUT/hypermut.html (2018).
  27. Yu, G., Smith, D. K., Zhu, H., Guan, Y., Lam, T. T. Y. ggtree: an r package for visualization and annotation of phylogenetic trees with their covariates and other associated data. Methods in Ecology and Evolution. , (2016).

Tags

आनुवंशिकी मुद्दा १४० अगली पीढ़ी के अनुक्रमण एचआईवी-1 एचआईवी वायरस एकल वायरल अनुक्रमण एचआईवी डीएनए विलंबता प्रतिकृति-योग्यता एंटीरेट्रोवाइरल चिकित्सा एचआईवी जलाशय एकीकृत एचआईवी
अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए निकट पूर्ण लंबाई एचआईवी-1 वायरस के प्रवर्धन
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh,… More

Hiener, B., Eden, J. S., Horsburgh, B. A., Palmer, S. Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (140), e58016, doi:10.3791/58016 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter