Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול שינוי גנטי ראשי או מורחב האנושי הטבעיים (NK) תאים הרוצח באמצעות Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). באמצעות פרוטוקול זה, אנו להפיק תאי NK אדם חסר צורה של קולטן גורם גדילה – b 2 (TGFBR2), hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Abstract
CRISPR/Cas9 טכנולוגיה מאיצה בהנדסת הגנום הרבה סוגי תאים, אך עד כה, המסירה הגן, שינוי יציב ג'ין היה מאתגר בתאי NK העיקרי. לדוגמה, transgene משלוח באמצעות התמרה חושית lentiviral או retroviral הביא תשואה מוגבלת של תאי NK מהונדס עקב ניכר אפופטוזיס התא NK הקשורים בהליך. נתאר כאן שיטה ללא ה-DNA הגנום העריכה הראשית ומורחבת NK תאים אנושיים באמצעות קומפלקסים ribonucleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). שיטה זו אפשרה נוקאאוט יעיל של TGFBR2 , HPRT1 הגנים בתאי NK. RT-PCR הנתונים הראו ירידה משמעותית ברמת ביטוי גנים, והציע וזמינותו cytotoxicity של מוצר תא נציג כי תאי NK RNP-לאחרונה הפך פחות רגישים TGFβ. תאים מהונדסים יכול להיות פוסט-אלקטרופורציה המורחב על ידי גירוי עם mbIL21-ביטוי לקרינה מזין תאים.
Introduction
חיסוני סרטן כבר מתקדמים בשנים האחרונות. תאי T מהונדס גנטית chimeric אנטיגן קולטן (מכונית) הם דוגמה מצוינת של תאים חיסוניים מהונדסים בהצלחה פרוסים חיסוני סרטן. תאים אלה אושרו לאחרונה על-ידי ה-FDA לטיפול נגד CD19 + B תא ממאירות, אבל ההצלחה עד כה הוגבלה למחלות הנושאת מספר אנטיגנים targetable, פילוח כזה repertoires antigenic מוגבלת היא מועדת לכישלון על ידי המערכת החיסונית לברוח. יתר על כן, תאי T המכונית כבר התמקדו השימוש בתאי T עצמיים בשל הסיכון של שתל – מול – מארח מחלות הנגרמת על ידי תאי T allogeneic. לעומת זאת, תאי NK מסוגלים להרוג את הגידול מטרות באופן בלתי תלוי-אנטיגן, ולעולם לא לגרום GvHD, מה שהופך אותם. מועמד טוב סרטן חיסוני6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 הטכנולוגיה כבר בשימוש לאחרונה הנדסת תאים חיסוניים, אך מבחינה גנטית התכנות תאי NK עם פלסמידים תמיד היה מאתגר. זה היה עקב קשיים בלידה transgene DNA באופן תלויים כגון lentiviral ו retroviral התמרה חושית גורם משמעותי אפופטוזיס התא NK הקשורים בהליך ייצור מוגבל של תאי NK מהונדס גנטית4 , 9.
הרבה תאים חיסוניים מולדת אקספרס רמות גבוהות של קולטני לחידושים מולקולרית פתוגן-הקשורים כגון Retinoic חומצה-inducible ג'ין אני (מעטה-אני), אשר מאפשרים זיהוי מוגברת של דנ א זר. דיכוי של המסלולים הללו אפשרה יעילות גבוהה יותר התמרה חושית בתאי NK בעת שימוש בשיטות מבוסס DNA ההנדסה הגנטית10.
נתאר כאן את שיטת לשימוש ללא ה-DNA הגנום עריכה של ראשי ומורחבת תאי NK אדם ניצול קומפלקסים ribonucleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Cas9/RNPs מורכב של שלושת הרכיבים, ומורכבת עם סינתטי RNA חד-מדריך מורכבת, ומורכבת crRNA ו tracerRNA Cas9 חלבון רקומביננטי. Cas9/RNPs האלה מסוגלים ביקוע מטרות גנומית עם יעילות גבוהה יותר לעומת גישות תלויי-דנ א זר בשל משלוח שלהם כמו מתחמי פונקציונלי. בנוסף, אישור מהיר של Cas9/RNPs את התאים עשויה להפחית את ההשפעות חופש-יעד כגון אינדוקציה של אפופטוזיס. לפיכך, הם יכולים לשמש כדי לייצר טוק-outs, או לדפוק על הדלת-in בשילוב עם ה-DNA רקומבינציה הומולוגית6,7. הראנו את אלקטרופורציה של Cas9/RNPs היא שיטה נוחה ויעילה יחסית מתגבר על האילוצים הקודמים של ההנדסה הגנטית בתאי NK.
TGFβ הוא ציטוקין לדיכוי המערכת החיסונית הגדולות, אשר מעכב את ההפעלה והפונקציות של תאי NK. הוצע כי המיקוד מסלול TGFβ יכול להגביר את תאי מערכת החיסון. שסימנו את האזור קידוד ectodomain TGBR2 אשר נקשר TGFβ11. התוצאות נציג להראות ירידה משמעותית ברמת mRNA הביטוי של גן זה, בהמשך מדגימים כי תאי NK ששונה להיות עמידים בפני TGFβ. בנוסף, התאים שהשתנו לשמר הכדאיות ואת הפוטנציאל המקדימות, כפי שהם יכולים להיות מורחב פוסט-אלקטרופורציה באמצעות מזין לקרינה תאי. לכן, השיטה הבאה היא גישה מבטיחה לתמרן גנטית של תאי NK עבור כל עוד יותר קליני או למטרות מחקר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מעילים באפי תורם בריא התקבלו כחומר מקור מן במרכז אוהיו אזור הצלב האדום האמריקני. מחקר זה היה נחוש בדעתו להיות פטור מחקר מאת המוסדיים סקירה הלוח של מבית החולים לילדים ארצית.
1. האדם NK תא טיהור והתרחבות
- לבודד PBMCs באפי המעיל12.
- שכבת 35 מ של מדגם המעיל באפי על 15 מ"ל של Ficoll-Paque.
- צנטריפוגה ב 400 x g במשך 20 דקות בלי בלם ולאסוף את PBMC מממשק.
- לשטוף את PBMCs התאושש שלוש פעמים על-ידי הוספת לפחות אמצעי שווה ל- PBS, צריך שתוציאו ב 400 x g למשך 5 דקות ולאחר כ רפה בעברית את נכסים ובנין לשטוף. תאי NK ניתן לבודד בשלב זה על-ידי RosettesSep13.
- הרחב את תאי NK על ידי גירוי עם לקרינה 10 x 106 mbIL21-הבעת מזין תאים ימים 0, 7, ו- 14. החלף מדיה RPMI טריים המכיל 10% FBS, 1% גלוטמין, 1% פניצילין סטרפטומיצין, ו- 100 IU/mL של il-2 עבור אמצעי האחסון כולו מדיה בכל יום אחר.
2. gRNA עיצוב ובחירה
- בחר את לוקוסים גנומית ספציפיים כדי למקד, באמצעות כלים מקוונים, למשל, NCBI, אנסמבל.
דוגמה.
תיאור/הוראות: הפיכת גורם הגדילה בטא קולטן 2 (TGFBRR2) ectodomain
הצג את הרשומה: PF08917
הצג את InterPro: IPR015013
תפקיד: 49-157 aa
רצף יישוב: אקסון 4 של ג'ין TGFBR2 (ENSG00000163513) - כדי לעצב את gRNAs, להשתמש CRISPR עיצוב כלי אינטרנט כגון http://crispr.mit.edu ו- 'Benchling'.
- להזין רצף ה-DNA שבחרת בשלב 2.1. בחרו ' האדם (hg 19) גנום היעד. מדריכים CRISPR (נוקלאוטידים 20 ולאחריו רצף פאם: הגולה) ייסרקו מהרצף שהוזנו קודם לכן. הוא גם מראה התאמות אפשריות חופש-יעד ברחבי הגנום שנבחרו.
- לבחור את הטוב ביותר gRNAs שלושה אשר יש את הציון הגבוה ביותר, בהתבסס על שיעורי על המטרה, את המטרה שלהן. לדוגמה, טבלה 1 מציגה את RNAs CRISPR שעוצבו למטרה אקסון 4 של ג'ין TGFBR2 שהוצעה על ידי כלי אינטרנט עיצוב CRISPR.
- להזמין את RNAs CRISPR crRNAs רצף ספציפי סינתטי.
- סדר ההכפלה, transactivating RNA (tracrRNA) לתקשר דרך חלקיים הומולוגיה עם crRNA.
3. עיצוב מחיקה הקרנת תחל
- עיצוב תחל פורש האתרים פצילות gRNA assay מוטציה T7E1.
- שימוש bp תחל לפחות 100 מן האתר המחשוף החזוי להבטחת ההכנסה קטן-מחיקה (indels) באתר היעד sgRNA יופיעו ב- 1.5% agarose ג'ל בעקבות מוטציה וזמינותו. בטבלה 2 מציג את צבעי יסוד אשר משמשים כדי להגביר את ectodomain TGFBR2.
4. התמרה חושית תאי NK העיקרי ומורחבת אנושי
הערה: התמרה חושית של אלמנטים Cas9/RNPs לתוך NK נעשית על ידי אלקטרופורציה באמצעות מערכת 4D כדלקמן.
-
תא הכנה
- עבור ראשי תאי NK, תקופת דגירה טרי מבודד תאי NK RPMI בינוני בנוכחות 100 IU/mL של il-2 של 4 ימים ולבצע את אלקטרופורציה בחמש היום. החלף את התקשורת בכל יום כפי שתואר קודם לכן, ביום שלפני התמרה חושית.
- עבור תאי NK המורחב, לגרות את התאים ביום 0 עם מזין לקרינה תאים ביחס של 1:1 ולבצע את אלקטרופורציה יום 5 או 6 או 7. החלף את התקשורת בכל יום כפי שתואר קודם לכן, ביום שלפני התמרה חושית.
- ביום של אלקטרופורציה, להכין בקבוקון T25 מלא 8 מ של RPMI טריים המכילים 100 IU/mL של il-2 עבור תאים עוברת אלקטרופורציה, מבחנות מראש incubate ב humidified 37 ° C ו- 5% CO2 מיכלים.
הערה: תאים המופשרים או תאים שעברו 2nd או גירוירואד 3 יכול להיות electroporated בכל עת לאחר ההחלמה שלהם כפי שמתואר. - לקחת 3-4 × 106 תאים לכל תנאי עבור 26 µL של התמרה חושית מיקס.
הערה: ריכוז גבוה מאוד של תאי NK בפתרון אלקטרופורציה מגבירה את קצב התמרה חושית. - לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS כדי להסיר כל FBS, אשר בדרך כלל מכילה RNase פעילות. ספין אותם למטה בכל פעם ב 300 x g במשך 8 דקות.
הערה: שקול 7 תנאים אלקטרופורציה Cas/RNPs כמו gRNA יחיד (gRNA1, gRNA2, gRNA3), שילוב של שני gRNAs (gRNA1 + gRNA2, gRNA1 + gRNA3, gRNA2 + gRNA3), פקד אחד עם לא Cas9/RNPs.
-
יוצרים את crRNA:tracerRNA / מורכבים
- Resuspend crRNAs (gRNA1, gRNA2 ו gRNA3) ו- tracerRNA 1 x טה לפתרון הסופי ריכוזי 200 μM. ΜL 2.2 תערובת של כל gRNA 200 μM עם 200 tracerRNA μM כפי שמוצג בטבלה3.
- מחממים את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, להתקרר על גבי ספסל לטמפרטורת החדר (15-25 ° C). חנות resuspended RNAs, crRNA: tracerRNA מורכבות ב-20 ° C לשימוש מאוחר יותר.
-
טופס המתחם RNP
הערה: כדי לחסוך זמן, יוצרים את RNP מורכבות במהלך השטיפה שלב 4.1.5.- עבור תגובה דופלקס crRNA:tracrRNA יחיד, לדלל Cas9 endonuclease כדי μM 36 כפי שמוצג בדוגמה בטבלה4.
- עבור התמרה חושית שילוב של crRNA:tracrRNA דופלקסים, לדלל Cas9 endonuclease כדי 36 μM כפי שמוצג על ידי הדוגמה ב טבלה 5-
- להוסיף Cas9 endonuclease דופלקסים crRNA:tracrRNA באיטיות תוך מתערבל פיפטה עצה, מעל גיל 30 s כדי 1 דקה.
- דגירה התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15-20 דקות. אם לא מוכן לשימוש את התערובת לאחר דגירה, לשמור את התערובת על הקרח עד השימוש.
-
אלקטרופורציה
- להוסיף את כל תוספת הפתרון אלקטרופורציה P3 ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.
- Resuspend בגדר תא (3-4 × 106 תאים מהשלב 4.1.5) בμl 20 בפתרון אלקטרופורציה 4 D P3 העיקרי. למנוע בועות אוויר תוך pipetting.
הערה: התאים לא אמורים להישאר זמן רב בפתרון P3. - מיד מוסיפים 5 µL של RNP מורכבים (שלב 4.3) התליה תא.
- להוסיף 1 μL של 100 μM Cas9 אלקטרופורציה enhancer Cas9/RNPs/תא לערבב.
- העברת Cas9/RNPs/תא מיקס לרצועות אלקטרופורציה 20 μL.
- טפח בעדינות את הרצועות כדי לוודא כי המדגם מכסה את החלק התחתון של הרצועות.
- להפעיל מערכת אלקטרופורציה 4D ובחר את התוכנית EN-138 .
5. פוסט התמרה חושית
- תן את התאים לנוח במשך 3 דקות הרצועות.
- להוסיף cuvette 80 µL של התקשורת התרבות equilibrated מראש, בעדינות להעביר את הדגימה לתוך מבחנות.
- 48 שעות לאחר התמרה חושית, לחלץ דנ א גנומי מתאי5 × 10 5 וחפש את המחיקות ג'ין ההקרנה.
- להגביר את הגן עניין באמצעות תחל את תוכנן בשלב 3.2 עם Taq DNA פולימראז ערכות.
- טופס PCR heteroduplexes אמפליקון לעיכול T7EI ואת תקופת דגירה של המוצר של 30-60 דקות עם אנזים T7EI ב- 37 מעלות צלזיוס.
הערה: T7EI assay היא עדיפה על הקרנת כפי שהוא הוא מהיר, פשוט ומספק נקה תוצאות אלקטרופורזה לעומת שימוש assay מודד. עם זאת, שיטה זו אינה יכולה לזהות הוספות ומחיקות של < 2 בסיסים הנוצרים על-ידי קצה שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ) פעילות ניסויים Cas9 RNPs14. - להפעיל את ה-DNA מתעכל על 1.5% agarose ג'ל-110 V במשך 30-45 דקות, כל 15 דקות לדמיין את הג'ל.
- לעורר את שאר התאים עם לבטא mbIL21 מזין תאים ביחס של 1:1.
- חמישה ימים לאחר גירוי לחלץ את הרנ א עבור רמת ביטוי הגן באמצעות qPCR.
- התנהגות calcein מבחני דיווח כאמור12. בקצרה, לטעון את התאים היעד עם calcein AM (בדוגמה המוצגת, 3 תאים DAOY µg/mL/1,000,000 היה בשימוש). להתכונן תאי NK מבחני cytotoxicity על-ידי הנחת ללון ב- IL2 (100 IU/mL) פלוס או מינוס 10 ng/mL TGFβ מסיסים. התנהגות calcein מבחני ב ציטוקינים אותו כמו תאי NK היו נח בן לילה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אלקטרופורציה יעילות
כדי למטב את אלקטרופורציה של Cas9/RNPs, בדקנו 16 תוכניות שונות עם התמרה חושית של siRNA ללא פילוח GFP, פלסמיד DNA לתאי NK. Assay cytometry זרימה הראו שיש EN-138 באחוז הגבוה ביותר של התא הכדאיות התמרה חושית ויעילות (35% GFP חיובי תאים חיים) עבור שני חלקיקים (איור 1 & איור 2). מעניין, היעילות של שימוש בתוכנית זו עבור אלקטרופורציה Cas9/RNPs היה גבוה כפי שראינו 60% ירידה ברמת הביטוי TGFBR2 mRNA (איור 5). בנוסף, תאי NK מהונדסים יכול להיות גדלה והתרחבה עבור 30 ימים ו- cryopreserved (נתונים לא מוצג).
מוטציה assay
Cas9/RNPs המכיל gRNA2, gRNA1 + gRNA2, gRNA3 היה מוצלח נוקאאוט גנטי של ectodomain TGFBR2, אבל gRNA1 לבד לא עשה indels לזיהוי כל T7E1 (איור 3). בנוסף, מציין איור 4 בהצלחה נוקאאוט של האדם HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) מורחבת תאי NK האנושי באמצעות מסחרית סיפק gRNAs. לפי densitometry הלהקה, המחירים ויאסין יחסי באמצעות gRNA1 + gRNA2, גרמו בלהקה 34% עבור TGFBR2 ששינה תאי NK, 25% עבור gRNA3 ו- 81% עבור הגן HPRT ששינה תאי NK.
Assay ברמה של ביטוי גנים
כנציגה של תוצאה שלנו, איור 5 מראה את השפעת Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) ברמה לייצור mRNA של ectodomain TGFBR2, נותחו על ידי RT-PCR. כפי שניתן לראות בגרף, רמת הביטוי mRNA של הגן יישוב ירד באופן משמעותי.
Cytotoxicity
כפי שניתן לראות באיור 6, לאחר המקננת gRNA1 + gRNA2, gRNA2, gRNA3 Cas9/RNPs ששינה תאים עם TGFβ1, תרבותי משותף עם תאים DAOY; התאים שהשתנו לא הראה כל ירידה משמעותית את רמת cytotoxicity לעומת קבוצת הביקורת שהיו il-2 בתקשורת בין לילה. תוצאה זו ממחישה כי התאים Cas9/RNPs ששינה שומרים על תפקידם cytotoxicity בנוכחות TGFβ1 ומראה כי התאים שהשתנו הפך TGFβ1 עמיד.
איור 1. הנתונים האלה מראים יעילות אלקטרופורציה DNA siRNA ו פלסמיד לבטא GFP בתאי NK באמצעות התוכנית EN-138. כפי שניתן לראות כאן, הכדאיות התא NK הוא 77.5% ו- 35% של תאים חיים היו GFP חיובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2- איור זה מציג הכדאיות ואת היעילות של עוד אחד של התוכניות 16 (DN-100) לגילוי אלקטרופורציה אופטימיזציה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3- Cas9/RNPs-מתווכת נוקאאוט TGFBR2 ב המתכלים (א) NK ראשי תאים (b) נמדדת T7E1 מוטציה וזמינותו. אנזים T7E1 מזהה ודבק DNA שאינם תואמים. כל להקה קטנה (חיצים כחולים) מייצג מתעכל שברי DNA אשר לשאת ויאסין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4. Cas9/RNPs - מתווכת HPRT הפרעה בתאי NK המורחב נמדדת T7E1 מוטציה וזמינותו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. mRNA רמת הביטוי של TGFBR2 ectodomain ב CRISPR ששינה תאי NK לראשונה על ידי Cas9/RNPs (gRNA1 + gRNA2) באמצעות ה-RT-PCR. GAPDH שימש של ג'ין שליטה אנדוגני. רמות ה-RNA מצביעה על הפרעה של ג'ין TGFBR2 (זאת אומרת ± SEM, ערך P < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. א וזמינותו cytotoxicity שימוש במדגם מייצג של Cas9/RNPs שונה (gRNA1 + gRNA2, gRNA2 ו gRNA3) NK תאי מראה כי לילה דגירה של התאים עם TGFβ1 לא להקטין באופן משמעותי את היכולת שלהם lyse תאים DAOY. ב' בהשוואה עם תאי NK-לאחרונה, Cas9/RNP ששונה תאי NK (gRNA2 ו- gRNA3) רגישים פחות TGFβ1 (אומר ± SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| gRNA מס | gRNA הרצף | שמספרו crRNA סינתטי | |||||
| gRNA1 | 5 CCCCTACCATGACTTTATTC 3 | / AltR1/rArGrUrCrArUrGrGrUrArGrGrGrGrArGrCrUrUrGrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA2 | 5 ATTGCACTCATCAGAGCTAC 3 | / AltR1/rArUrUrGrCrArCrUrCrArUrCrArGrArGrCrUrArCrGrUrUrUrUrArGrArGrCrUrArUrGrCrU/AltR2 / | |||||
| gRNA3 | 5 AGTCATGGTAGGGGAGCTTG 3 | / AltR1/rArG rUrCrA rUrGrG rUrArGrGrGrG rArGrC rUrUrG rGrUrUrUrUrA rGrArG rCrUrA rUrGrCrU/AltR2 / | |||||
טבלה 1. שלושה תוכנן gRNAs למטרה אקסון 4 של TGFBR2 ectodomain כמו crRNA סינתטי.
| TGFBR 2 ectodomain FWD תחל | 5 GTC TGC TCC AGG TGA TGT TTA T3 |
| TGFBR2 ectodomain REV פריימר | 5 GGG CCT איסור פרסום AAT CTG החתול TTA 3 |
בטבלה 2. תחל להשתמש כדי להגביר את הגן ectodomain TGFBR2
| רכיב | כמות (uL) |
| מיקרומטר 200 crRNA | 2.2 |
| מיקרומטר 200 חיצי מעקב RNA | 2.2 |
| מאגר IDTE | 5.6 |
| המוצר הסופי | 10 |
בטבלה 3. יוצרים את crRNA:tracerRNA / מורכבים באמצעות 200 RNAs מיקרומטר
| רכיב | כמות (µL) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA דופלקס (מתוך שלב 4.2) | 2 (200 pmol) |
| Alt-R Cas9 endonuclease (61 מלאי מיקרומטר) | 2 |
| הנפח הכולל | 5 ul |
בטבלה 4. עבור תגובה דופלקס crRNA:tracrRNA יחיד, לדלל Cas9 endonuclease 36 מיקרומטר.
| רכיב | כמות (µL) |
| PBS | 1 |
| crRNA:tracrRNA דופלקס (אקס gRNA1) | 1 (100 pmol) |
| crRNA:tracrRNA דופלקס (אקס gRNA2) | 1 (100 pmol) |
| Alt-R Cas9 endonuclease | 2 |
| הנפח הכולל | 5 ΜL |
טבלה 5. שילוב התמרה חושית של crRNA:tracrRNA דופלקסים לדלל Cas9 endonuclease 36 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השינוי תלוי-DNA של תאי NK מאתגרת4,9. לכן, הצגנו ישירות על מתחם לאכסון preformed ribonucleoprotein (RNPs), Cas9 חלבון כמו חלבון מטוהרים לתוך ראשי ומורחבת NK תאים8. שיטה זו אפשרה לנו לחסל את מיצוי, עוקב, ועל תהליכים אחרים גנים ברמת השעתוק והתרגום נכתבו על ידי RNA פולימראז II, אשר עלול לגרום אפופטוזיס התא NK המשויך שיטות התמרה חושית תלויי-DNA.
בנוסף, שיטת דיווח משתמש כאן חלבון Cas9 מטוהרים ומורכבת כמו Cas9/RNPs, אשר פעילים מיד לאחר אלקטרופורציה והשפילו הם במהירות, ובכך על המטרה ולהקטנה אפקטים את המטרה דרך פרוטוקולים הנוכחי 5 , 6 , 7 , 16. יתר על כן, אופטימיזציה של גישה חדשה אלקטרופורציה מגלי Cas9/RNP עם יעילות גבוהה הוא קריטי צעד נוסף הציג כאן, אשר חלים כל הגנים האחרים של עניין. שיטה זו עשויה להיות יורה על שינוי של מספר גדול של תאי NK באמצעות וואקום אלקטרופורציה גדול יותר זמינים מסחרית (נתונים לא מוצג).
לסיכום, Cas9/RNPs יכול לשמש כדי שינוי גנטי העיקרי ומורחבת NK תאים אנושיים על חיסוני סרטן ניצול השיטה המתוארת לעיל. התוצאות שלנו הראה גם כי פצצה מוצלחת של הגן TGFBR2 ectodomain מוביל אלה בתאי NK ששונה להפוך עמידים TGFβ111.
שילוב RNP משלוח עם מקור של תבנית ה-DNA (כגון באופן טבעי recombinogenic וירוס adeno-הקשורים (AAV) התורם וקטורים) עשוי לאפשר ג'ין בייעודי לאתר ההכנסה רקומבינציה הומולוגית3,18,19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
דאל מגיש/שימש כיועץ עבור Courier הרפוי, אובסידיאן הרפוי, Intellia הרפוי, מעבדות מחקר Merck ו ביוטכנולוגיים Miltenyi, יש הון עצמי/מנהיגות CytoSen הרפוי.
Acknowledgments
אנו להכיר טוליוס בריאן על עזרתו די בעריכת כתב היד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare - Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
References
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), Bethesda. 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. Cancer Research. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
