Electrofisiología de células enteras de células enterocromafines murino cultivadas primario

Summary

Las células enterocromafines (EC) constituyen un subconjunto pequeño de las células epiteliales gastrointestinales. CE las células son eléctricamente excitables y liberación de serotonina, sin embargo, las dificultades en el cultivo y la identificación de células EC limitada estudios fisiológicos. El método presentado aquí establece un modelo de cultivo primario susceptible de examen de las células EC por electrofisiología.

Abstract

Las células enterocromafines (CE) en el epitelio gastrointestinal (GI) constituyen la mayor subpoblación de células enteroendocrinas. Como las células sensoriales especializadas, células CE sensación estímulos luminales y convierten en eventos de lanzamiento de la serotonina (5-hyroxytryptamine, 5-HT). Sin embargo, la electrofisiología de estas células es mal entendido porque son difíciles para la cultura y para identificar. El método presentado en este papel contornos primaria CE los cultivos celulares optimizado para electrofisiología celular único. Este protocolo utiliza un reportero de la proteína fluorescente ciánica transgénicos (PPC) para identificar células de ratón CE en cultivos primarios mixtos, avanzar en el enfoque a la obtención de grabaciones de alta calidad de electrofisiología celular todo en modos de voltaje y corriente abrazadera.

Introduction

Epitelio gastrointestinal (GI) es una comunidad diversa que consta de varios tipos celulares. Enteroendocrinas células constituyen aproximadamente el 1% de todas las células epiteliales y células enterocromafines (CE) son el más grande células enteroendocrinas población¹. Estudios recientes muestran que enteroendocrinas² y CE^3,4 células eléctricamente excitables. Estamos interesados en la comprensión de electrofisiología de la célula de primaria CE. Así, el propósito de este estudio fue establecer cultivos primarios de células de CE optimizados para electrofisiología celular todo.

Célula de CE existente líneas que producen y secretan 5-HT (p. ej., QGP-1⁵, BON⁶, KRJ-1⁷) y se han utilizado para estudiar la electrofisiología^5,8 se generan típicamente de inmortalizó neoplásicas tejidos. Mientras que la información obtenida de estas líneas celulares es valioso^5,8, estudios de electrofisiología celular primaria son necesarios para entender correctamente fisiología de la célula de CE. La electrofisiología de las células primarias de la CE requiere el aislamiento y cultivo de células epiteliales, que se ha visto limitada por la baja viabilidad de cultivos epiteliales.

El método de cultura presentado en este estudio se basa en ratones transgénicos con fluorescencia marcado CE las células, como Tph1-CFP⁹, utilizado en este estudio. El método optimiza la primaria mixto epiteliales culturas desarrollaron previamente^2,10 de unicelular electrofisiología³. Los métodos anteriores utilizan combinaciones de tripsina/EDTA más A de colagenasa o EDTA y TDT para la digestión enzimática y utilizan gradientes de densidad para aislar específicamente y la cultura de conejillo de Indias¹¹ y rata de células CE¹². Más recientemente, organitas intestinales generaron y mecánicamente interrumpió las grabaciones electrofisiológicas⁴. Culturas mediante estos métodos son adecuadas para serotonina liberar experimentos, análisis de RT-qPCR y, aunque podría utilizarse para electrofisiología, dependen el éxito de la generación de organoide desperdiciador de tiempo, gradientes de densidad para identificar células de CE y la celulares efectos perturbadores de la tripsina y EDTA. Por el contrario, el protocolo descrito aquí mejora tratamientos enzimáticos y mecánicos, optimiza las condiciones de cultivo y agiliza los procedimientos para producir células CE únicas y saludables adecuadas para los estándares celulares necesarios para electrofisiología.

Este método será útil para los científicos que desean trabajar en las células primarias de EC en cultivos mixtos en lugar de culturas inmortalizadas y quieren investigar la electrofisiología de las células. Sin embargo, puede resultar menos adecuada para el estudio de poblaciones de células que necesitan cultivos de clasificación o a largo plazo que requieren supervivencia pasado 72 h.

Protocol

Todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC) de la Clínica Mayo. La porción de la cultura de célula primaria de este protocolo se basa en métodos previamente publicados que se pueden hacer referencia para más detalles¹⁰. Todos los procedimientos experimentales deben ser aprobados por el (IACUC), y todos los experimentos deben realizarse con arreglo a las normas y directrices pertinentes.

1. cultura preparación

1. Los medios de comunicación.
   1. Preparar CE celular completo medios de cultivo con glucosa alta [4500mg/L] Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 5% de suero bovino Fetal (FBS), 1% L-glutamina y 1% penicilina-estreptomicina (tabla 1).
      Nota: Los medios de comunicación pueden almacenarse a 4 ° C hasta por un mes.
   2. Los medios de cultivo completado CE célula del filtro y coloque 25 mL de medio en un tubo de 50 mL a 37 ° C.
   3. Preparar medios de digestión con glucosa alta [4.500 mg/L] DMEM suplementado con 0,1% de seroalbúmina bovina (BSA) (tabla 1).
   4. Filtro de los medios de comunicación de digestión y colocar cuatro alícuotas de 10 mL de medio en tubos de 50 mL separados e incubar en un baño de agua de 37 ° C.
      Nota: Los medios de comunicación pueden almacenarse a 4 ° C hasta por un mes.
2. Enzima.
   1. Pesar 4 mg (yeyuno) o 24 mg (dos puntos) de colagenasa XI [≥800 unidades/mg] en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
      Nota: Colagenasa es estable a-20 ° C hasta por un año.
   2. Resuspender la colagenasa alícuota de 1 mL de PBS frío hielo con Ca^{2 +} y Mg^{2 +}. Vórtice la solución bien combinar, y coloque en hielo.
3. Revestimiento placas.
   1. Descongele los 150 μL de matriz extracelular durante la noche a 4 ° c en hielo.
   2. Hacer una solución de matriz extracelular 5% w/v al mezclar 100 μl de matriz extracelular descongelada con 2 mL de DMEM libre de suero glucosa alta helada.
      Nota: Matriz extracelular se solidifica a temperatura ambiente y debe ser manejada con pipetas previamente enfriadas, tubos y medios de comunicación hasta platos de capa.
   3. Inmediatamente recubra el círculo de vidrio de platos de fondo de cristal de 35 mm con 250 μl de la solución de la matriz extracelular de 5%. Esta receta cubrirá hasta 8 platos.
   4. Coloque los platos de fondo de cristal en una incubadora de 37 ° C durante los pasos restantes de aislamiento de la cultura de célula. La matriz extracelular tiene un mínimo de 1 h a establecido pero puede incubarse hasta 2,5 h mientras se realizan otras medidas de aislamiento.
      Nota: Más tiempo 3 h puede crear una acumulación de matriz extracelular que puede impedir las incubaciones sello formación en electrofisiología celular todo.

2. tejido aislamiento

1. Según las pautas éticas, sacrificar un 3Para 6 semanas de edad hombre o mujer Tph1-CFP transgénicos ratón (los valores de laboratorio de Jackson: 028366)⁹ u otra cepa de reportero.
   Nota: Utilizamos una dosis fatal de aumento de los niveles de dióxido de carbono y una luxación cervical como medio secundario para asegurar la muerte. El Comité de AVAM sobre la eutanasia también considera la dislocación cervical un método de eutanasia primaria permitida por individuos entrenados en su uso si los animales están sedados primero.
2. Pin el ratón eutanasia hacia fuera en una etapa de la disección de la espuma de poliestireno utilizando una aguja de 21 G. Descontaminar el abdomen de ratón con etanol al 70%.
3. Tire de piel de ratón tenso con unas pinzas de disección micro (#5) y luego usar sharp tijeras quirúrgicas para hacer una incisión transversal en la parte inferior del abdomen para exponer la cavidad intraperitoneal ratón. Hacer otra incisión vertical hasta el abdomen hasta que la caja torácica está expuesta.
4. Utilice las pinzas de disección micro para mover el ciego a la izquierda del ratón para obtener una visión clara de los dos puntos.
5. Utilice las tijeras de disección micro para cortar la porción más distal del colon (pero todavía proximal al recto) y hacer un segundo corte distal hasta el estómago. Lugar los intestinos extraídos en un 100 x 15 mm² caja de Petri con 20 mL de helado fosfato tampón salino (PBS).
6. Utilice una pequeña regla para medir y cortar 10 cm de cualquiera medio colon o yeyuno. Extraer dos puntos midiendo el segmento de 10 cm de intestino situado proximalmente al primer corte tomado por encima del recto. Identificar el yeyuno doblando el intestino entero por la mitad y hacer una primera incisión en el punto medio y una segunda incisión de 10 cm proximal a la primera corte.
   Nota: Seguir para llevar a cabo todas las medidas de aislamiento posterior en el hielo.
7. Llene una jeringa de 6 mL con PBS frío hielo y colocar la aguja de la jeringa en el lumen del segmento intestinal extraído. Utilice las pinzas de disección micro para fijar y sellar los intestinos alrededor de la aguja de la jeringa y suavemente enjuague 10 mL de PBS a través del lumen para enjuagar a materia fecal.
8. Para invertir el tejido intestinal suavemente tejido el fórceps de disección micro a través del lumen, pellizcando una pared intestinal, y contracción del tejido proximal a la punta de las pinzas. Repita este proceso hasta que el segmento es de adentro hacia fuera con la luz hacia afuera.
9. Utilice tijeras de disección micro para cortar el segmento de tejido en trozos de 1 cm.
10. Utilizar pinzas de disección micro para transferir los segmentos de tejido en un vaso de precipitados de 50 mL con 5 mL PBS estéril. Utilice las tijeras de disección micro para picar las piezas de tejido con una consistencia licuada.
11. Coloque el tejido picada y 15 mL de PBS frío de hielo en un tubo de 50 mL limpio con una pipeta de transferencia. Triturate 2 veces con la pipeta, esperar a que el tejido colocar, retirar 15 mL del sobrenadante de PBS y colocar con PBS fresco. Repita este proceso tres veces hasta que el PBS es claro.
12. Coloque el tubo de 50 mL con piezas de tejido lavado sobre hielo y el cubo de hielo en una campana de cultivo de tejidos.

3. enzimática y mecánica de la digestión

1. Primera digestión
   1. Desde el baño de agua, recuperar uno de los tubos de 50 mL que contiene 10 mL de medio de digestión precalentado. Al tubo de 50 mL, Añadir 250 μl de la solución de PBS colagenasa y piezas de tejido intestinal picada.
      Nota: tenga cuidado para evitar incluso cualquier PBS desde pasos anteriores de lavado.
   2. Coloque el tubo de 50 mL en un baño de agua durante 5 minutos (colon o yeyuno) a 37 ° C. Agitar el tubo de 2 x por minuto.
      Nota: La sincronización óptima y la intensidad de la digestión mecánica pueden variar y deberán ser determinada por el usuario. Para determinar las condiciones de digestión óptima, una alícuota de 10 μl de las células puede verse después de cada digestión. Durante la digestión de 1, el sobrenadante debe consistir en grupos de células.
   3. Triturate lentamente el tejido una vez con una pipeta serológica de 10 mL. Brevemente deje el tejido colocan piezas, entonces utilizar una pipeta para extraer el entero 10 mL del sobrenadante.
2. Segunda digestión: Repita los pasos del 3.1.1 a 3.1.3. Aumentar el tiempo de incubación de 10 min si digerir colon y mantener el tiempo de incubación a 5 min de yeyuno.
   Nota: A observación, el sobrenadante debe todavía consisten en grandes masas de células.
3. Tercer digestión
   1. Repita el paso 3.1.1
   2. Coloque el tubo de 50 mL en un baño de agua de 37 ° c durante 10 min (colon o yeyuno pequeño). Agitar el tubo de 2-3 veces por minuto a una intensidad más alta que las digestiones 1 y 2.
   3. Lentamente Pipetee el tejido hacia arriba y hacia abajo con una pipeta serológica de 10 mL. Deje que las piezas de tejido colocar para un a corto plazo.
      Nota: El sobrenadante debe consistir en una combinación de las células y grupos pequeños.
   4. Utilizar una pipeta Coloque 10 mL de sobrenadante en un nuevo tubo de 15 mL, agregar 2 mL caliente CE la célula completado de medios de cultivo y una vez invierta para mezclar.
   5. Vuelta a 100 x g por 5 min a temperatura ambiente y luego utilizar una pipeta para remover el sobrenadante. Utilizar una pipeta para Resuspender el precipitado quedado en 2,5 mL caliente CE la célula completado de medios de cultivo.
4. Cuarta digestión: Repita los pasos del 3.3.1 al 3.3.5. Aumentar el tiempo de incubación a 15 min de colon y permanecer a 10 min de yeyuno.
   Nota: Ahora debe consistir el sobrenadante de células individuales.

4. cultivo celular

1. Utilizar una pipeta para combinar las suspensiones de células recogidas de digestiones 3 y 4 en un nuevo tubo de 15 mL (5 mL de volumen total).
2. Sacar una alícuota de 10 μl de las células a contar con un hemocitómetro y centrifugar la suspensión de células restantes a 100 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
   Nota: La suspensión de la célula final consistirá en grupos pequeños y células.
3. Quite el sobrenadante con una pipeta de transferencia y resuspender el precipitado en CE celular completo medios de cultivo a una densidad de 1.000.000 de células por mL.
   Nota: El volumen final de la suspensión celular dependerá de la cuenta final de la célula. Célula típica cuenta entre 2.000.000 y 4.000.000.
4. Quitar platos de cultura cubierto-fondo de cristal de la incubadora. Utilice una pipeta P1000 para reemplazar la matriz extracelular de cada placa de cultivo con 250 μl de la suspensión definitiva de la célula.
   Nota: Capa de matriz extracelular tiende a pegarse a los bordes del plato de fondo de cristal. Debe tenerse cuidado especial para quitar la capa de borde para evitar la acumulación de gel.
5. Hacer una solución de inhibidor Y-27632 de la roca en 1 mM. Añadir 2,5 μl de solución stock a cada plato de fondo de vidrio para lograr una concentración de trabajo del inhibidor de roca de 10 μm en cada plato.
   Nota: Este paso es crítico para la supervivencia de las culturas de yeyuno pero es opcional para el colon.
6. Colocar cada placa de cultivo en un incubador de₂ CO 37 ° C y 5% por 24 a 72 h (figura 1).

5. preparación de células CE para todo celular electrofisiología

1. El diámetro interno de la platina del microscopio con dos tiras de 5 x 0.5 cm de la película de cera para crear una junta tórica de la línea. Monte la placa de cultivo celular de 35 mm dentro de la junta tórica (figura 2A-B).
2. Enjuague ambos desechos flotantes, como matriz extracelular independiente o células muertas y medios de cultivo suero completamente fuera de las células de la CE para impedir o de obstaculizar el sello de formación entre la célula de la CE y el electrodo. Uso de las tres siguientes opciones para lograr la completa celular lavado suficiente para electrofisiología:
   1. Opción 1: Intercambio de solución es más eficiente en una cámara mucha más que una circular del compartimiento. Puesto que las células EC fueron cultivadas en platos redondos de 35 mm, crear un inserto plástico elíptico para el plato.
      1. Crear el inserto por la impresión en 3D o por métodos de molienda tradicional. El inserto que fue molido de plástico acrílico con las siguientes dimensiones (en mm): diámetro externo, 34,5; elipse interior, 20 x 9; altura exterior, 10; altura interior, 1.5; palmo de la puente, 3 x 3; separación de la puente, 1.5; entrada y salida, 4 x 4 cada uno.
      2. Bajar el inserto en la placa de cultivo (figura 2A-B) y asegúrelo a la parte superior de la platina del microscopio con dos piezas de 0.15 a 0.2 g de plastilina en 1.2 x 0.3 x 0,1 rectángulos cm (figura 2A-C).
      3. Con una pipeta de plástico, agregue lentamente solución extracelular a un lado del plato (entrada) y aspiración desde el otro lado (salida).
   2. Opción 2: Sin un inserto plástico dirigido, Agregar solución extracelular pipeta de transferencia de un lado del plato (entrada) y aspiración desde el lado opuesto (salida). Gire lentamente la situación de la pipeta de transferencia (por ejemplo, N e a S) mientras que refleja la colocación de la aguja de aspiración en el lado opuesto (por ejemplo, S w a N).
   3. Opción 3: Matriz extracelular de la capa sobre cubreobjetos rectangulares en paso 1.3.3. y la suspensión de células en estos cubreobjetos en paso 4.4 de la cultura. Transferir este cubreobjetos a una cámara rectangular llenada con la solución extracelular, omitiendo el paso 5.1 y saltar paso 5.3. Enjuague el compartimiento con la solución extracelular de una pipeta de plástico, como se describe en la opción 1 (5.2.1.3).
3. Vuelva a colocar la etapa con el cultivo celular sobre el microscopio invertido (figura 2D). Incubar el cultivo celular de CE en la solución extracelular libre de suero a temperatura ambiente.
4. Después de 4 horas, enjuague la cultura otra vez con la solución extracelular como se describió anteriormente. Proceder con electrofisiología de células enteras.

6. toda célula electrofisiología de CE células de cultivo primario

1. Lograr un sello de Giga de células enteras
   1. Tire una docena de electrodos a una resistencia de 1 a 5 MΩ.
      Notas: Pipetas de resistencia MΩ de 1-2 10-100 GΩ sellos que funcionar mejor. No es necesario para lograr sellos GΩ fuego pulido las puntas de los electrodos.
   2. Aplique uniformemente el cono de nariz de pipetas todos con polímero. Sostenga la pipeta horizontal al suelo y perpendicular al frente de una pistola de calor. Gire lentamente la pipeta hasta que el polímero se endurece.
   3. Vierta una parte alícuota de la solución intracelular en un tubo cónico de 15 mL. Transferencia de 1,2 mL de esta solución en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL por jeringa de 1 mL. Retirar otros 0,7 mL de solución intracelular en la jeringa. Disipar el aire desde el extremo de la jeringa. Fije un flexible 34 G, aguja de 67 mm a la jeringa y eliminar todo el aire restante de esta aguja.
   4. Identificar un Tph1-PPC + célula que no está en contacto con otras células o restos.
   5. Llene la punta del electrodo con la solución intracelular. Rellene la pipeta por la jeringuilla. Flick con cuidado la pipeta con una uña para disipar la interfaz de burbuja de aire.
   6. Con el émbolo con 0.3 mL de aire, acople una jeringa de 6 mL a la salida del titular de la tubería. Montar el electrodo en el soporte.
      Nota: Conecte la jeringa a la tubería antes de que el electrodo entra en la solución del baño para mantener la presión neutra o positiva en la solución intracelular antes del sellado.
   7. Un protocolo de pinza de voltaje de dos etapas que registra corrientes activadoras estacionaria por una escala de tensión en el primer paso y graba las corrientes disponibles de una sola tensión en el segundo paso de la carga. Abrir la prueba de sello (5 mV a 50 kHz).
   8. Bajar el electrodo en la solución del baño. Con los micromanipuladores, maniobrar el electrodo punta en plano horizontal directamente y con de la célula. Expulsar a los 0,3 mL de aire de la jeringa.
   9. Mueva suavemente el electrodo horizontal a lo largo del eje x a la celda. Tenga cuidado con un hoyuelo que aparecen en la celda de CE o un aumento en la resistencia de la membrana en la prueba de sello. Si es necesario, vuelva a ajustar el electrodo hacia abajo a lo largo del eje z u horizontalmente a lo largo del eje x, no se ha movido más allá de la línea media de la célula.
   10. Aplicar 0,1 – 0,2 succión de mL en la jeringa de 6 mL. Sujete firmemente el émbolo hasta MΩ 100, luego suelte el agarre del émbolo. Espere a que la celda al sello de giga. Desconecte suavemente la jeringa con un movimiento de desenroscado.
       Nota: Si una célula CE no sellar inicialmente, podría ser posible volver a sellar con un intento posterior. Para ello, tire suavemente el electrodo de una celda de CE con < 20 resistencia de sello MΩ. Manejo el electrodo gastado con los micromanipuladores, circunnavegar la célula específica CE matriz manualmente claro lejos o escombros. Entonces, intento para sellar la celda CE con un electrodo nuevo.
2. Registro celular todo voltaje-bloqueado Na⁺ actuales.
   1. Conecte una jeringa de 3 mL con 0.5 – 1.0 aire mL. Aplique un toque rápido de aspiración (0.1 – 0.5 mL) en una jeringa de 3 mL. Repetir hasta logra el acceso de células enteras, luego desconecte suavemente la jeringa.
      Nota: el rendimiento de una jeringa puede variar inicialmente y cambian gradualmente con el tiempo y uso, práctica con la jeringa de 3 mL (sellado al final con un dedo índice) para asegurar que el émbolo retrocederá en 0,1 – 0,2 mL de su a partir de la posición. Si no, entonces cambio la jeringa para una nueva.
   2. Activar compensación de capacitancia de células enteras. Ajuste resistencia capacitancia y serie. Activar compensación de resistencia de la serie. Con retraso de 60 ms, ajuste prevista entonces corregida la compensación de resistencia serie. Cerca de la prueba de sello.
   3. Registrar un promedio de 5 funcionamientos de la corriente de Na⁺ voltaje de célula entera (figura 3A).
   4. Rápidamente tome nota de dos parámetros de la corriente de Na⁺ voltaje: el voltaje en la ventana actual (figura 3B, símbolos rojos, la intersección de las curvas de activación e inactivación de estado estable) y la corriente máxima de Na⁺ densidad.
      Nota: Células de CE con corrientes de pico Na⁺ más pA-50 en modo de pinza de voltaje comúnmente pasarán a fuego potenciales provocó en el modo actual de la abrazadera. Además, corrientes mayores de pA-200 en la abrazadera de tensión (figura 3A) entonces generalmente disparar potenciales de acción espontáneamente en pinza de potenciales de membrana (línea roja, figura 3D) cerca de la tensión de la ventana actual (símbolos rojo, figura 3B).
3. Registro produce potenciales de acción.
   1. Desactivar la compensación de la resistencia de la serie. Desactivar el comando externo. Cambiar el modo de V-clamp-Abrazadera. Ajuste de la ganancia. Cargar un protocolo actual episódica de la abrazadera. Ajustar el nivel de explotación actual a 0 PA. Activar el comando externo.
      PRECAUCIÓN: No cambie de V-clamp-Abrazadera (o viceversa) sin apagar primero el comando externo.
   2. Tenga en cuenta el potencial de membrana de reposo. Ajustar la explotación actual de la entrada para que el potencial de membrana se lee debajo de la ventana actual (por ejemplo, -80 a -100 mV). Ajuste el protocolo actual episódica de la abrazadera de modo que el intervalo de paso de entrada de corriente es menor que el valor de la explotación actual (figura 3C detalle, + 2 pasos de pA para pA-3 tenencia actual).
   3. Registro produce potenciales de acción. Tenga en cuenta la menor cantidad de corriente inyectada para disparar un potencial de acción (figura 3C, 3 de 5, un paso pA + 4 de pA-3 manteniendo de barrido = pA + 1).
4. Registrar los potenciales de acción espontáneos.
   1. Desactivar el comando externo. Cargar un protocolo de abrazadera actual boquete-libre (no episódico).
      Nota: No vuelva a encender el comando externo hasta que la cantidad de mantener corriente en el protocolo actual de boquete-libre de la abrazadera ha sido verificada para ser conveniente para la célula.
   2. Cambiar la explotación actual a ser la cantidad de corriente inyectada en el último barrido en el protocolo provocó que no dispara un potencial de acción (figura 3D, la entrada de la corriente durante el segundo, un paso + 2 pA de pA-3 manteniendo = pA-1).
   3. Activar el comando externo. Comprobaremos que la celebración prevista actual trae el potencial umbral para disparar un potencial de acción de membrana. Ajustar la explotación actual si es necesario. Registro actividad espontánea.

Results

Culturas:
Las células epiteliales murinas primarias de un modelo transgénico de Tph1-CFP fijar a los platos después de 4 horas y están listas para experimentos fisiológicos entre 24 a 72 h. Cuando las condiciones de cultivo no habían sido optimizadas, la cultura de célula epitelial consistió en grumos grandes, flotante y detritos celulares, membranas dañadas y señal débil del PPC en las células de la CE (figura 1A). Cultur...

Discussion

Comprender cabalmente la función de la célula CE requiere un método de cultivo primario de alta calidad para generar células para electrofisiología de células enteras. Cultivos primarios de epitelio GI tradicionalmente han sido difíciles debido a la baja supervivencia. Aliviar este factor de confusión, el presente método rendimientos de cultivos de células CE singular del intestino pequeño o grande que son capaces de sobrevivir durante varios días.

Encontramos que los siguientes eran críticos ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Placa de cultivo de 100 mm x 15 mm	Corning (Falcon)	351029
Pipeta de transferencia	Fisherbrand	13-711-7M
Pipeta serológica de 10 mL	Corning (Falcon)
50 mL Cónico	Corning (Falcon)
15 mL Cónico	Corning (Falcon)
Puntas de pipeta de barrera de 1.000 ml	Thermo Scientific (Art)	2079E	Mantener estériles
MatTek Platos con fondo de vidrio MatTek	Corporation	P35G-1.5-14-C	Mantener estériles
Pinzas de microdisección: muy finas, puntas extralargas	Herramientas de ciencia fina	SB12630M
tijeras quirúrgicas-afiladas	Nasco	14002-14
Tijeras de microdisección	Nasco SB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BX	Covidien	8881250172
Tg(Tph1-CFP)1Able/J Ratones	Jackson	Stock # 028366	Utilice ratones machos o hembras de entre 4 y 7 semanas
Agujas de jeringa no metálicas Microfil (calibre 34, 67 mm)	World Precision Instruments	MF34G-5
Parafilm "M" Película	laboratorio Pechiney Embalaje
R6101	Dow Corning Jeringa
6 mL con punta luer regular	Jeringa Monoject
de 3 mL con punta Luer regular
>fuerte Molecular Devices Axopatch 200B Sistema de adquisición >de datos (daq)Molecular Devices Digidata 1440A Acondicionador de
	Software	CyberAmp 320
	Molecular Devices pClamp	10.6