Base de placa de cultivo a gran escala de elegans de Caenorhabditis: preparación de muestras para el estudio de alteraciones metabólicas en la Diabetes

Resumen

Este protocolo describe un método para el cultivo a gran escala de Caenorhabditis elegans en medios sólidos. Como alternativa a la cultura líquida, este protocolo permite la obtención de parámetros de diferentes escalas basadas en la placa de cultivo. Esto incrementa la comparabilidad de los resultados, omitiendo las diferencias morfológicas y metabólicas entre la cultura de los medios líquidos y sólidos.

Resumen

Cultivo de Caenorhabditis elegans (C. elegans) de manera a gran escala en placas de agar puede ser desperdiciador de tiempo y difícil. Este protocolo describe un método sencillo y económico para obtener un gran número de animales para el aislamiento de proteínas para proceder con una mancha blanca /negra occidental, espectrometría de masas o análisis de proteómica más. Además, un aumento del número de nematodos para immunostainings y la integración de múltiples análisis en las mismas condiciones de cultivo pueden fácilmente lograrse. Además, se facilita una transferencia entre placas con diferentes condiciones experimentales. Técnicas comunes en la cultura de la placa implican a la transferencia de un solo C. elegans mediante un alambre de platino y la transferencia de agar poblada trozos con un bisturí. Sin embargo, con el aumento del número de nematodos, estas técnicas se convierten en demasiado tiempo. Este protocolo describe el cultivo a gran escala de C. elegans incluyendo numerosas medidas para minimizar el impacto de la preparación de la muestra sobre la fisiología de la lombriz. Líquido y la tensión de esquileo pueden alterar la duración de los procesos metabólicos en C. elegans, así requiriendo una descripción detallada de los pasos críticos para obtener resultados confiables y reproducibles. C. elegans es un organismo modelo, consistiendo en las células neuronales hasta la tercera, pero carece de vasos sanguíneos, proporcionando así la posibilidad de investigar únicamente neuronales alteraciones independientes de control vascular. Recientemente, neurodegeneración precoz en la retinopatía diabética fue encontrada antes de alteraciones vasculares. Así, C. elegans es de especial interés para el estudio de los mecanismos generales de las complicaciones diabéticas. Por ejemplo, una formación creciente de había avanzada glicación final (edades) y especies reactivas del oxígeno (ROS) se observaron, que se encuentran reproducible en C. elegans. Protocolos para manejar las muestras de tamaño adecuado para un espectro más amplio de investigaciones se presentan aquí, ejemplificado por el estudio de la diabetes inducida por alteraciones bioquímicas. En general, este protocolo puede ser útil para estudios que requieren gran C. elegans números y en que cultivos líquidos no es conveniente.

Introducción

Análisis de proteína, como un western blot o espectrometría de masas, requieren miligramos de proteína. Esta producción requiere de un cultivo a gran escala de cientos de C. elegans, que se pueden lograr cultivos líquidos o en medios sólidos transferencia de los nematodos por lavado. Líquido y la tensión de esquileo induce la expresión de canales de sodio epitelial (ENaC), que puede aumentar el estrés osmótico a través de una mayor absorción de sodio, potencialmente alterar la vida de C. elegans y afectar los análisis metabólicos¹ . Por lo tanto, algunos pasos críticos en este protocolo para el enfoque basado en la placa toman....

Protocolo

Nota: Este protocolo se divide en cinco secciones. En las secciones 1-3, se presenta el protocolo principal de cultura C. elegans en un a gran escala. Las secciones 4 y 5 proporcionan protocolos adicionales para la evaluación de metabolitos ejemplificadas en metabolitos diabéticas. En detalle, sección 1 describe una cultura general a gran escala en las placas. Sección 2 se centra en la transferencia de grandes cantidades de C. elegans, considerando que la sección 3 explica la recolección de una muestra a gran escala. Sección 4 explica el aislamiento de la proteína de la muestra y sección 5 describe la preparación de muestras para los análisis siguien....

Resultados

Aquí ejemplos de creación de una gran escala C. elegans cultura para aplicaciones en la investigación de la diabetes se presentan. Puede ser de interés para relacionarse con los parámetros de un solo animal, en lugar de normalizar la concentración de proteína total. En un análisis que requiere un pequeño número de nematodos, esto puede lograrse fácilmente por conteo de los nematodos. Para un a gran escala C. elegans la cultura que implican cientos de nematodos por grupo .......

Discusión

Este protocolo presenta un enfoque fiable para el cultivo a gran escala de C. elegans para obtener resultados cuantitativos. Los hallazgos de la literatura podrían repetirse tal como se muestra en los Resultados de representante. Aunque este protocolo para la recogida de muestras a gran escala de C. elegans parece un método sencillo, hay algunos riesgos a tener en cuenta. Con respecto a la sincronización de la población de nematodos, este protocolo describe un acercamiento por blanqueam.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
E. coli OP50	CGC	n/a
C. elegans N2	CGC	n/a
C. elegans CL2166	CGC	n/a
Placa de Petri, 60 mm x 15 mm	Greiner One	628161
Pipeta volumétrica, glas, 10 mL	Neolab	E-0413
Proteinasa Cóctel inhibidor de comprimidos	Roche	04693124001
Tampón de lisado no desnaturalizante:
Tris-HCl, pH 8	Sigma	T3253
Cloruro de sodio (NaCl)	Sigma	S7653
Triton X-100	Sigma	X-100
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Sigma	E5391
Placas de 96 pocillos, fondo transparente	Marca	781611
Infinite M200, lector de placas	Tecan	30017581
Perlas de óxido de circonio, 0,5 mm	Siguiente avance	ZROB05-RNA
Bullet Blender, homogeneizador	Siguiente avance	BBX24
Pepsina de mucosa gástrica porcina	Sigma	P6887
Timol	Sigma	T0501
Pronase E/ Proteasa de Streptomyces griseus	Sigma	P6911
Solución de penicilina-estreptomicina	Sigma	P43339
Prolidasa de riñón porcino	Sigma	P6675
Aminopeptidasa de Aeromonas proteolytica	Sigma	A8200
La unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-0.5	Merckmillipore	UFC501096
materiales básicos para el cultivo en placa se describen en la referencia 6.

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