Neurogénesis con células de carcinoma embrionario P19

Resumen

La línea celular de carcinoma embrionario de ratón P19 (línea celular P19) es ampliamente utilizada para estudiar el mecanismo molecular de la neurogénesis con gran simplificación en comparación con el análisis in vivo. Aquí, presentamos un protocolo para la neurogénesis inducida por ácido retinoico en la línea celular P19.

Resumen

La línea celular P19 derivada de un teratocarcinoma derivado del embrión de ratón tiene la capacidad de diferenciarse en las tres capas germinales. En presencia de ácido retinoico (RA), la línea celular P19 cultivada en suspensión se induce a diferenciarse en las neuronas. Este fenómeno se investiga ampliamente como un modelo de neurogénesis in vitro. Por lo tanto, la línea celular P19 es muy útil para estudios moleculares y celulares asociados con la neurogénesis. Sin embargo, los protocolos para la diferenciación neuronal de la línea celular P19 descrita en la literatura son muy complejos. El método desarrollado en este estudio es sencillo y desempeñará un papel en la esclarecimiento de los mecanismos moleculares en anomalías del neurodesarrollo y enfermedades neurodegenerativas.

Introducción

Durante el desarrollo embrionario, una sola capa celular se transforma en tres capas de gérmenes separadas^1,2,3. Para aumentar las posibilidades de investigación de los fenómenos que ocurren in vivo, la generación de agregados tridimensionales (cuerpos embrionarios) se ha desarrollado como un modelo conveniente. Los agregados celulares formados de esta manera pueden ser expuestos a diversas condiciones que causan diferenciación celular, que reflejan el desarrollo del embrión^4,5. La línea celular de carcinoma embrionar....

Protocolo

1. Mantenimiento de la cultura

1. Cultivo de la línea celular P19 en medio de mantenimiento (medio eagle modificado de Dulbecco con 4.500 mg/L de glucosa complementada con 10% FBS, 100 unidades/ml de penicilina y 100 unidades/ml de estreptocina). Incubar a 37oC y 5% CO₂.

2. Células de cultivo sub-cultivo

1. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, retire el medio gastado de los matraces de cultivo celular (área de superficie 25 cm²).
2. Lavar las células con 2 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) libre de calcio y magnesio.
3. Añadir 1 mL de 0,25% ....

Resultados

El esquema simplificado de protocolo para la inducción de la neurogénesis en la línea celular P19 se presenta en la Figura1. Para definir el carácter de la línea celular P19 en un estado indiferenciado y durante la neurogénesis, se utilizó el método RT-PCR (reacción en cadena de transcripción inversa-polimerasa). La línea celular P19 indiferenciada expresaba los genes de la pluripotencia como el transportador orgánico catión/carnitina4 (Oct4) y el ho.......

Discusión

Aquí, describimos un protocolo simple para la neurogénesis usando la línea celular P19. Aunque se han publicado muchos informes a este respecto, una metodología detallada para la inducción de la neurogénesis utilizando la línea celular P19 sigue sin estar clara. Además, utilizamos un medio DMEM simple de glucosa alta (4.500 mg/L) con 10% DE FBS para todo el experimento. Esto nos permitió realizar el experimento neurogénico de una manera fácil de usar y ampliar el uso de este método para el futuro.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
6x Colorante de carga de ADN	EURx	E0260-01
Agarosa	Sigma- Aldrich	A9539
kit de síntesis de ADNc	EURx	E0801-02
DAPI (4′,6-Diamidine-2′-diclorhidrato de fenilindol)	Sigma- Aldrich	10236276001	Concentración de trabajo: 1 μ g/mL
DMEM glucosa alta (4,5 g/L) con L-glutamina	Etanol Lonza	BE12-604Q
Etanol 99,8%	Chempur	CHEM*613964202
Suero fetal bovino (FBS)	EURx	E5050-03
Anticuerpo MAP2	Thermo Fisher Scientific	PA517646	Dilución 1:100
Kit de reacción PCR	EURx	E0411-03
Penicilina/Estreptomicina 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x concentrada sin Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17- 517Q
Ácido retinoico	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	disuelto en etanol al 99,8%; Tienda en -20 ° C hasta 6 meses
Anticuerpo secundario (Alexa Fluor 488)	Thermo Fisher Scientific	A11034	Dilución 1:500
Leche desnatada	Sigma- Aldrich	1153630500
Tampón TBE	Thermo Fisher Scientific	B52
Triton-X 100	Sigma- Aldrich	T8787-100ML
Tripsina 0.25% - EDTA en HBSS, sin  Ca2+, Mg2+,con rojo de fenol	biosera	LM-T1720/500
Plásticos de cultivo celular
	Profilab	515.10
Plato de 100 mm dedicado al cultivo en suspensión	Corning	C351029
Tubos de centrífuga de 15 mL	Sigma- Aldrich	CLS430791-500EA
Pipetas serológicas de 5 mL	Profilab	515.05
Placa de 6 pocillos	Corning	CLS3516
Matraces de cultivo celular, superficie 25 cm2	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA

1 mL pipetas serológicas Profilab 515.01 10 mL pipetas serológicas