Summary
Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.
Abstract
Floresans mikroskobu biyolojik moleküller üzerine çalışmaları in situ algılamak ve onların dinamiği ve etkileşim gerçek zamanlı olarak izlemek için güçlü bir araçtır. Geleneksel epi-floresan mikroskopi ek olarak, belirli deneysel hedeflere ulaşmak için çeşitli görüntüleme teknikleri geliştirilmiştir. Bazı yaygın olarak kullanılan teknikler konformasyon değişiklikler ve angstrom çözünürlük ve tek molekül algılama tabanlı moleküler etkileşimleri bildirebilirsiniz tek molekül floresans rezonans enerji transfer (smFRET), dahil uzaysal çözünürlüğü için yaklaşık on twentyfold kırınım-sınırlı Mikroskopi için karşılaştırıldığında artırabilir görüntüleme-Süper çözünürlük (SR). Burada bir mikroskop, geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı SR görüntü ve çok renkli tek molekül algılama dahil olmak üzere birden çok görüntüleme yöntemleri birleştirir bir müşteri tasarlanmış entegre sistemi, mevcut, smFRET görüntüleme dahil olmak üzere. Farklı görüntüleme yöntemleri kolayca ve tekrarlanarak optik öğeleri geçiş yaparak elde edilebilir. Bu kurulum rutin ve düşük maliyet ve bireysel amaçlar için ayrı mikroskoplar bina göre alan çeşitli görüntüleme deneyler için bir ihtiyaç ile Biyoloji Bilimleri herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından evlat edinmek kolaydır.
Introduction
Floresans mikroskoplar modern biyolojik bilim araştırma için önemli araçlar ve floresan görüntüleme düzenli olarak birçok biyoloji laboratuvarlarında yapılan. Biomolecules fluorophores ile ilgi etiketleyerek, biz doğrudan onları mikroskop altında görselleştirmek ve yerelleştirme, uyum, etkileşim ve derleme devlet içinde VIVO veya vitrozamana bağımlı değişiklikleri kaydetmek. Geleneksel floresan mikroskoplar ~ 200-300 nm yanal yönde ve ~ 500-700 nm eksenel yönde1,2ve vardır, bu nedenle, düşsel vasıl 100'ler için sınırlı olduğunu bir kırınım-sınırlı kayma çözünürlüğe sahip nanometre mikron ölçek. Moleküler derleme veya kuruluşunuzdaki ince ayrıntıları ortaya çıkarmak için kırınım sınırı zarar verebilir çeşitli SR microscopies geliştirilmiştir. SR elde etmek için kullanılan stratejiler içerir uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi3,4 ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)5,6, gibi doğrusal olmayan optik etkileri 7, Stokastik optik imar mikroskobu (fırtına)8 ve photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM)9ve MINFLUX10gibi her ikisinin bir birleşimi gibi tek moleküllerin Stokastik algılama. Bu SR microscopies arasında tek molekül algılama tabanlı SR mikroskoplar tek molekül mikroskop set-up nispeten kolayca değiştirilebilir. Tekrarlayan harekete geçirmek ve photoactivatable floresan proteinler (FPs) veya fotoğraf değiştirilebilir boyalar üzerinde ilgi biomolecules öğesini görüntüleme ile Uzaysal Çözünürlük 10-20 nm11ulaşabilirsiniz. Moleküler etkileşimleri ve konformasyon bilgi elde etmek için gerçek zamanlı, angstrom nanometre çözünürlükte dynamics gereklidir. smFRET12,13 bu çözünürlük elde etmek için bir yaklaşımdır. Genel olarak, faiz biyolojik sorular bağlı olarak, görüntüleme yöntemleri farklı uzamsal çözünürlük ile ihtiyaç vardır.
Tipik olarak, görüntüleme her türü için belirli uyarma ve/veya emisyon optik yapılandırmasına gerek yoktur. Örneğin, tek molekül algılama için en sık kullanılan aydınlatma yöntemlerden birini belirli uyarma açı bir prizma veya objektif lens yoluyla ulaşılması gereken toplam iç yansıma (tır), geçer. SmFRET tespiti için donör ve alıcısı boyalar emisyonları dağınık şekilde ayrılmış olup elektron-çarpımı, şarj kuplajlı birtakım aynalar ve dikroik ışın ayırıcılar ile elde edilebilir cihaz (EMCCD), farklı bölümlerine yönelik gerek emisyon yolundaki yerleştirilir. Üç boyutlu (3-D), düşsel bir optik, bir bileşen bir silindirik objektif14, SR emisyon yolundaki bir astigmat etkiye neden için gereklidir. Bu nedenle, homebuilt veya piyasada bulunan entegre mikroskoplar genellikle, işlevsel olarak görüntüleme yöntemi her türü için uzmanlaşmış olan ve aynı kurulum üzerinde farklı görüntüleme yöntemleri arasında geçiş yapmak için esnek değildir. Burada üç farklı görüntüleme yöntemleri arasında ayarlanabilir ve tekrarlanabilir anahtarları sağlayan bir maliyet-etkin, hibrid sistemi mevcut: kırınım-sınırlı çözünürlük, tek molekül algılama tabanlı SR ile geleneksel epi-floresan görüntüleme görüntü ve çok renkli tek molekül algılama, smFRET (Şekil 1A) görüntüleme dahil olmak üzere. Özellikle, burada sunulan set-up fiber birleştiğinde giriş lazerler çok renkli uyarma için içerir ve epi- ve tır modları arasında geçiş yapmak için uyarma açı kontrolünü sağlar uyarma yolunda bir ticari aydınlatma kol programlanmış. Emisyon yolundaki bir çıkarılabilir homebuilt silindirik objektif Kaset 3-b SR görüntüleme için mikroskop gövdesi içinde yerleştirilir ve bir ticari ışın ayırıcı seçerek birden fazla emisyon kanal algılamak için etkin bir EMCCD kamera önce yerleştirilir aynı anda.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mikroskop tasarım ve montaj
-
Uyarma yolu
Not: Lazerler, fark girişim kontrast (DIC) bileşenleri, mikroskop beden ve onun aydınlatma kol uyarma yolu içerir.- Titreşim izole optik masa hazırlamak. Örneğin, bir yapısal amortisörleri tablosu 48 x 96 x 12'' tüm bileşenler için yeterli alan sunuyor.
Not: kurulum ile sıcaklık kontrolü (Örneğin, 21.4 ± 0.55 ° C) bir odada kurmak. Sıcaklık kararlılığı optik uyum korumak açısından önemlidir. - Fiber optik bağlantı için bir aydınlatma kol ile donatılmış bir mikroskop vücut yüklemek bir 100 X Petrol-daldırma TIRF objektif lens ve DIC bileşenleri.
- Dört lazer kafaları yerleştirin (647 nm, 561 nm, 488 nm ve 405 nm, Şekil 1Badımında çevrili) ve optik masada onların ısı lavabolar ve aynı yükseklik ve vardır (Örneğin iyi istikrarı sağlamak olabildiğince kısa emin olun verilmiş lazer ışınları var 3'').
Not: Eğer bir lazer kafa diğer lazerler daha kısa bir yükseklikte, altındaki yeterli kalınlığı ile bir alüminyum plaka koymak. Her zaman ısı alıcıları ve optik tablo için en iyi ısı dağılımı (Şekil 1B) arasında en fazla temas emin olun. Lazerler SR görüntüleme için güçlü olmak gerekir. Malzemelerin tabloyabakın. Bu lazer temizlik filtreleri diyot lazerler önünde olması tavsiye edilir. - Bir iş istasyonu bir veri edinme kartı bir çevre birimi bileşen bağlantısı (PCI) arabirimi üzerinden yüklemek ve lazerler bu kart ile bağlayın. Lazerler ON/OFF davranışları çıkış transistör transistör mantık (TTL) tarafından ve bu kartın (Şekil 1 c) analog çıkış tarafından kendi güç ayarı denetler. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı (ticari veya homebuilt) veri alma kartı denetlemek için uygun bir mikroskobu mikroskop vücut yanı sıra yükleyin.
- Aynalar ve dikroik ışın kırma (590, 525 ve uzun filtreler geçiş 470) onların anılan sıraya göre bağlar için mount. Çok istikrarlı ayna bağlar için ayna kullanın. Dairesel kırma yüzük istinat ile herhangi bir dikroik ışın kırma (Şekil 1 d) eğilmesini önlemek için kullanın.
- Aynalar ve dikroik ışın kırma lazer ışınları (Şekil 1B) birleştirmek için optik masaya koyun. En istikrarlı hizalama sağlamak için tüm anlaşma mümkün olduğunca kompakt ve 1''-kalınlık optik mesaj kullanabilirsiniz. Kısa dalga boyu ışıklar daha havada dağıtmak bu yana kısa dalga lazerler fiber optik bağlantı (Şekil 1B) daha yakın olacak lazerler düzenleyin.
- Lazer ışınları bir tek modlu fiber optik birleştirmek. Bunu yapmak için aşağıdaki adımlarda bir kafes sisteminde bir fiber bağlantı kurmak:
- Bir z ekseni çeviri Mount (Şekil 1E, en soldaki panel) fiber adaptör plaka bağlayın.
- Bir akromatik tamamen objektif mount (odak uzaklığı 7.5 mm =) bir kafes plaka (Şekil 1E, soldan ikinci panel).
- Yukarıda iki bölümü arasında uzantısı çubuklar tarafından bir kafes oluşturmak için bağlantı. Kafes parantez 1''-kalın optik yazılarda (Şekil 1E, orta panel) montaj ile optik masaya monte.
- 647-nm lazer ilk tek modlu optik fiber (FC/APC sonuna coupler) ile hizalayın.
Not: tek modlu fiber optik kullanmadan önce bir çok modlu fiber optik kullanarak bir kaba hizalama hizalama işlemi yardımcı olabilir. Aynalar ve dikroik ışın kırma (Şekil 1 d, ayarlama topuzlar tarafından), açılarını yanı sıra akromatik tamamen objektif ve lif adaptör plaka (z ekseni çeviri Dağı ayarlayarak1E rakam,) arasındaki mesafeyi ayarlamak kazanmak için en yüksek lazer fiber üzerinden çıkış gücü. - İlk lazer hizalama işlem tamamlandıktan sonra geçici olarak süsen çifti yüklemek ve geri kalanı lazerler teker teker (Şekil 1F) hizalayın. Hizalama verimliliği ile güç ölçeri denetleyin.
- Bir gözü önünde lazerler yansımaları azaltmak için adaptör plaka bırakın.
Not: Güçlü geri yansımaları lazer kaynakları ömrünü azaltabilir. İsteğe bağlı olarak, bir optik İzolatör yansımaları tamamen kaldırmak için her lazer kafa önünde yüklenebilir.
- Diğer ucunu fiber optik mikroskobu (Şekil 1 H) aydınlatma kol bağlayın.
- Tasarım ve "büyütme objektif (mag objektif)" aşağıdaki adımlarda yükleyin:
Not: Lazerler örnek epi-floresan görüntüleme için kullanılabilir, ancak her lazer dar demet boyutunu örnek bir alana karşılık gelen fotoğraf makinesi sensörünün gerçek boyutundan daha küçük birkaç kez ışıklı alan özellikle için yeni sınırlar kameralarla (köşegen uzunluğu geleneksel 11,6 mm uzunluğa göre 18.8 mm). Böylece, bu örnek daha büyük ve daha düz aydınlatma elde etmek için ışın genişletmek için tercih edilir.- Aydınlatma kol (Şekil 1 H) sığabilecek mag lens tasarımı.
Not: Mag lens tasarımı nerede yüklü üzerinde bağlıdır. Şekil 1 H aydınlatma kolundan yükleme örneği gösterir ama sonra lazer ışınları collimated (bkz: tartışma) herhangi bir yerde yüklenebilir. Bir bilgisayar destekli tasarım ve çizim yazılımı ile tasarlayabilirsiniz. - Koyun iki achromatic lens, bir içbükey (odak uzaklığı = f1) ve bir konveks (odak uzaklığı = f2) onların odak uzunlukları toplamı, için f1 eşit mesafe ile ev yapımı mag objektif tutucu (Şekil 2A ve 2 C), + f2 (-25) = + 50 = 25 mm (Şekil 2B).
Not: Bu odak uzaklık seçeneği ile mag objektif ışın f2tarafından genişletir / | f1| = 2 pas geçiyor. Mag lens çok yönlülük sağlar. Normal aydınlatma kirişler (Şekil 2B) genişleyen olmadan devam etmek için kaldırılabilir veya daha güçlü bir uyarma yoğunluğu elde etmek için lazer ışını odaklanmak için ters yönde eklenir.
- Aydınlatma kol (Şekil 1 H) sığabilecek mag lens tasarımı.
- Titreşim izole optik masa hazırlamak. Örneğin, bir yapısal amortisörleri tablosu 48 x 96 x 12'' tüm bileşenler için yeterli alan sunuyor.
2. emisyon yol
Not: Emisyon yol çıkarılabilir bir silindirik lens, bir bariyer filtresi tekerlek, bir emisyon splitter ve bir EMCCD kamera (Şekil 1G) oluşur. En iyi noktaya ulaşmak için işlev (PSF) tek moleküllerin yaymak, DIC prizma uzak objektif lens alınır.
- Özel-tasarım el ile DIC çözümleyicisine sığabilecek silindirik objektif (3-b objektif) kaset yuvası (Şekil 3 c) mikroskop gövdesine yerleştirin.
Not: bir Çözümleyicisi blok filtre tarete eklenebilir bu yana bu tasarım DIC analyzer ödün vermeyen. - 3-b lens odak uzaklığı 10 m kasete ve astigmat etkisi her molekülünü14z koordinatı ayıklamak için gerekli oluşturmak için emisyon ışını yolun içine yerleştirin.
Not: İsteğe bağlı olarak, 3-b objektif kaset içinde ya da dışında emisyon yol (Şekil 3 c) yerleştirilebilir. - Bir çok bantlı dikroik ışın ayırıcı filtre taret mikroskop vücut içinde yükleyin.
- Emisyon filtreleri yükler.
Not: Emisyon filtreler tercih edilen fluorophores bağlı olarak seçilir. Görüntüleme modülü bağlı olarak, farklı konumlarda yerleştirilmiş emisyon filtreler aşağıda açıklandığı gibi kullanılır:- Sıralı çok renkli epi-floresan görüntüleme veya SR görüntüleme için mikroskop vücuttaki titreşim kanal anahtarı (Şekil 1G) sırasında en aza indirmek için mikroskop cesedin yanında bağlı bariyer filtresi tekerlek yerleştirilen emisyon filtreleri kullanın.
- Eşzamanlı çoklu renk algılama için (Örneğin, smFRET deneyleri), başka bir filtre bir emisyon splitter (onay adım 4 Ayrıntılar için) set koyun.
Not: Genellikle, iki değiştirilebilir modu (yani, "meşgul" veya "atlamak" modları) bir ticari emisyon splitter vardır. İki dikroik ışın ayırıcılar ve üç emisyon filtre tutan bir filtre küp chromatically eşzamanlı çoklu renk görüntüleme ("Nişanlı" modu) için emisyon ışıklar ayırmak için kullanılır ("Üçlü küp," rakam 4 c ve 4 D). Bariyer filtresi tekerlek boş bir yuvaya çift küp ile birlikte kullanılır. Öte yandan, sıralı çok renkli görüntüleme için üçlü küp sadece bir ayna ("yan yol küp," Şekil 4A ve 4 D) içinde olan bir küp değiştirilir.
- EMCCD kamera emisyon yolun son parçası olarak yükleyin. Hızlı kare hızı elde etmek için USB-PCI bağlantı kullanmak.
Not: Bir EMCCD kamera en hassas tek molekül algılama için tavsiye edilir, ama bir Gelişmiş sCMOS kamera bir alternatif olabilir.
3. kırınım-sınırlı Epi-uyarma ile görüntüleme
- Epi-aydınlatma kol modunda uyarma lazerler arızi açıya ayarlayın.
- 3-b objektif olsa (Şekil 3 c, doğru kapı aynası) meşgul kapatın.
- Yan yol küp emisyon splitter (Şekil 4A ve 4E, alt paneli) yerleştirin.
- (İsteğe bağlı) Mag objektif genişletilerek aydınlatma alanı (Şekil 2B, sol panelde) için ekleyin.
Not: bir mag lens ve 100 X Petrol-daldırma objektif lens kullanımı ile yaklaşık 91 x 91 µm2 eşit olarak, beyaz bir ışık kaynağı ve birden çok filtre küpleri kullanma gereksinimini ortadan kaldırarak aydınlatılmış. - Bir mikroskobu görüntüleme yazılımı çok kanallı, almak ve/veya Z-yığın ve/veya Hızlandırılmış resimler kullanın.
Not: Mikroskobu görüntüleme, sadece mikroskop üreticilerin aynı zamanda üçüncü taraf şirketler veya açık kaynak geliştiricileri için kullanılabilir birden çok program vardır.
4. çok kanallı Imaging tek molekül de dahil olmak üzere smFRET
Not: herhangi bir dalga boyu ile tüm emisyon emisyon splitter filtreler/dikroik ışın kırma ikinci kümesi ulaşabilirsiniz bariyer filtresi tekerlek "boş" bir konuma taşıyın.
- Çok renkli tek molekül tespiti TIRF uyarma, smFRET ölçüm, dahil olmak üzere kullanarak yüzey immobilize molekülleri15 ayarlamak için uyarma lazerler arızi açı TIRF açıyla ayarlayın. Mag lens ve 3-b lens kapatın.
- Üç kanallı modu aşağıdaki adımlarda emisyon splitter (Şekil 1G) meşgul:
- Bir "kalibrasyon küp" ile bypass cube yerine tüm kanallardan (Şekil 4B ve 4E) gitmek ışık sağlar.
- DIC (yani, hiçbir emisyon filtre bariyer filtresi tekerlek) altında kamera açmak ve üç tamamen ayrı kanal ekranda görününceye kadar emisyon splitter diyafram ayarlamak.
Not: oda ışığı yaktı, tüm kanallar görselleştirmek için bu adımı gerçekleştirin. - Yatay/dikey ayarı kontrol düğmeleri emisyon splitter açmak ve kabaca üç kanal (Şekil 4E ve 4F) hizalayın.
- Fotoğraf makinesini kapatın ve kalibrasyon küp çift küp (Şekil 4 c ve 4E) ile değiştirin.
- Bir örnek ile 100 X objektif lens ve odak üstünde 100-nm çok kanallı boncuk örnek üzerinde yerleştirin.
- Kamera ve 488-nm lazer açın, bir parlak boncuk üzerinde yakınlaştırma ve ince ayar kontrol düğmeleri yeniden (Şekil 4E ve 4 G) açarak üç kanal hizalayın.
Not: 488-nm uyarma, üç kanallı hizalama etkinleştirme üzerine ışık farklı dalga boylarında 100-nm çok kanallı boncuk yayarlar.
- Kamera ve lazerler, odak açmak ve makul bir nokta yoğunluğu ile iyi bir pozisyon bulmak. Lazer güç ve pozlama zaman kabul edilebilir sinyal-gürültü ve photobleaching seviyeleri elde etmek için ayarlayın. Disk görüntüsü oluşturma yazılımı mikroskobu hızlandırılmış fotoğraf çekmek için kullanın.
5. SR görüntüleme
Not: Bu tek molekül algılama tabanlı SR mikroskobu olduğunu.
- SR görüntüleme yukarı ayarlamak için 3-b objektif ekleyebilir veya mag objektif kaldırabilir. Kameranın çekim hızı (Örneğin, 5-60 ms) uygun lazer kanallarında ayarlayın. Belirlemek ve en uygun uyarma lazerler arızi açı TIRF açı için el ile ayarlayın.
- Örnek arabellek16Imaging SR yerleştirin. Arabellek en az 10 dk önce görüntüleme için equilibrate izin.
Not: SR görüntüleme arabellek yaklaşık 1 saat sonra sona eriyor, bu nedenle yeni SR arabellek buna göre görüntüleme olun. - DIC görüntü SR görüntüleme önce al. Doğru objektif yükseklik astigmat etkisi en iyi duruma getirir, SR için bulmak için hücrelerin orta uçak bulmak için Imaging DIC kullanın. Uçağın yükseklik tarafından hücreleri "karanlık" resimlere geçiş "light" ve şeffaf olmak için görünür tanımlamak (Şekil 5A, 5Bve 5 C). İstenen odak düzlemi belirlendikten sonra z-drift düzeltme sistemi (Şekil 1A) meşgul.
- SR görüntüleme kuralları. 405 nm lazer güç noktalar 'yanıp sönen-açık' makul bir yoğunluğu korumak için değiştirin.
Not: 405 nm lazer el ile değiştirmek mümkün olsa da, "yanıp sönen-tarih" noktalar yoğunluğu korumak için programlanmış veri alma kodu çalıştırmak daha uygun olur. İşte bir örneği nasıl otomatik olarak yürütülür. Kaynak kodu (Şekil 6) istek üzerine mevcuttur.- Görüntüleme edinme 0 W/cm2 menekşe lazer güç ile başlayın.
- Yanıp sönen üzerinde noktalar belli bir süre içinde saymak.
- Böylece yanıp sönen üzerinde noktaların sayısını eşiğin bir kullanıcı tarafından tanımlanan"sayım" görüş alanı içinde tutulur menekşe lazer güç modüle. Yanıp sönen üzerinde noktaların sayısını sayım eşiğin altına düştüğünde menekşe lazer gücünü arttırın.
- Yanıp sönen üzerinde noktaların sayısını en fazla menekşe lazer güç kullanarak sayım eşiğin altına düştüğünde satın sonlandırın.
Not: En fazla örnek parlaklık bağlı olarak farklı şekilde ayarlanmış, ancak 130 W/cm2' den daha yüksek olabilir. SR görüntüleme gerçek amacı bağlı olarak, bu otomatik satın alma kodu el ile istediğiniz herhangi bir noktada sonlandırılabilir.
- Yanıp sönen davranış ve PSFs noktalar yakında satın başladıktan sonra kontrol edin.
Not: Eğer yanıp sönen davranış ideal değil, uyarma lazerler arızi açısını değiştirebilir veya görüntüleme arabellek değiştirin. "Dikey", "yatay" ve "elmas" şekilleri fluorophores aşağıdan, yukarıda ve odak düzlemi içinde sırasıyla temsil eden PSF, (Şekil 5 d) bir örnekleme bekliyoruz. Çoğu noktalar dikey veya yatay PSFs gösterirsen, sonra odak düzlemi hücreleri Merkezi'nden kapalıdır, bu yüzden deneme sonlandırmak ve yine odak düzlemi ayarlamak. Yağ değiştirmek veya örnek bir farklı görüntüleme alanına değiştirmek gerekli olabilir bu yüzden hava kabarcığı Daldırma yağ veya diğer yerel faktörler varlığı PSFs kalitesini etkileyebilir. - Veri analizi için her spot cisimlerin görüntüleme her çerçevede algılamak ve x ve y genişlikleri14her spot z değerlerini ayıklamak için (NIH ImageJ eklentileri içinde) açık kaynak veya piyasada bulunan kodları kullanın.
Not: Bu rapordaki orijinal erken tek molekül algılama tabanlı SR8 birinde gelişmiş bir kaynak kodu için 3-b algılama16 güncellenmiştir ve kullanılmıştır. - İki renkli görüntüleme söz konusu olduğunda, daha kısa uyarma dalgaboyu olan ardından uzun uyarma dalga boyu ile fluorophore görüntü. Otomatik satın alma kodu aynı şekilde adım 5,4, ancak farklı bir görüntüleme lazer ile açıklanan bir çalıştırın.
Not: renk sapmaları görüntü farklı fluorophores (Örneğin, kırmızı boya ve sarı-yeşil boya) ile arasında düzeltilmelidir. Burada adımlar vardır.- Birden fazla 100-nm çok kanallı boncuk kümeleri şekillendirme kaçınarak cam coverslip üzerinde hareketsiz.
- Onları farklı uyarma kanalları görüntülerini almak.
- Özü onların (X, Y, Z) yazılımı (adım 5.6) tarafından koordine eder.
- ΔXben Arsa = X1I -2i ve ΔYi X Y1I - Y2i = (ben için farklı boncuk ve 1 ve 2 farklı renk kanalları) ayrı ayrı ve bunları uygun işlevleriyle uygun. İşlevleri kaydedin.
Not: Doğrusal fonksiyonlar çoğu durumda yeterlidir. Bir kez bu işlevler belirlenir, bu ölçüm görüntüleme her seferinde yinelenmesi sahip değil. - Bir örnek ilgi gerçek iki renkli SR görüntüleme içinde işlevleri (X, Y) doğru renk sapmaları için geçerlidir. Z yönlü renk sapmaları için ΔZ elde ederek yapmak = Z1 - Z2 çok kanallı boncuk ya da bilinen başvuru çok kanallı örnekleri faiz örnek ile birlikte tohumlari için.
Not: (X, Y) farklı renk sapmaları, z yönlü renk sapmaları iyi-tekrarlanabilir kanal geçiş üzerine ağırlıklı olarak eksik z yönlü odak bakım nedeniyle her denemede değil. Bu nedenle, bu her zaman düzeltme yapmak için tavsiye edilir. ΔZ = Z1 - Z2 çoğunlukla (X, Y), bağımsız olarak sadece birkaç boncuk veya başvuru örnekleri ilgi her örnek alan yeterli olurdu. İnşa son iki renkli SR görüntüleri bir 3-D görüntüleme yazılımındaki arsa ve ΔZ el ile denetleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu mikroskop esnek ve tekrarlanabilir farklı görüntüleme yöntemleri arasında geçiş sağlar. Burada her görüntüleme modülü ile toplanan örnek resimleri göster.
Şekil 5 d üzerinde yanıp sönen molekül PSF SR alım sırasında gösterir. Böyle görüntüleri binlerce son SR görüntü (Şekil 5E) oluşturmak için yeniden. Şekil 5E aynı bakteriyel düzenlemesinde 7A rakamepi-floresan görüntüde gösterildiği gibi gösterir. Şekil 7 U2OS memeli hücrelerinde Escherichia coli hücrelerdeki küçük bir düzenleyici RNA ve bir mRNA temsilcisi epi-floresan görüntüleri gösterir. Her iki RNA'ların fluorophore öğesini DNA oligo den in situ hibridizasyon17ile etiketlenir. Şekil 8 katlanmış RNA molekülleri donör boya (yeşil boya) ve alıcısı boya (kırmızı boya) ile etiketli temsilcisi smFRET ölçümü gösterir. Kompleksleri mikroskop slayt üzerinde immobilize ve TIRF aydınlatma heyecanlı. Floresan yoğunluğu yörüngeleri FRET verimliliği zamanın bir fonksiyonu olarak üreten tek tek tek molekülleri üzerinden elde edilebilir.
Şekil 1: mikroskop set-up tasarımını. Bir diyagramı tuzak (A) Bu panel gösterir. M ayna, DBS = dikroik ışın bölücü, LCF = = lazer temizlik filtresi, ben Iris, L = objektif, AP = adaptör plaka, ZTM = z ekseni translasyonel = monte, bir fiber optik, OFC = kaplin, fiber optik CL = silindirik objektif, TL = tüp objektif, EF = emisyon filtreleri, Obj = amaç = objektif ve SM adım motor =. Z-drift düzeltme sistemi adım motor z-drift, kendi LED ile oluşturulan ve kendi dedektörü tarafından tespit kızılötesi (IR) sinyal tarafından hesaplanan ters yönde objektif lens Yangın gövdeler üzerinde taşır. (B) Bu panel lazer uyarma derleme gösterir. Dört lazerler aynalar ve dikroik ışın ayırıcılar ile birleştirilir ve sonra bir fiber optik bir odaklama lens ve bir translasyonel monte (resmin alt) oturan bir adaptör plaka üzerinden yönlendirilir. (C) Bu panel lazer modülasyon gösterir. İki süngü Neill-Concelman (BNC) kabloların her lazer (kafa veya üreticiye bağlı olarak denetleyici) TTL ve analog modülasyon (en soldaki paneli) için bağlı. BNC kablolar bilgisayar denetimi için bir iş istasyonu (en sağdaki panel) bir veri edinme kartınıza bağlı tek bir kablo (orta Masası) birleştirilir. (D) Bu panel gösterir ayna ve dikroik ışın splitter bağlar. (E) fiber bağlaştırıcı bir kafes sisteminde bina. Böylece akromatik çift lens (L1, gösterilen yan görünüm) uzaklığı modüle bir lif adaptör plaka (AP) bir z ekseni çeviri Dağı (ZTM) monte edilir. AP ve ZTM eşleme konuları, L1 ile aynı ve kafes plaka var. Süsen çifti (F) A (çevreleyen) birden fazla lazer hizalama işlemi sırasında yüklenir. 647-nm lazer (sol paneli) ve 561-nm lazer (doğru kapı aynası) aynı yol gitmek emin olmak için kullanılır. (G) A emisyon yolunun kısmi bölümü gösterilir. Mikroskop vücut dışında emisyon filtre tekerlek, emisyon splitter ve EMCCD kamera sırayla yüklenir. (H) Bu panel aydınlatma kol derleme gösterir. Mag lens aydınlatma kol eklenir. Uyarma lazer ışınları aydınlatma kol fiber optik ve fiber optik (resmin sağ tarafında) kaplin yoluyla gönderilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: mag lens. (A) Bu panel gösterir sahibinin Dikçizgisel projeksiyon lazer ışınları büyütülmesi için konut lensler (birim: mm). Bu tasarım aydınlatma kol sığacak şekilde tasarlanmıştır. (B) Bu panel iki lens nereden tutucu deliğin iç çizimini gösterir. L1 içbükey bir camdır ve L2 bir dışbükey lens ise aralarındaki uzaklığı onların odak uzunlukları toplamı. (C) Bu mag objektif bir fotoğraf olduğunu. (D) mag objektif genişletmek veya (solda) lazer ışınları odaklanmak için aydınlatma kolundan eklenebilir veya lazer ışınları (sağda) değişmeden tutmak için kaldırıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: 3-b objektifin. (A) Bu panel gösterir Dikçizgisel projeksiyon bypass modu için boş bir dairesel delik ve silindirik objektif tutmak için bir dikdörtgen delik olması sahibinin (birim: mm). Bu tasarım DIC analyzer kaydırıcıyı bir mikroskop vücutta uyacak yöneliktir. (B) bu 3-b objektif bir fotoğraf olduğunu. (C) silindirik objektif PSFs (solda) astigmat ile neden için emisyon ışını yolundaki meşgul veya yan yol modu PSFs sağlam (sağ) tutmak için devre dışı bırakıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: emisyon ayırıcının hizalamasını çok kanallı. Optik ve ışık yolunu şemaları (A) (B) bir yan yol küp ile emisyon splitter bir kalibrasyon küp ve (C) bir üçlü küp gösterilmektedir. M ayna =. Yan yol küp yansıtma (M5) içinde olan ve bariyer filtresi tekerlek bir emisyon filtreli (EF) kullanılması beklenir. Kalibrasyon küp ışıkları tüm yollardan gitmek için izin ışın kırma (BS) vardır. Üçlü küp iki dikroik ışın kırma (DBS), yanı sıra üç emisyon filtre vardır. (D) Bu fotoğraflar üç küp vardır. (E) emisyon splitter iç bir küp (üst paneli) olmadan ve içinde sürgülü bir küp (alt paneli) ile gösterilir. M3 M4 ve değil içinde belgili tanımlık fotoğraf ele geçirdi. Kontrol düğmeleri aynalar için emisyon splitter (üst paneli) üstünde vardır. (F) Bu panel kanal hizalama altında DIC kalibrasyon küp kullanarak gösterir. (G) Bu panel yeşil (üst panel) ve kırmızı (orta Masası) kanalları 100-nm çok kanallı boncuk ve üç kişilik bir küp kullanarak iyi bir hizalamasını gösterir. Birleştirilen görüntüyü iki kanal da (alt paneli) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: temsilcisi SR resim alma. Bu paneller bir temsilcisi DIC resme(a), (B), veya (C) hücrelerin uçak merkezi göster. (D) Bu panel üzerinde yanıp sönen fluorophores PSF bir örneği gösterilir. Turuncu daire "dikey" PSF çevreleyen Yeşil daire bir "yatay" PSF çevreleyen Mavi daire odaklı bir uçak, fluorophores temsil eden bir elmas şeklindeki PSF çevreler. (E) Bu panel bir temsilcisi SR görüntü yeniden gösterilir. Küçük bir düzenleyici RNA floresans in situ hibridizasyon kırmızı boya ile taşır. Beyaz kenarlıklar hücre kenarlarına işaretleyin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: SR görüntüleme için programlanmış veri alma kodu. Bu programlanabilir edinme modüldeki çeşitli yürütme komutları ve mikroskop kontrol fonksiyonları sol panelinde listelenir ve programlanmış satın alma kodu oluşturmak için seçilebilir. Komutları sırayla yukarıdan yukarıdan aşağıya doğru yürütülür. Bu ekran görüntüsü bir örnek bir önceden tanımlanmış tekrarlayan görüntüleme alımları belirli sayıda satın poz verdi ve üç sıralı görüntü kareleri noktalar hesaplanır kadar yürütülen gösterir. Bu noktalar ortalama sayısı (bakteriyel görüntülemede hücre sayısı % 50'si olarak tanımlanan) eşiğin yoksa, resim alma aynı döngüde devam eder. Eğer eşik değerinin altına, daha sonra resim alma (ekran alt kısmında kesilmiş) daha büyük bir menekşe lazer güç kullanıldığı bir sonraki döngü devam eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: temsilcisi epi-floresan görüntüler. (A) Bu panel gösterir küçük bir düzenleyici RNA E. coli hücrelerdeki. (B) Bu panel bir mRNA U2OS memeli hücrelerinde gösterir. RNA'ların kırmızı boya ve floresans in situ hibridizasyon aracılığıyla mavi boya ile etiketlenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: örnek smFRET görüntüleme. (A)örnekleri 561-nm lazer ile heyecan. Yeşil ve kırmızı boyalar emisyonları (B) aynı anda toplanan ve yeşil (sağda) ve (sol) kırmızı noktalar, olarak sırasıyla gösterilir. (C) Bu panel temsilcisi floresan yoğunluğu vs. yeşil boya zaman yörüngeler (yeşil) gösterir ve kırmızı boya (kırmızı) bir molekül. (D) Bu panel gösterir zaman yörünge (düz mavi çizgi) benalıcısıhesaplanan FRET verimliliği vs / (ıdonör + ıalıcısı) üzerinden örnek bir molekül. PERDE izleme gizli Markov modeli ile (kesikli kırmızı çizgi) düzenlenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu melez mikroskop sistem birden fazla mikroskoplar satın almak için ortadan kaldırır. Optik tablo, tablo yükleme işçilik, yazılım ve iş istasyonu, dahil bütün parçalar için maliyet yaklaşık $230.000 toplamdır. Mag lens ve 3-b lens, dahil, özel işlenmiş parçalar yaklaşık 700 $ (farklı kurumları gerçek masrafları maliyeti bağlıdır) maliyet. Tipik piyasada bulunan entegre sistemleri tek molekül algılama tabanlı SR mikroskobu fazla 300.000 $ maliyet için ~ 400.000 ve değil kolayca smFRET ölçüm için kullanılabilir, veya epi-görüntüleme görüş makul bir alan için beyaz ışık olmadan kaynak. Böylece, burada sunulan yaklaşım görüntüleme yetenekleri eşdeğer birden çok mikroskoplar önemli ölçüde düşük bir maliyetle elde edebilirsiniz.
Bu modüle mikroskop sistem mikroskop cesetleri farklı üreticilerin temel alabilir. 3-b objektif emisyon yolundaki emisyon splitter, mikroskop gövdesi içinde veya filtre tekerlek ve objektif Yangın gövdeler arasında kullanılabilir alan içinde de dahil olmak üzere herhangi bir pozisyonda potansiyel olarak yüklenebilir. Ancak, 3-b objektif fiziksel konumunu 3-b SR görüntüleme için en iyi astigmat etkisi elde etmek için onun odak uzaklığı belirler. 10-m odak uzaklığı ile başlayan öneririz. Aslında bir ışın genişletici uyarma yolunda yüklü mag camdır. Uyarma Lazerler hava birleştiğinde ise (i.e., fiber optik olmadan), lazer ışınları collimated sonra herhangi bir yerde böyle bir Genişleticisi yüklemek için kayda değer değil. Fiber birleştiğinde uyarma lazerler ekstra yuvaları için iki lens (bir içbükey ve diğer bir dışbükey) yüklemek bakmak. Örneğin, birçok ticari aydınlatma silah nötr yoğunluk filtreleri için yuvası var. İki lensler onların odak uzunlukları toplamı ile iki yuva arasındaki uzaklığı eşit bulmak. O zaman, onlar bir mag objektif olarak çalışması için eklenebilir. Alternatif olarak, alan diyafram kaymak için bir takma varsa başka bir yer olabilir. Çıkarılabilir bir kaset mag objektifte bina bir mag objektif yönünü sadece saygısız SR görüntüleme için gerekli olabilir daha yüksek güç elde etmek için uyarma lazerler odaklanmak etkinleştirme ek bir avantaja sahiptir.
Bu raporda, esnek arasında üç farklı görüntüleme teknikleri modüle edilmiş bir mikroskop kullanarak geçiş gösterdi. Bu kurulum daha geniş ve daha gelişmiş uygulamalar için kullanılabilir. Örneğin, SR yapılandırma tek-parçacığı üzerinde fotoğraf değiştirilebilir canlı hücrelerdeki izleme için kullanılabilir veya18,19photoactivatable floresan protein öğesini biomolecules, faiz. SmFRET yapılandırması moleküler etkileşim içinde vivo sistemleri20eğitim için kullanılabilir. Emisyon splitter tabanlı çok kanallı algılama iki renkli SR görüntü veya tek-parçacık aynı anda21izleme gerçekleştirmek için SR yapılandırma ile kombine edilebilir.
Bu kurulum daha modüle bileşenleri etkinleştirmek için daha da genişletilebilir. Böylece ek uyarma/emisyon yolları-ebilmek var olmak mahluk için örnekleri etiketli IR boyalar ile düşsel bir kızılötesi (IR) lazer ile gibi ek kanallar için örneğin, bir filtre taret ve aydınlatma yuvası katmanı eklenebilir. Ek görüntüleme kanal izin vermeye ek olarak, IR lazerler SR görüntülemede edinme görüntüleme sırasında veya yazı analizi sırasında sahne drift düzeltmek için kullanılabilir. Drift düzeltme görüntüleme satın alma sırasında z-drift düzeltme sistemi mikroskop üreticisinden yoksa IR lazer ile alternatif bir sistem ya homebuilt14 olabilir veya üçüncü taraf şirketlerden satın aldı. Sonrası edinme drift düzeltme için bir IR lazer indirgeme işaretleri izlemek için kullanılabilir. 22
Tek molekül algılama tabanlı SR mikroskobu yazılım, bir veri toplama ve veri analizi için bir iki kümesi gerektirir. Veri toplama, bile lazerler ON kontrol ederken görüntüleri kameradan alır bir basit homebuilt yazılım/davranışları el ile 405 nm lazer gücü, dönen tarafından Örneğin, modüle mümkün iken SR görüntüler oluşturmak için çalışabilir bir degrade nötr yoğunluk filtresi önünde lazer yüklü. Ancak, deney bu şekilde deneyci'nın öznel yargı üzerinde yanıp sönen noktalar yoğunluğu üzerinde bağlıdır. Böylece, bu şekilde objektif değildir ve veri görüntüleme SR miktar için kullanılacak uygun olmayabilir. Dayalı veri toplama devam eden, 405 nm lazer güç otomatik modülasyon etkinleştirme ise sayım algoritması üzerinde yanıp sönen noktalar (Şekil 6) yoğunluğu / nokta algılama burada kullanılan veri alma kodu içerir. Birinin bunları kullanmak veya eklentileri için mikro-Yöneticisi gibi açık kaynaklardan bak bu günlerde, bazı mikroskop üreticileri programlanabilir görüntüleme modülleri, sağlamak. Veri analizi için mikroskop üreticilerin ticari olarak mevcut analiz modülü kullanır ya da ImageJ gibi açık kaynaklardan eklentileri için bakmak mümkündür.
Özetle, burada sunulan set-up yüksek çok yönlülük ve düşük bir maliyetle farklı görüntüleme yapılandırmaları ve uzay arasında kolay geçiş sağlar. Bu kurulum rutin ve çeşitli görüntüleme deneyler için bir ihtiyaç ile Biyoloji Bilimleri herhangi bir araştırma laboratuvarı tarafından benimsenmesi nispeten kolaydır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
J.F. Searle akademisyenler Program ve NIH yönetmenin yeni yenilikçi Ödülü destek kabul eder. Yazar Paul Selvin'ın Lab (Illinois Üniversitesi, Urbana-Champaign) 3-b objektif konumlandırma için yararlı öneriler kabul etmiş oluyorsunuz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Ti-E microscope stand | Nikon | Ti-E | |
| Objective lens | Nikon | 100X NA 1.49 CFI HP TIRF | |
| Microscopy imaging software | Nikon | NIS-Elements Advanced Research/HC | HC includes "JOBS" module, the programmed acquisition module being used for SR imaging. |
| The illumination arm | Nikon | Ti-TIRF-EM Motorized Illuminator Unit M | This arm has a slot for a magnification lens |
| Analyze block | Nikon | Ti-A | This is installed in the filter turret. |
| Z-drift correction system | Nikon | PFS | This system is composed by the stepmotor on the objective nosepiece, IR LED, and a detector. |
| Optical table top | TMC | 783-655-02R | |
| Optical table bases | TMC | 14-426-35 | |
| 647 nm laser | Cobolt | 90346 (0647-06-01-0120-100) | Modulated Laser Diode 647nm 120mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 561 nm laser | Coherent | 1280721 | OBIS 561nm LS 150mW Laser System |
| 488 nm laser | Cobolt | 90308 (0488-06-01-0060-100) | Modulated Laser Diode 488nm 60mW incl. laser head, CDRH control box, USB cable and PSU (Power Supply Unit) |
| 405 nm laser | Crystalaser | DL405-025-O | 405 (+/-5)nm, 25mW, Circular , M2 <1.3, Low Noise, CW, TTL up to 20MHz. 2 BNC connectors for TTL & Analog adjust |
| Heat sink | Cobolt | 11658 (HS-03) | Two units, Heat sink without fan HS-03, Heat sink for 647 nm and 488 nm lasers |
| Heat sink | Coherent | 1193289 | Obis heat sink with fan, 165 x 50 x 50 mm for the 561 nm laser |
| CAB-USB-miniUSB | Cobolt | 10908 | Two units, communication cable for 647 nm and 488 nm lasers |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 9146T35 | Multipurpose 6061 Aluminum, Rectangular Bar, 4MM X 40MM, 1' Long for raising 561 nm laser |
| aluminum for height adjustment | McMaster-Carr | 8975K248 | Multipurpose 6061 Aluminum, 1-1/4" Thick X 3" Width X 1' Length for raising 405 nm laser |
| BNC cable | L-com | CC58C-6 | RG58C Coaxial Cable, BNC Male / Male, 6.0 ft |
| BNC adapter | L-com | BA1087 | Coaxial Adapter, BNC Bulkhead, Grounded |
| SMA to BNC Adapter | HOD | SMA-870 | Cobolt MLD lasers have SMA interface, so this adapter is used for BNC connection. |
| SMB to BNC Adapter | Fairview Microwave | FMC1638316-12 | SMB Plug to BNC Female Bulkhead Cable RG316 Coax in 12 Inch for Coherent Obis lasers |
| Data Acquisition Card | National Instruments | PCI-6723 | 13-Bit, 32 Channels, 800 kS/s Analog Output Device for controlling lasers, DIC LED, and etc |
| Barrier Filter Wheel controller | Sutter Instrument | Lambda 10-B | Optical Filter Changer |
| Emission Splitter | Cairn | OptoSplit III | |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T640LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating red emission from green emission in OptoSplit III |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | T565LPXR-UF2 | Dichroic beamsplitter separating green & red emission from blue emission in OptoSplit III |
| Emission filter | Chroma | ET700/75M | Two units, Emission filter for red emission (like Alexa Fluor 647) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET595/50M | Two units, Emission filter for yellow/green emission (like Cy3B) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Chroma | ET525/50M | Two units, Emission filter for blue emission(like Alexa Fluor 488/GFP) in OptoSplit III as well as in the Barrier filter wheel |
| Emission filter | Semrock | FF02-447/60-25 | Emission filter for violet emission (like DAPI/Alexa Fluor 405), installed in the Barrier filter wheel |
| Dichroic beamsplitter | Chroma | zt405/488/561/647/752rpc-UF3 | Multiband dichroic beam splitter for 647, 561, 488, and 405 nm laser excitations inside of the microscope body |
| DAPI Filter set | Chroma | 49000 | installed in the microscope body |
| Nikon laser/TIRF filtercube | Chroma | 91032 | |
| 590 long pass filter | Chroma | T590LPXR-UF1 | for combining 647 nm laser and 561 nm laser |
| 525 long pass filter | Chroma | T525LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm and 561nm lasers with 488 nm laser |
| 470 long pass filter | Chroma | T470LPXR-UF1 | for combining already combined 647 nm, 561 nm and 488 nm lasers with 405 nm laser |
| Laser clean-up filter (647) | Chroma | zet640/20x | for cleaning up other wavelengths from the 647 nm laser |
| Laser clean up filter (488) | Semrock | LL01-488-25 | for cleaning up other wavelengths from the 488 nm laser |
| LED light source | Excelitas | X-Cite120LED | used only for DAPI imaging |
| Mirror mount | Newport | SU100-F3K | |
| Optical posts | Newport | PS-2 | |
| Clamping fork | Newport | PS-F | |
| Power Meter | Newport | PMKIT | For measuring laser power |
| Dichroic beamcombiner mount | Edmund Optics | 58-872 | C-Mount Kinematic Mount, for holding dichroic beamcombiners in the laser excitation assembly |
| Retaining ring | Thorlabs | CMRR | used for dichroic beamcombiner mounts |
| Fiber Adapter Plate | Thorlabs | SM1FC | FC/PC Fiber Adapter Plate with External SM1 (1.035"-40) Thread |
| Z-axis translational mount | Thorlabs | SM1Z | Z-Axis Translation Mount, 30 mm Cage Compatible |
| Achromatic Doublet lens | Thorlabs | AC050-008-A-ML | Ø5 mm, Mounted Achromatic Doublets, AR Coated: 400 - 700 nm |
| Cage Plate | Thorlabs | CP1TM09 | 30 mm Cage Plate with M9 x 0.5 Internal Threads, 8-32 Tap |
| Cage Assembly Rod | Thorlabs | ER4 | Cage Assembly Rod, 4" Long, Ø6 mm |
| Cage Mounting Bracket | Thorlabs | CP02B | 30 mm Cage Mounting Bracket |
| Single mode optical fiber | Thorlabs | P5-405BPM-FC-2 | Patch Cable, PM, FC/PC to FC/APC, 405 nm, Panda, 2 m |
| Multi mode optical fiber | Thorlabs | M42L01 | Ø50 µm, 0.22 NA, FC/PC-FC/PC Fiber Patch Cable, 1 m |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | ACN127-025-A | ACN127-025-A - f=-25.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm , a concave lens in the "mag lens" |
| Achromatic Doublet lens (mag lens) | Thorlabs | AC127-050-A | f=50.0 mm, Ø1/2" Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, a convex lens in the "mag lens" |
| Retaining ring | Thorlabs | SM05PRR | SM05 Plastic Retaining Ring for Ø1/2" Lens Tubes and Mounts, for "mag lens" |
| Nylon-tipped screw | Thorlabs | SS3MN6 | M3 x 0.5 Nylon-Tipped Setscrew, 6 mm Long, for holding "3D lens" |
| 3D lens | CVI Laser Optics | RCX-25.4-50.8-5000.0-C-415-700 | f=10 m, rectangular cylindrical lens |
| EMCCD camera | Andor | iXon Ultra 888 | |
| 100 nm multichannel beads | Thermo | T7279, TetraSpeck microspheres | |
| red dye | Thermo | Alexa Fluor 647 | |
| yellow-green dye | GE Healthcare | Cy3 | |
| green dye | GE Healthcare | Cy3B | |
| blue dye | Thermo | Alexa Fluor 488 |
References
- Lipson, S. G., Lipson, H., Tannhauser, D. S. Optical physics. , Cambridge University Press. Cambridge, UK; New York, NY. (1995).
- Török, P., Wilson, T. Rigorous theory for axial resolution in confocal microscopes. Optics Communications. 137 (1-3), 127-135 (1997).
- Klar, T. A., Hell, S. W. Subdiffraction resolution in far-field fluorescence microscopy. Optics Letters. 24 (14), 954-956 (1999).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780-782 (1994).
- Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Gustafsson, M. G. L., et al. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. Biophysical Journal. 94 (12), 4957-4970 (2008).
- Schermelleh, L., et al. Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy. Science. 320 (5881), 1332-1336 (2008).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Balzarotti, F., et al. Nanometer resolution imaging and tracking of fluorescent molecules with minimal photon fluxes. Science. 355 (6325), 606-612 (2017).
- Vaughan, J. C., Jia, S., Zhuang, X. Ultrabright photoactivatable fluorophores created by reductive caging. Nature Methods. 9 (12), 1181-1184 (2012).
- Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Hua, B., et al. An improved surface passivation method for single-molecule studies. Nature Methods. 11 (12), 1233-1236 (2014).
- Fei, J., et al. RNA biochemistry. Determination of in vivo target search kinetics of regulatory noncoding RNA. Science. 347 (6228), 1371-1374 (2015).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nature Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
- Stracy, M., Kapanidis, A. N. Single-molecule and super-resolution imaging of transcription in living bacteria. Methods. 120, 103-114 (2017).
- Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (23), 8452-8457 (2014).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. The Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Shi, X., et al. Super-resolution microscopy reveals that disruption of ciliary transition-zone architecture causes Joubert syndrome. Nature Cell Biology. 19 (10), 1178-1188 (2017).
- Youn, Y., Ishitsuka, Y., Jin, C., Selvin, P. R. Thermal nanoimprint lithography for drift correction in super-resolution fluorescence microscopy. Optics Express. 26 (2), 1670-1680 (2018).
