Summary
Wir präsentieren eine chirurgische Methode, um rechtsventrikuläre Hypertrophie und Versagen bei Ratten zu induzieren.
Abstract
Rechtsventrikuläre (RV) Scheitern induziert durch nachhaltige Drucküberlastung ist ein wesentlicher Faktor für die Morbidität und Mortalität in mehreren Herz-Lungen-Erkrankungen. Zuverlässige und reproduzierbare Tiermodellen der RV Fehler sind daher geboten, um Krankheitsmechanismen und Auswirkungen der möglichen therapeutischen Strategien zu untersuchen. Banding der pulmonalen Stamm ist eine gängige Methode um isolierte RV-Hypertrophie zu induzieren, aber in der Regel zuvor beschriebenen Modelle nicht gelungen ein stabiles Modell RV-Hypertrophie und Versagen.
Wir präsentieren einem Rattenmodell der Druck induzierten Überlastung RV Hypertrophie verursacht durch pulmonale Stamm Streifenbildung (PTB) ermöglicht, die verschiedenen Phänotypen von RV-Hypertrophie mit und ohne RV-Versagen. Wir verwenden eine modifizierte selbstligierendes Clip Klammer um einen Titan-Clip um den pulmonalen Stamm zu einer voreingestellten Innendurchmesser zu komprimieren. Wir verwenden verschiedene Clip Durchmessern um zu verschiedene Phasen des Fortschreitens der Krankheit von milden RV-Hypertrophie dekompensierten RV-Versagen zu induzieren.
RV-Hypertrophie entwickelt sich konsequent in Ratten ausgesetzt, um die PTB-Verfahren und je nach Durchmesser des angewandten Streifenbildung Clips, wir können genau reproduzieren, andere Krankheit Schweregrade von kompensierten Hypertrophie bis hin zu schweren dekompensierten RV Fehler mit extra kardiale Manifestationen.
Das vorgestellte Modell der PTB ist eine gültige und robuste Modell der Drucküberlastung induzierte RV Hypertrophie und Versagen, die mehrere Vorteile zu anderen banding-Modelle einschließlich hohe Reproduzierbarkeit und die Möglichkeit des Verursachens ernsthafter und dekompensierten RV Missachtung hat.
Introduction
Der Rechte Ventrikel (RV) kann eine anhaltende Drucküberlastung anpassen. In der Zeit jedoch Anpassungsmechanismen nicht Herzzeitvolumen, stützen die RV weitet und schließlich die RV schlägt fehl. RV-Funktion ist der wichtigste prognostische Faktor für mehrere Herz-Lungen-Erkrankungen einschließlich pulmonaler arterieller Hypertonie (PAH), thromboembolische pulmonale Hypertonie (CTEPH) und verschiedene Formen von angeborenen Herzerkrankungen mit Druck (oder Volumen) Überlastung der RV. Trotz intensiver Behandlung bleibt RV Ausfall eine vorherrschende Ursache des Todes unter diesen Bedingungen.
Aufgrund der einzigartigen Eigenschaften1,2 und Embryonalentwicklung3 des RV werden nicht einfach Erkenntnisse aus Linksherzinsuffizienz, Rechtsherzinsuffizienz extrapoliert. Tiermodelle der Rechtsherzinsuffizienz sind daher notwendig, um die Mechanismen der RV Fehler und mögliche pharmakologische Behandlungsstrategien zu untersuchen.
Es gibt experimentelle Modelle der pulmonalen Hypertonie induziert durch SU5416 kombiniert mit Hypoxie (SuHx)4 oder Monocrotaline (MCT)5, die RV Scheitern sekundär zu Krankheit in der pulmonalen Gefäßsystem zu induzieren. Diese Modelle werden verwendet, um die therapeutischen Wirkungen von Drogen das Ziel der pulmonalen Gefäßsystems bewerten. Die SuHx und die MCT-Modell sind nicht feste Nachlast Modelle der RV-Versagen. Infolgedessen ist es nicht möglich festzustellen, ob eine Verbesserung in der RV-Funktion nach einer Intervention sekundär zu Nachlast-Senkung pulmonalen vaskulären Effekte ist oder ob es durch direkte Auswirkungen auf die RV verursacht wird Darüber hinaus hat das MCT-Modell mehrere extra kardialen Effekte.
In experimentelle pulmonale Stamm Streifenbildung Modelle ist die Nachlast des RV durch eine mechanische Verengung des pulmonalen Kofferraum fixiert. Dies ermöglicht die Untersuchung der direkte kardiale Auswirkungen einer Intervention auf der RV unabhängig von einer pulmonalen vaskulären Effekte6,7,8,9. In der Regel ist die Streifenbildung durchgeführt, indem man eine Nadel entlang der pulmonalen Stamm. Dann ist eine Ligatur um die Nadel und der pulmonalen Stamm gelegt und mit einem Knoten gebunden, und die Nadel wird entfernt, so dass die Naht um den pulmonalen Stamm. Abhängig von der Gradmesser für die Nadel verschiedene Grade von Verengungen können angewendet werden, aber trotz dieser Ansatz wird am meisten benutzt, es hat einige Nachteile. Erstens ist der Durchmesser des die Streifenbildung nicht genau dasselbe wie der Außendurchmesser der Nadel wie die Ligatur um die Nadel und der pulmonalen Stamm gebunden ist. Zweitens gibt es möglicherweise erhebliche Unterschiede, wie eng der Knoten gebunden ist, macht es schwierig, ein gewisses Maß an Streifenbildung zu reproduzieren. Dies führt zu einer Variation Streifenbildung Durchmesser und damit eine größere Streuung. Zu guter Letzt kann der Knoten im Laufe der Zeit lockern.
Eine Studie gilt einen halbgeschlossene Tantal Clip rund um die pulmonale Stamm10. Sie komprimiert den Clip um den pulmonalen Stamm zu einem inneren Bereich von 1,10 mm2 und verglich sie mit Ratten Streifenbildung mit einer Naht mit einer Nadel 18 G ausgesetzt. Alles in allem war die Streifenbildung mit dem Clip mit weniger Peri-operativen Komplikationen und Varianz der Daten in Verbindung gebracht.
Basierend auf den Prinzipien von Schou beschrieben Et Al.11, weiter entwickelt und charakterisiert die pulmonalen Stamm Streifenbildung (PTB) Modell RV-Hypertrophie und Versagen. Hier präsentieren wir Ihnen unsere Erfahrung mit diesem Modell basierend auf Ergebnissen aus früheren Studien12,13. Für dieses Modell ist ein Titan-Clip um den pulmonalen Stamm eine genaue voreingestellten Innendurchmesser komprimiert, was angepasst werden kann, um unterschiedliche Phänotypen der RV-Versagen zu induzieren.
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Protocol
Alle Ratten wurden nach dänischen nationalen Richtlinien in das dänische Gesetz über Tierversuche und ministerielle Verordnung von Tierversuchen beschrieben behandelt. Alle Experimente wurden von der institutionellen Ethik Review Board genehmigt und im Einklang mit dem dänischen Gesetz für Tierforschung (RMA-Nummer 2012-15-2934-00384, dänischen Ministerium für Justiz).
1. Anpassung der Ligation Clip Klammer
Hinweis: Die Streifenbildung des pulmonalen Rumpfes erfolgt mit einer modifizierten offen selbstligierendes Clip Präger mit einem abgewinkelten Kiefer. Die Klammer wird modifiziert, mit einem verstellbaren Anschlag-Mechanismus, die Kompression zu beenden, wenn die Kiefer exakte Abstände voneinander zu erreichen. Wenn eine kleine Titan Ligation Clip mit der modifizierten Präger komprimiert wird, besteht ein Lumen zwischen die Beine des Clips mit einem bestimmten Durchmesser je nach Einstellung des Stopp-Mechanismus (Abbildung 1).
- Wählen Sie den Durchmesser der gewünschten Banding, z.B., 0,6 mm.
- Stellen Sie die Ligation Clip Klammer der Abstand zwischen den Backen 1,0 mm bei vollständig komprimiert. Dies lässt ein Lumen von 0,6 mm, wie die zwei Clips Beine eine Dicke von 0,2 mm haben.
Abbildung 1: die PTB Verfahren. (A) die chirurgische Instrumente für die PTB-Verfahren einschließlich der Ligation Clip Klammer (blauer Pfeil). (B) die einstellbaren Anschlag Mechanismus der die Ligation clip Klammer. Drehen das Zahnrad (blauer Pfeil) passen die Position des Stiftes (gelber Pfeil), der das Schließen der Klammer hält, wenn der Kiefer einen bestimmten Abstand voneinander zu erreichen. Der Abstand entspricht zweimal die Dicke der Beine des Clips und der Innendurchmesser des Clips, wenn der Clip komprimiert ist und kann z.B. durch Verwendung einer Nadel mit einem bekannten Außendurchmesser kalibriert werden. (C) komprimiert die Klammer einen Titan-Clip zu einem genauen Innendurchmesser vorgegeben durch Anpassung der die Klammer. (D) der innere Durchmesser des komprimierten Clips kann eingestellt werden, um verschiedene Schweregrade von RV-Hypertrophie und Misserfolg zu induzieren. Für die vorgelegten Daten ein Innendurchmesser von 1,0 mm wurde verwendet, um milde RV-Hypertrophie zu induzieren, ein Innendurchmesser von 0,6 mm wurde verwendet, um moderate RV-Versagen zu induzieren und ein Innendurchmesser von 0,5 mm wurde verwendet, um schwere RV-Versagen zu induzieren. (E) den Clip nach dem Auftragen um den pulmonalen Stamm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
2. Vorbereitung der Ratte
Hinweis: Andere Therapien von Analgetika können angewendet werden.
- Verwenden Sie Wistar Ratten Jungtiere mit einem Gewicht von ca. 100 – 120 g. Um Körpertemperatur während der Operation zu erhalten, verwenden Sie eine überdachte Heizkissen.
- Verwenden Sie für die Chirurgie einen mechanischen Entlüfter auf eine Tidal volume von etwa 1,75 mL und Atemfrequenz von 75 / min eingestellt.
- Betäuben Sie die Ratte mit Sevofluran (7 %-Mix in 1,5 L O2) in einer Induktion Kammer für 5 Minuten. Intubation die Ratte mit einem 17 G IV Kanüle, wo die distalen 2 mm der Nadel sind abgeschnitten worden in Reihenfolge für die weiche Katheter um die Spitze zu decken. Entfernen Sie die Nadel und verbinden Sie die Kanüle mit den Ventilator.
- Legen Sie die Ratte auf seinem Rücken auf das Heizkissen. Stellen Sie sicher, dass die Intubation korrekt ist, durch die Beobachtung der Bewegungen des Brustkorbs. Diese sollte ohne Seite Unterschiede und im Tempo mit dem Ventilator.
Hinweis: Fehlen von Bewegungen des Thorax, Bauch Kontraktionen und Inflation des Magens im linken Oberbauch sind Anzeichen für ein verlegtes Rohr. Entfernen der Kanüle, setzen Sie die Ratte wieder in die Induktion Kammer und erneute Intubation. - Nach dem korrekten Intubation, reduzieren die Sevofluran Wartung Konzentration (3,5 % Mischung in O2, 1,5 L/min) und die Pfoten der Ratte, das Heizkissen zu beheben.
- Bestätigen Sie Prober Anesthetization durch Überprüfung Rückzug Reflexe der Extremitäten mit einer Pinzette, um die Pfoten der Ratte zu quetschen.
- Die Ratten mit Buprenorphin zu injizieren (0,1 mg/kg subkutan (s.c.)) und Carprofene (5 mg/kg s.c.), postoperative Schmerzen zu lindern.
- Die Brust zu rasieren und desinfizieren mit Chlorhexidin.
3. Isolation der pulmonalen Kofferraum
- Machen Sie mit einer Schere einen 2 cm Schnitt in die Haut entlang der mittlere Teil des Brustbeins. Identifizieren Sie dem großen Brustmuskel zu und schneiden Sie ihr sternale festhalten. 2Nd, 3rdund 4th Costa unten zu identifizieren.
- Optional greifen Sie 2Nd Costa mit einer Fixierung Pinzette, setzen eine Naht (4: 0, Multifilament, resorbierbaren) nahe der 2Nd Costa vom 1St Intercostalneuralgie Raum mit dem medialen Unterteil 2Nd Intercostalneuralgie Platz. Knoten Sie einen festen um die vorderen Brust-Arterie zu verbinden.
Hinweis: Dies kann nützlich sein, wenn Blutungen aus der vorderen Brust-Arterie ein wiederkehrendes Thema ist. - Schneiden Sie 4th, 3rdund 2Nd Costa in der Nähe des Brustbeins mit der Schere und sezieren Sie sorgfältig die Zwischenrippenmuskeln zu, bis eine komplette linke Thorakotomie durchgeführt wurde. Tritt eine Blutung aus der vorderen Brust-Arterie, mit einem europäischen komprimieren Sie und verbinden Sie die Arterie.
- Legen Sie einen Retraktor zwischen dem Brustbein und der besteht und zu öffnen Sie, um eine gute Operationsfeld zu bekommen. An der Spitze des Feldes ist die Thymusdrüse in der Aorta und der pulmonalen Stamm. Sorgfältig mit einem europäischen Thymus heben Sie und drehen Sie sie nach oben um die Aorta und die pulmonale Stamm unten offen zu legen.
-
Führen Sie die Spitze des einen kleinen chirurgischen Hooklet mit 85° Winkel durch den transversalen Herzbeutel Sinus befindet sich hinter der linken atrial Appendage. Ziehen Sie es auf halbem Weg zurück durch den Sinus und führen Sie die Spitze des Ohrbügels nach oben, bis es zwischen der Aorta ascendens und der pulmonalen Stamm erscheint.
- Entfernen Sie alle Bindegewebe über die Spitze mit einer Iris-Schere um den pulmonalen Stamm aus der Aorta ascendens zu trennen.
- Wiederholen Sie den Schritt mit einem größeren Haken (optional).
- Führen Sie eine abgewinkelte Muskel Zange um den pulmonalen Stamm durch die Passage mit der Hook(s) gemacht. Schnappen Sie sich am Ende eine ca. 10 cm Ligatur (4-0, Multifilament) und ziehen Sie die Hälfte der Ligatur zurück durch die Passage. Jetzt die pulmonale Stamm ist getrennt von der Aorta ascendens und gesteuert werden, indem die Ligatur um ihn herum.
4. Anwendung des Clips
- Die bereinigte selbstligierendes Clip Klammer mit einem Clip zu laden. Führen Sie eines der Kiefer und einem Bein des Clips vorsichtig aber den Durchgang um den pulmonalen Stamm. Verwenden Sie die Ligatur um die pulmonale Stamm nach oben und in die Gabel des Clips ziehen.
- Wenn der pulmonale Stamm in der Gabel des Clips ist und die beiden Spitzen der Clip Beine frei von jeder Bindegewebe sind, komprimieren Sie den Clip mit der Klammer, die Streifenbildung anzuwenden.
- Beobachten Sie, wie die RV sofort als Reaktion auf die Streifenbildung weitet und entfernen Sie die Ligatur zu.
5. Abschluss des Thorax
- Entfernen Sie die europäischen aus dem Thymus und positionieren Sie Thymus an seiner natürlichen Position neu zu. Entfernen Sie die Aufrollvorrichtung.
- Schließen Sie den Brustkorb in drei Schichten: die Intercostalneuralgie Schicht, dem großen Brustmuskel und die Haut mit Naht (4-0, Multifilament, resorbierbaren). Spritzen Sie 2 mL Kochsalzlösung s.c., während der Operation verlorene Flüssigkeit zu ersetzen.
- Die Sevofluran ausschalten und und halten Sie die Ratte auf den Ventilator (1,5 L von O2) bis es beginnt spontan atmen. Dann Extubate der Ratte.
- Die Ratten mit Buprenorphin in das Trinkwasser für die folgenden drei Tage14 zu behandeln oder ein vergleichbares analgetische Protokoll anwenden. Nach drei Tagen die Ratten erholt haben und ohne Beschwerden.
- In den folgenden Wochen sollte das Wohlergehen der Ratten und mögliche Nebenwirkungen auf einer täglichen Basis bewertet werden. Die Heilung der Wunde von der Thorakotomie sollte besondere Aufmerksamkeit während der ersten Woche erhalten, um irgendwelche Anzeichen einer Infektion oder Insuffizienz der Narben zu erkennen. Wenn die Ratten einer Gedeihstörung einschließlich borstigen Fell, eingeschränkter Mobilität, Atmungsprobleme und Gewichtsverlust Anzeichen, sie sollten engmaschig überwacht und eingeschläfert, wenn sie mehr als 20 % ihres Körpergewichts verlieren oder entwickeln fulminante Atemwege Insuffizienz.
6. Sham Chirurgie
- Führen Sie eine Schein-OP folgen all die oben genannten Schritte, außer für die Anwendung des Clips (Schritt 4).
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Representative Results
Verwenden das beschriebene Verfahren der PTB in früheren Studien von unserer Gruppe12,13, induziert wir durch Streifenbildung mit einem 1,0 mm-Clip, ein gewisses Maß an RV scheitern (PTB moderate) durch Streifenbildung mit einem 0,6 mm-Clip und einem schweren Grad RV Hypertrophie (PTB mild) RV Verstoß (PTB schwere) mit einem 0,5 mm Clip Streifenbildung. Die Ratten, die schweren Streifenbildung entwickelten extra kardialen Manifestationen des RV Ausfall einschließlich Leberversagen und Aszites (Abbildung 5E) unterzogen. Alle Ratten wurden sieben Wochen nach der PTB ausgewertet und Sham Ratten unterzog sich dasselbe nur ohne die Anwendung des Clips. Perioperative Mortalität war weniger als 1 in 6. Sieben Wochen war Überlebensrate von 80 % für Ratten ausgesetzt zu schweren Streifenbildung und nahezu 100 % bei Ratten leichter oder mittelschwerer Streifenbildung oder Schein-Operation unterzogen.
Für die Bewertung der Auswirkungen der PTB-Verfahren verwendeten wir Echokardiographie sowie Kardiale Magnetresonanztomographie (MRT) RV Bände beurteilen und Herzleistung. Trikuspidalklappe ringförmigen Flugzeug systolischen Ausflug (NORMWERTE) wurde als der Abstand der Trikuspidalklappe ringförmigen Ebene mit der RV-Kontraktion in der apikalen Vierkammer-Ansicht gemessen. Durchschnittlich drei Zyklen außerhalb Atmung diente als repräsentativer Wert. RV End-diastolischen Volumen (EDV) und End-systolische Volumen (ESV) wurden abgeschätzt, indem neben der Endokards in einer Reihe von kurzen Achse Bilder durch die RV erhalten durch MRI für jede Ratte und RV Ejektionsfraktion (EF) berechnet als EF = (EDV-ESV) / EDV. Herzzeitvolumen wurde zwischen den pulmonalen Ventilen und den Clip unter Verwendung einer Phasenkontrast-MRT-Sequenz gemessen. Digitale Aufnahmen von RV Druck wurden durch einen Mikro-Tipp-Katheter in der RV vor Euthanasie installiert erhalten. Weitere Details zu den Methoden wurden12beschrieben. RV-Hypertrophie wurde als das Verhältnis von der RV Gewicht geteilt durch das Gewicht der linke Ventrikel (LV) plus Septum sowie das Gewicht des RV dividiert durch die Länge des Schienbeins, für die Größe der Ratte zu korrigieren bewertet. Alle Methoden wurden angewendet, wie zuvor beschrieben12.
In einer Woche hatte erhöhten Druck der RV und RV-Dysfunktion zeigt sich durch eine Abnahme der Herzleistung und NORMWERTE in der PTB-Ratten im Vergleich zu betriebene Ratten sham entwickelt. Dementsprechend können Interventionen oder pharmakologische Behandlungen bereits zu diesem Zeitpunkt eingeleitet, wenn eine Auswirkungen auf die etablierten RV Fehler untersuchen soll. Nach weiteren sechs Wochen hatte RV Druck weiter erhöht. Die Unterschiede des moderaten Vs der schweren RV Scheitern Phänotyps waren noch deutlicher gezeigt durch eine schrittweise Abnahme der Herzleistung und NORMWERTE mit erhöhter Schweregrad der Banding (Abbildung 2 und Abbildung 3). Detaillierten hämodynamischen Unterschiede zwischen PTB milde Ratten und PTB schweren Ratten 4 Wochen nach der Operation wurden durch unsere Gruppe gerne15veröffentlicht.
Die PTB-Verfahren auch verursacht RV Dilatation zeigt sich durch eine Erhöhung in RV EDV und ESV RV in die moderate PTB Ratten verglichen, um betriebenen Ratten sham und die schwere PTB-Ratten im Vergleich zu moderaten PTB und Sham. Eine schrittweise Abnahme der RV EF war auch gesehen (Abbildung 4).
Die Entwicklung des RV-Hypertrophie war verbunden, das Ausmaß der Drucküberlastung durch den Clip angewendet. Das Verhältnis von RV über die LV plus Septum Gewicht von Ratten mit einer milden Streifenbildung mit einem Clip von 1,0 mm über Ratten, die mit einem moderaten 0,6 mm Clip an Ratten, die mit einem schweren 0,5 mm Clip gebändert gebändert schrittweise erhöht. Ähnliche Ergebnisse wurden für die RV-Gewicht für die Größe der Ratte durch Division mit der Länge des Schienbeins korrigiert gesehen. Die Hypertrophie galt auch als eine Zunahme der Cardiomyocyte Kreuz Querschnittsfläche in der PTB-Ratten im Vergleich zu betriebene Ratten sham. Abgesehen von Hypertrophie der Kardiomyozyten induziert die Drucküberlastung auch andere morphologischen Veränderungen des RV RV Fehler einschließlich RV Fibrose zugeordnet. Bei Ratten schwere Streifenbildung ausgesetzt wurde dekompensierten RV-Versagen ausgelöst. Dieser Phänotyp war geprägt von Zeichen der rückwärts Versagen einschließlich Stauungsleber gesehen als eine dunkle Verfärbung der Leber. Stauungsleber begleitet wurde in der Regel von Aszites (Abbildung 5).
Abbildung 2: Auswirkungen der PTB eine Woche und sieben Wochen nach dem Eingriff. (A) rechts ventrikuläre (RV) systolischen Druck (B) Herzzeitvolumen und (C) Trikuspidalklappe ringförmigen Flugzeug systolischen Ausflug (NORMWERTE) eine Woche nach dem Schein oder PTB-Betrieb mit einer moderaten oder eine schwere Streifenbildung bzw. gemessen. (D, E und F) Der gleiche misst sieben Wochen nach dem Verfahren und der Weiterentwicklung der RV Fehler12. Daten als meine ± SEM One-Way ANOVA mit post-hoc-Bonferroni-Analyse vorgestellt. ** p < 0,01 *** p < 0,001 und *** p < 0,0001 PTB Vs Schein und PTB schwere Vs PTB moderat. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Auswirkungen der PTB-Verfahrens beurteilt durch Echokardiographie. (A) A Vertreter vier-Kammer-Blick und (B) Messungen der Geschwindigkeit Zeitintegral (VTI) in den pulmonalen Kofferraum (obere Abdeckung) und Trikuspidalklappe ringförmigen Flugzeug systolischen Ausflug (NORMWERTE) (untere Leiste) in eine Ratte Augenwischerei betrieben. (C und D) ähnliche Bilder für eine PTB-Ratte moderate Streifenbildung ausgesetzt. Alle Bilder sind sieben Wochen nach Schein-Operation oder Streifenbildung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Magnetresonanz-Bildgebung der PTB Ratten. Kardiale Magnetresonanztomographie (MRT) der PTB und Sham betrieben Ratten. (A) repräsentativen vier-Kammer-Bilder (obere Abdeckung) und kurze Achse Ansichten (untere Leiste) von Sham Ratten (links) und PTB Ratten mit ein gewisses Maß an RV-Versagen (rechts). Bei der PTB Ratte verursacht die hohen Drücke RV Septum prall (blaues Sternchen). (B) der PTB Verfahren induziert RV Dilatation offensichtlich durch eine Zunahme der RV Ende diastolische Volumen (EDV) und RV Ende systolischen Volumen (ESV). (C) RV Ejektionsfraktion (EF) verringerte sich12. Daten dargestellt als Mittelwert ± SEM einfache ANOVA mit post-Hoc -Bonferroni-Analyse. * p < 0,05, ** p < 0,01 und *** p < 0,0001 PTB Vs Schein und PTB schwere Vs PTB moderat. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: anatomische Daten und Histologie. RV-Hypertrophie gemessen als (A) RV dividiert durch das LV plus Septum und (B) RV Gewicht geteilt durch Tibia Länge von Ratten mit milden RV-Hypertrophie, moderate RV-Versagen und schweren RV Scheitern sieben Wochen nach dem Eingriff der PTB. (C) repräsentative Bilder der histologischen Abschnitte gebeizt mit Hematoxyline Eosine zur Messung von Cardiomyocyte cross Querschnittsfläche und (D) Picrosirius rote unter polarisiertem Licht für Fibrose von Sham Ratten (links) und PTB Ratten analysiert mit moderaten RV-Versagen (rechts). (E) A gesunde Leber (links) und eine verfärbte Leber mit Staus, die von einer PTB-Ratte mit schweren RV Fehler12,13(rechts). Daten als meine ± SEM One-Way ANOVA mit post-hoc-Bonferroni-Analyse vorgestellt. ** p < 0,01 und *** p < 0,0001 PTB Vs Schein, PTB moderate Vs PTB mild und PTB schwere Vs PTB moderat. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Wir beschreiben eine zugänglich und hoch reproduzierbare Methode zur pulmonalen Stamm Streifenbildung mit einer modifizierten selbstligierendes Clip Klammer um einen Titan-Clip um den pulmonalen Stamm komprimieren. Durch die Anpassung der Klammer um den Clip zu unterschiedlichen Innendurchmesser zu komprimieren, können unterschiedliche Phänotypen von RV-Hypertrophie und Ausfall einschließlich schweren RV mit extra kardiale Manifestation der Dekompensation induziert werden.
Trotz ihrer Einfachheit enthält das Protokoll ein paar wichtige Schritte. Wichtig ist, können nicht die Ratten zu groß sein, wenn sie die PTB-Verfahren zu unterziehen. Nach unserer Erfahrung sind Wistar Ratten Jungtiere mit einem Gewicht von 100 – 120 g für das Verfahren geeignet. Bei größeren Ratten kann Anwendung eine schwere Banding akuter RV-Versagen und Tod führen. Andere Studien6,7,8,9,10,16 haben hauptsächlich größere Ratten (160-260 g), sondern auch größere Durchmesser von ihren jeweiligen Bander (1,27-1,65 mm).
Die Anwendung von weniger schwere Banding könnte auch erklären, die relativ bescheidenen RV Druck berichtet von anderen Gruppen erhöht. Streifen mit einer 18 G führt Nadel (1,27 mm) zu RV systolischer Druck im Bereich von 70 – 90 MmHg6,7,8,9. In einer Studie6reichte dies nicht dazu führen, dass RV Fibrose oder reduzieren Herzleistung. Hier berichten wir über RV Druck von ca. 90 MmHg für eine moderate Streifenbildung und 110 MmHg für eine schwere Streifenbildung. Mit einem schweren banding waren wir auch einen Phänotyp der dekompensierten RV Scheitern mit extra kardiale Manifestationen, einschließlich hepatische Staus und Aszites12zu erstellen. Pulmonale Stamm Streifenbildung durch Ligatur mit einer 20G-Nadel (0,902 mm) verursachte Leberfibrose, Muskat-wie Leber Staus und Aszites in Sprague-Dawley Ratten16 trotz der relativ milden Verengung im Vergleich zu unserer Studie. Dies kann durch verschiedene Ratte Stämme reagieren unterschiedlich auf die Streifenbildung erklärt werden. Es gibt erhebliche Unterschiede in Bezug auf Stoffwechsel17, adrenerge Ton und Herzfrequenz18 Ratte Stämme. Sogar innerhalb der gleichen Ratte Stamm können verschiedene Eigenschaften einschließlich Wachstumsrate mit verschiedenen Anbietern19variieren. Dies sollte immer berücksichtigt werden. Für die spezifischen Ratte Sorte verwendet ist es daher wichtig, dass gut konzipierte Pilotstudien durchgeführt werden, um festzustellen, die Streifenbildung Durchmesser und die Follow-up-Zeit für den gewünschten RV Scheitern Phänotyp zu entwickeln. Das Clip-Modell einsetzbar potenziell beim Neugeborenen Ratten im Gegensatz zu der Ligation Technik früher20, aber wir haben keine Erfahrung mit diesem und die gleichen Überlegungen wie erwähnt oben gilt vor der Einleitung einer Studiums.
Die PTB-Modell hat ein paar Einschränkungen. Erstens stellt sehr proximale Okklusion durch den Clip um den pulmonalen Stamm die Bedingungen der pulmonic Stenose oder CTEPH mehr als die distalen Verengung der die kleineren Lungenarterien in Pak gesehen. Die Anpassung des RV, die erhöhte Nachlast variieren je nach der Lage der Obstruction(s)21. Zweitens bewirkt die Anwendung des Clips während der Operation eine sehr plötzliche in RV Nachlast anders als die schrittweise Erhöhung der pulmonalen Gefäßwiderstand in Pak. Der Vorgang erfolgt jedoch in Ratte Absetzern (100 – 120 g), die zu einer zunehmend erhöhte RV Nachlast bezogen auf Ihr Körpergewicht mit dem Wachstum der Tiere. Zur Zeit der sieben Wochen nach der Operation das Körpergewicht der Ratten erhöht sich etwa um das Vierfache und damit relative RV Nachlast erhöht proportional induzieren eine fortschreitende Krankheit Entwicklung6.
Mit einer modifizierten selbstligierendes Clip Klammer und eine Titan-Clip für Streifenbildung des pulmonalen Stammes, konnten wir RV-Versagen zu induzieren. Die Methode hat mehrere Vorteile, einschließlich hohe Reproduzierbarkeit und die Möglichkeit der Schaffung andere Krankheit Schweregrade von milden RV-Hypertrophie dekompensierten RV-Versagen durch den Durchmesser des Streifenbildung Clips anpassen. Veränderung des Durchmessers um 0,1 mm führte zu deutlichen RV Scheitern Phänotypen von moderat bis hin und kompensiert RV Ausfall zu schweren und dekompensierten RV Genauigkeit von diesem pulmonary Trunk Streifenbildung Methode demonstrieren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von The Danish Council für unabhängige Forschung [11e108410], der dänischen Herzstiftung [12e04-R90-A3852 und 12e04-R90-A3907] und die Novo Nordisk Stiftung [NNF16OC0023244] unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17 G IV Venflon Cannula | Becton Dickinson, US | 393228 | Distal 2 mm of the needle have been cut off |
| 1 mL syringe + 26 G needle | Becton Dickinson, US | 303172 & 303800 | |
| 4-0 absorbable multifilament suture | Covidien, US | GL-46-MG | Polysorb, violet, 5x18" |
| 4-0 multifilament ligature | Covidien, US | LL-221 | Polysorb, violet, 98" |
| Buprenorphine | Indivior UK Limited | Local procurement, Temgesic 0.3 mg/mL | |
| Carprofene | ScanVet, DK | 27693 | Norodyl 50 mg/mL |
| Chlorhexidine | Faaborg Pharma, DK | Local procurement | |
| Contractor | Aesculap, Germany | BV010R | Blunt, self retaining, 70 mm |
| Ear Hooklet | Lawton, Germany | 66-0261 | Small, 14 cm, tip modified to an angle of 85° |
| Eye gel | Decra, UK | Lubrithal, Local procurement | |
| Forceps, Delicate Tissue | Lawton, Germany | 09-0020 | |
| Forceps, Dissecting | Lawton, Germany | 09-0013 | 1 regular, 1 with tip modified to an angle of 100° |
| Gas Anesthesia System | Penlon Limited, UK | SD0217SL | Sigma Delta Vaporizer |
| Hair trimmer | Oster | 76998-320-051 | |
| Horizon Open Ligating Clip Applier | Teleflex, US | 137085 | Modified with adjustable stop mechanism |
| Horizon Titanium Clips | Teleflex, US | 001200 | Small |
| Induction chamber | N/A | ||
| Iris Scissor | Lawton, Germany | 05-1450 | |
| Iris Scissor | Aesculap, Germany | BC060R | |
| Mechanical ventilator | Ugo Basile, Italy | 7025 | |
| Microscissor | Lawton, Germany | 63-1406 | |
| Microscope | Carl Zeiss, Germany | 303294-9903 | |
| Needle Holder | Lawton, Germany | 08-0011 | TITEGRIP |
| Pean | Lawton, Germany | 06-0100 | Halsted-Mosquito, straight |
| Pro-Optha | Lohmann & Rauscher, Germany | 16515 | Tampon |
| Saline 9 mg/mL | Fresenius Kabi, DK | 209319 | |
| Sevoflurane | AbbVie, US | Sevorane, Local procurement | |
| Surgical hook | Lawton, Germany | 51-0665 | Cushing, 19 cm, tip modified to an angle of 90° |
| Surgical Tape | 3M, US | 1530-0 | Micropore |
| Temperature Controller | CMA Microdialysis; Sweden | 8003760 | CMA 450 |
| Weighing machine | VWR, US | ||
| Wistar rat weanlings | Janvier Labs, France | RjHan:WI, 100-120 g |
References
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