Este protocolo describe un enfoque libre de calibración para cuantificación de proteína homo-Oligomerización en vitro basado en la espectroscopia de fluorescencia de fluctuación comercial luz microscopia. Se muestran los métodos de análisis y configuración correcta adquisición.
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Artículo de método
Calibración-libre In Vitro cuantificación de proteína Homo-Oligomerización utilizando instrumentación comercial y Software de análisis de brillo libre de código abierto
En este artículo
Resumen
Resumen
Número y el brillo es una técnica de espectroscopia (FFS) de fluctuación libre de calibración de la fluorescencia para la detección de proteína homo-Oligomerización. Pueden emplearse utilizando un microscopio confocal convencional equipado con detectores digitales. Un protocolo para el uso de la técnica de vitro se muestra por medio de un caso de uso donde se observan número y brillo para cuantificar con precisión el estado oligomérico de FKBP12F36V etiqueta de mVenus antes y después de la adición de la droga dimerizing AP20187. Se discuten la importancia de utilizar los parámetros de adquisición microscopio correctos y los métodos de preprocesamiento y análisis de datos correctos. En particular, se destacó la importancia de la opción de corrección de fotoblanqueo. Este método de bajo costo puede ser empleada para estudiar las interacciones de la proteína-proteína en muchos contextos biológicos.
Introducción
Proteínas interacciones n Vitro
Tradicionalmente, la cristalografía y resonancia magnética nuclear experimentos combinados con microscopia del cryo-electrón (cryoEM) son las tecnologías elegidas para describir con precisión la arquitectura tridimensional de las proteínas y deducir su función por escudriñando sus detalles estructurales de alta resolución. Proteínas, sin embargo, no son estructuras estáticas y pueden experimentar una variedad de cambios conformacionales y vibraciones en el tiempo y el espacio. Por esta razón estructural información cristalográfica o CryoEM datos deben comp....
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Protocolo
1. FKBP12 F36V - mVenus purificación
- Transformar (DE3) pLysS células con el vector de pET22b con monomerized humana FKBP12F36V12 y N-terminal His6 y mVenus etiquetas (vector disponible a petición). Células de la placa en agar LB suplementado con 50 μg/mL de ampicilina y cloranfenicol de 34 μg/mL.
- Transferencia de colonias transformadas en cultura de arrancador 100 mL LB y crecer para 16-20 horas a 37 ° C con agitación.
- Diluir la cultura de arrancador denso (OD600 > 1) 1: 100 en medio LB (lotes de 2 x 500 mL) y crecer de 2 a 3 horas para OD600 = 0.6 - 0.8 (37 ° C, 200 rpm).
- Culturas frescas en hielo. Induc....
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Resultados
Robustos y monomérico brillo
Una vez se ha adquirido los datos, uno puede iniciar los cálculos de brillo para determinar el estado oligomérico de la proteína de interés en la solución. Aunque el efecto de blanqueamiento en la solución no puede ser tan drástico como lo puede ser en vivo, el rastro de intensidad todavía probablemente no tendrá medio estacionario, posiblemente debido a los efectos de fotof.......
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Discusión
N & B es una técnica para detectar multimerization luz comercial exploración confocal microscopio equipado con detectores digitales. Este enfoque es bastante atractivo en comparación con único punto FCS, FCCS y smFRET porque es libre de calibración y el cálculo de brillo es sencillo y concentración independiente6. Es de gran importancia, sin embargo, para corregir las fluctuaciones de intensidad de blanqueo y a largo plazo antes de realizar cálculos de brillo9; un ligero in.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido apoyado por Wellcome Trust conceder 105278/Z/14/2 al R.N. El Wellcome Trust Centre para genética humana está financiado por Wellcome Trust base Premio 203852/Z/16/2. Trabajo en el grupo C.S. es financiado por Cancer Research UK (C20724/A14414) y el Consejo Europeo de investigación horizonte 2020 investigación y innovación programa de beca 647278 de la Unión Europea.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| RosettaTM (DE3) células pLysS | Novagen | 70956-3 | |
| Ampicilina | Sigma Aldrich | PubChem ID de la sustancia 329824407 | |
| Cloranfenicol | Sigma Aldrich | PubChem ID de la sustancia: 24892250 | |
| LB cultivo iniciador | QIAGEN | ||
| LB medio | QIAGEN | ||
| IPTG | Sigma Aldrich | PubChem Identificación de sustancias 329815691 | |
| tampón IMAC | Medicago | 09-1010-10 | |
| Inhibidores de proteasa sin EDTA | Sigma Aldrich | 11873580001 | |
| resina TALON | Clonetech | ||
| Níquel sefarosa | GE Healthcare | ||
| S200 16/60 columna | GE Healthcare | ||
| Fondo de cristal plato de observación de 8 pocillos | Ibidi | 80827 |
Referencias
- Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics. BioEssays. 40, (2018).
- Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M.
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Reimpresiones y permisos
