Artículo de método

Protocolo clínico de producir fracción Vascular estromal derivadas de tejido adiposo para potencial regeneración del cartílago

DOI:

10.3791/58363

⸱

29 de septiembre de 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Mipro Medical Clinic, 2National Leading Research Laboratory, Department of Biological Sciences, Myongji University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, presentamos un protocolo para producir una fracción vascular estromal derivadas de tejido adiposo y su aplicación para mejorar las funciones de la rodilla mediante la regeneración de tejido similar al cartílago en pacientes humanos con osteoartritis.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La osteoartritis (OA) es uno de los más comunes trastornos debilitantes. Recientemente, se hicieron numerosos intentos para mejorar las funciones de las rodillas utilizando diferentes formas de células madre mesenquimales (MSCs). En Corea, concentrados de médula y cordón de células madre procedentes de sangre han sido aprobadas por la administración de medicamentos (KFDA) Coreano para regeneración de cartílago. Además, se ha permitido una derivados del tejido adiposo stromal vascular fracción (SVF) por la KFDA para inyecciones conjuntas en pacientes humanos. SVF autóloga derivadas de tejido adiposo contiene matriz extracelular (ECM) además de las células madre mesenquimales. ECM excreta diferentes citoquinas que, junto con el ácido hialurónico (ah) y plasma rico en plaquetas (PRP) activado por el cloruro de calcio, pueden ayudar a MSCs para regenerar el cartílago y mejorar las funciones de la rodilla. En este artículo, presentamos un protocolo para mejorar las funciones de la rodilla mediante la regeneración de tejido similar al cartílago en pacientes humanos con OA. El resultado del protocolo primero fue divulgado en 2011 seguido por algunas publicaciones adicionales. El protocolo consiste en la liposucción para obtener lipoaspirates autólogo que se mezclan con colagenasa. Esta mezcla de lipoaspirates-colagenasa es luego y homogeneizada para quitar tejido fibroso grandes que puede obstruir la aguja durante la inyección. Luego, la mezcla se incuba para obtener SVF derivadas de tejido adiposo. El SVF resultante derivadas de tejido adiposo, que contienen derivados del tejido adiposo MSCs y restos de ECM, se inyecta en las rodillas de los pacientes, combinados con HA y cloruro de calcio activado PRP. Incluyen tres casos de pacientes que fueron tratados con el protocolo dando por resultado la mejora del dolor de la rodilla, hinchazón y rango de movimiento junto con evidencia de MRI de tejido similar al cartílago hialino.

Introducción

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Las células madre mesenquimales (MSCs) se sabe que tienen la capacidad de regenerar cartílago1,2,3,4,5,6. Pueden ser fácilmente obtenidos de diversas fuentes: médula ósea, sangre del cordón umbilical y tejido adiposo entre muchos otros. Entre estas fuentes, el tejido adiposo es la única fuente donde se puede obtener un número suficiente de MSCs sin cualquier expansión de la cultura para la regeneración de cartílago en ajustes clínicos7,8. Fracción vascular estromal de médula ósea autóloga (SVF) puede obtenerse fácilmente así. Sin embargo, el número de células madre contenidas en la médula ampliada de cultura no es muy bajo7,8. Sangre del cordón umbilical puede contener un número suficiente de MSCs. Sin embargo, la sangre del cordón no es una fuente fácilmente disponible de SVF autólogo.

Existen numerosos métodos de procesamiento de tejido adiposo para obtener SVF para aplicaciones clínicas. Entre estos, el método de obtención de MSCs del tejido adiposo con colagenasa, desarrollado y confirmado por Zuk et al. 5 , 6, es muy bien aceptada. Este método de uso de colagenasa se ha modificado para usos clínicos en ortopedia. Para ser aplicado a contextos clínicos, el sistema debe ser un sistema cerrado para mantener la esterilidad, manteniendo la comodidad. Una modificación particular presentada en este artículo implica la homogeneización de la lipoaspirates. Lipoaspirates de tamaño pequeño son digeridos relativamente más rápido que los más grandes que están resultando en un desgaste irregular del tejido adiposo. Además, estos lipoaspirates de tamaño más grandes puede producir tejidos fibrosos que pueden obstruir las jeringas y agujas al realizar inyecciones conjuntas9,10. Para evitar estos problemas, el lipoaspirates puede ser homogeneizada mediante corte y trituración de la lipoaspirates antes de la incubación con colagenasa. El SVF resultante derivadas de tejido adiposo puede contener más uniforme matriz extracelular (ECM) en comparación con lipoaspirates que no están homogeneizadas11. El ECM averiado en el SVF puede funcionar como un andamio de12.

En 2009, SVF autóloga derivadas de tejido adiposo se ha permitido por la administración de drogas (KFDA) cuando se procesa dentro de un centro médico con un mínimo tratamiento por un médico13Coreano. Luego, SVF autóloga derivadas de tejido adiposo ha sido utilizado como un agente potencial para mejorar las funciones de la rodilla en pacientes de osteoartritis (OA) potencialmente regenerando tejido similar a cartílago10,14,15 , 16 , 17 , 18 .

En 2011, Pak demostró por primera vez que el tejido adiposo células madre derivadas (ASCs) contenidas en el SVF derivadas de tejido adiposo puede mejorar funciones de rodilla potencialmente regenerar tejido similar a cartílago en pacientes humanos de OA cuando se inyecta con rico en plaquetas plasma (PRP) 14. Además, Pak et al han informado datos de seguridad en 2013 con 91 pacientes. La tasa de eficacia media en estos datos de seguridad fue 67%15. Posteriormente, estudios adicionales por Pak et al demostraron rodilla mejora funciones potencialmente debido a la regeneración de tejido similar al cartílago en pacientes con un menisco lagrimal y condromalacia de la rótula10,16,17 ,18. Basado en artículos registrados, se sabe que el número de células madre contenidas en 100 g de tejido adiposo por el protocolo presentado en este artículo puede variar desde 40,000,000 de 1.000.000 dependiendo de las características de pacientes8, 19 , 20 , 21 , 22 , 23.

Aquí, presentamos un protocolo clínico de OA de la rodilla humana utilizando SVF autóloga derivadas de tejido adiposo con HA y PRP activado con cloruro de calcio. La primera versión de este protocolo clínico, que implica un sistema cerrado, manual para mantener la esterilidad, se reportó en 201114. El protocolo idéntico fue optimizado, mantenimiento de esterilidad y fue reportado en 2013 y 201610,15. Aquí, se presenta el protocolo optimizado. La descripción esquemática del Protocolo se presenta en la figura 1.

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Figura 1: Descripción esquemática del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

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La aprobación y consentimiento para informar después de informes del caso fueron renunciados por el Comité de la Junta de revisión institucional de la Universidad de Myongji (MJUIRB). Además, este protocolo clínico estaba cumpliendo con las directrices de la declaración de Helsinki y la regulación de la KFDA. Para los procedimientos de los pacientes se obtuvieron Consentimientos informados.

1. la liposucción

Nota: Realizar con técnica estéril.

  1. Utilice los siguientes criterios de inclusión: (1) evidencia de MRI de la etapa 3 OA; (2) varón o hembra; (3) mayores de 18 años de edad; (4) el tejido adiposo (100-110 g) suficiente para la liposucción; (5) falta de voluntad para proceder con la intervención quirúrgica; (6) fracaso de tratamiento conservador; y el dolor incapacitante permanente (7).
  2. Utilice los siguientes criterios de exclusión: (1) enfermedad inflamatoria o tejido conectivo activa cree que afectan la condición de dolor (es decir,lupus, artritis reumatoide, fibromialgia); (2) trastorno endocrino activo que pueda impactar la condición de dolor (es decir, hipotiroidismo, diabetes); (3) trastorno neurológico activo que pueda impactar la condición de dolor (es decir, neuropatía periférica, esclerosis múltiple); (4) enfermedad pulmonar activa que requiere el uso de fármacos; y (5) sin antecedentes de inyecciones esteroides común pasados 3 meses.
  3. Poner al paciente en un quirófano con una capucha de biohazard clase A y él (o ella) en una posición supina.
  4. Limpiar la zona abdominal del paciente con 5% betadine (povidona yodada) y cubra al paciente usando la técnica estéril, exponiendo el área limpiada del abdomen para la liposucción.
  5. Aproximadamente 5 cm infero-lateral del ombligo, anestesiar dos sitios (uno a la izquierda y el otro a la derecha del ombligo) de la incisión para-ser-con una aguja (25 calibre, 1½ pulgadas) en una jeringa de 5 mL con 2 mL de lidocaína al 2% sin epinefrina mediante la inyección de cada sitio a nivel epidérmico.
  6. Anestesiar el sitio de la incisión para-ser-usando 5 mL de solución tumescente (de normal salina, 40 mL de lidocaína al 2%, 20 mL de bupivacaína 0.5%, 0.5 mL de epinefrina 1: 1000 500 mL) en jeringa de 10 mL con una aguja (calibre 25, 1½ pulgadas).
  7. Hacen 2 incisiones de 0,5 cm aproximadamente 5 cm debajo del ombligo lateralmente pellizcando la piel para aumentar la profundidad del nivel subcutáneo.
  8. Usando la cuchilla no. 11, empujar la piel levantada para atravesar el nivel subcutáneo pero no penetran a través de la pared abdominal.
  9. Mediante el uso de cánula de calibre 16 de 20 cm, anestesiar el nivel subcutáneo de la zona de abdomen entero inferior, que es a-ser-operada, con 700 a 800 mL de la solución tumescente.
  10. Después de acabado infiltración de todo bajo vientre con la solución tumescente, preparar un aparato de liposucción mediante la conexión de una cánula de 3,0 mm conectada a la jeringuilla de 60 mL (o 30 mL) para la liposucción manual o una cánula especialmente diseñada de 3.0m m conectado a un kit de la centrifugadora, una jeringa de sistema cerrado con el fin de mantener la esterilidad, conectado a una máquina del vacío para la liposucción asistida por vacío.
  11. Realizar la liposucción para obtener 100-110 g de tejido adiposo excepto solución tumescente. Cuando se realiza la liposucción, se obtiene tejido adiposo junto con la solución tumescente, que debe ser separada y eliminada.
  12. Para separar la solución tumescente, primero por gravedad, transferencia de tejido adiposo en el kit de la centrífuga a una jeringa de 60 mL y coloque la jeringa hacia abajo (es decir, que es la porción de la jeringa en la parte inferior). Esperar 5-6 min., se separará el tejido adiposo y el líquido tumescente. Retire el líquido en la parte inferior de la jeringa presionando en la parte superior del émbolo de la jeringa.
  13. Realizar los pasos anteriores 1.9-1.11 hasta que se ha acumulado un total de 100-110 g de tejido adiposo (lipoaspirates) por la rodilla.

2. preparación de mezcla de ASC/ECM con sistema cerrado estéril

  1. Después de separar la solución tumescente por gravedad y acumulando 50-55 g de lipoaspirates por cada kit de 60 mL centrífuga, un sistema cerrado estéril, colocar los kits 2 centrifugadora en una centrifugadora envase cubo y vuelta a 1600 x g durante 5 min, condensación del lipoaspirates y separar el líquido del tejido adiposo. En este proceso de más condensa, la lipoaspirates puede producir aceite graso en ciertos casos.
  2. Ser precavido no debe sacudir, retire el tapón de seguridad y el enchufe en la parte inferior del kit centrífuga.
  3. Retire el líquido de la parte inferior presionando lentamente hacia abajo en la parte superior del émbolo del kit centrífuga.
  4. Jeringa 60 mL separado, disolver 10 mg de colagenasa (5 mg de colagenasa específica para tejido conectivo24 ) y 5 mg de colagenasa específica para tejido adiposo25con 50 mL de solución salina normal.
  5. Mezclar aproximadamente 25-30 mL de lipoaspiración condensada con colagenasa disuelto (5 mg de colagenasa específica para tejido conectivo) y 5 mg de colagenasa específica de tejido adiposo en una proporción de 1:1 (v: v) conectando la jeringa de 60 mL con un kit de centrífuga mediante el uso de un conector especializado.
  6. Mezclar bien la lipoaspiración condensada y la colagenasa, empujando el contenido entre la jeringa de 60 mL y los kits de centrífuga mediante una varilla o un empujador.
  7. Transferir la mezcla de la lipoaspiración y la colagenasa a jeringas de 60 mL.
  8. Conecte cada jeringa de 60 mL que contiene la mezcla con un homogenizador de tejido que contiene las hojas.
  9. Conecte una jeringa de 60 mL vacía al otro extremo de la homogeneizadora.
  10. Empuje la mezcla a la otra jeringa de 60 mL a través del homogeneizador para 4 -6 veces, resultando en el corte y picado de la lipoaspiración.
  11. Transferir la lipoaspiración homogeneizada y la mezcla de la colagenasa a kits de 60 mL centrífuga a través de un conector especializado
  12. Coloque los kits de la centrífuga en un contenedor para ser colocados en una incubadora que ha sido precalentada a 37 ° C.
  13. Incubar los kits de dos centrífugas con la mezcla homogeneizada a 37 ° C durante 40 minutos mientras gira a 45 rpm.
  14. Después de lo 40 min de incubación, retire el recipiente de la incubadora de forma estéril. Luego, retirar los kits de la centrífuga y colocarlos en una máquina de la centrifugadora.
  15. Centrifugar la mezcla a 800 x g durante 5 min separar el SVF derivadas de tejido adiposo.
  16. Después de centrifugar, quitar el sobrenadante (que incluye colagenasa y digiere tejido adiposo) de cada kits centrífuga quitando la tapa de la jeringa en la parte superior del émbolo y colocar una jeringa de 30 mL en el émbolo apertura mediante cerradura de jeringa conexión.
  17. Lentamente Presione hacia abajo la parte del barril de la jeringa de 30 mL de sobrenadante llenar la jeringa de 30 mL.
  18. Presione hacia abajo el cuerpo de la jeringuilla de 30 mL hasta lo últimos 3-4 mL de la parte inferior del kit centrífuga, dejando sólo el último 3-4 mL de SVF derivadas de tejido adiposo. Se descarta el sobrenadante.
  19. Retire la jeringa de 30 mL de la parte superior del émbolo y llenar la jeringa con 5% de dextrosa en solución de Ringer entibiada (D5LR).
  20. Conectando la jeringa de 30 mL llenada de D5LR en la parte superior del émbolo abrir, llenar los kits de centrífuga, 3-4 ml de SVF derivadas de tejido adiposo, con D5LR hasta 55 mL.
  21. Retire la jeringa de 30 mL, tapa el émbolo y centrifugue los kits de centrifugar a 300 x g durante 4 minutos.
  22. Repita los pasos 2.17 2.21 para un total de 4 lavados. La colagenasa utilizada es xenogénica. Por lo tanto, la mayoría de la colagenasa se elimina por 4 lavados. Sin embargo, para la aprobación de la FDA, puesta a punto del Protocolo puede ser necesario eliminar por completo los residuos de colagenasa en el volumen final, aunque el monto actual de los residuos de la colagenasa puede ser lo suficientemente insignificante para los pacientes que no tienen ningún clínico efectos secundarios.
  23. Después de la centrifugación deth 4, para obtener el final SVF para inyección, saque el tapón de seguridad y el tapón en la abertura inferior del kit centrífuga, sin sacudir o girar el kit de la centrifugadora.
  24. Sujetar una jeringa de 20 mL a la base del kit de centrífuga abrir usando un conector especialmente diseñado.
  25. Tire el émbolo de la jeringa varias veces ida y vuelta a las células que se han asentado en la parte inferior del kit de la centrifugadora.
  26. Quitar el volumen total deseado de la SVF que contiene ASCs y ECM junto con otras células y tejidos (generalmente cerca de 3-4 mL de cada kit de centrífuga para inyecciones conjuntas de rodilla).

3. PRP preparado con técnica estéril

  1. Mientras se prepara el ASCs y el ECM, extraer 30 mL de sangre autóloga con 2,5 mL de anticoagulante citrato dextrosa solución.
  2. Transferencia de la sangre dibujada con los kits de centrífuga de 60 mL.
  3. Centrifugar la sangre dibujada a 730 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante en un nuevo kit de centrífuga de 60 mL. Centrifugar el sobrenadante a 1300 x g durante 4 min, dando por resultado en 3-4 mL de PRP.
  4. Justo antes de la inyección, añadir 3% (w/v) cloruro de calcio en una proporción de 10:2 (PRP: cloruro de calcio, v: v) para el PRP para activarlo.
  5. Añadir 0,5% (p/v) HA, como un andamio para el PRP activado con cloruro de calcio. Estos ASC con ECM, junto con PRP, activado por el cloruro de calcio, y HA reposar la mezcla ASC/ECM.

4. ASC/ECM mezcla-tratamiento

  1. Limpiar la rodilla del paciente con clorhexidina 5% y cubra de forma estéril.
  2. Palpar la parte anterior de la rodilla para el espacio articular entre los huesos tibiales y femorales.
  3. Anestesiar el sitio de la inyección superficial con lidocaína diluida (1 mL de lidocaína al 1% diluida con 4 mL de solución salina normal) de la piel a sólo fuera de la cápsula articular.
  4. Anestesiar el interior de la cápsula articular con ropivacaína diluida (ropivacaína de 0.75% de 1 mL diluida con 3 mL de solución salina normal).
  5. Mezcle 2 mL de HA a lo 6-8 mL de SVF contenida en una jeringa de 20 mL a través del conector de la jeringa a jeringa.
  6. Mediante el uso de un conector de jeringa a jeringa, agregar 0,4 mL de cloruro de calcio a lo 3-4 mL de PRP que ya ha sido preparado autólogo y estar preparado en una jeringa de 5 mL.
  7. Se combinan con 8-10 mL de mezcla HA/SVF en un 20 mL jeringa a través de jeringa a jeringa conector 3.5-4.5 mL de cloruro de calcio PRP en una jeringa de 5 mL.
  8. Inmediatamente inyecte lentamente la mezcla (aproximadamente 12-15 mL) en la articulación femoral tibio-femorales anterior de las rodillas con aguja de calibre 18 de 38 mm con o sin la dirección del ultrasonido.
  9. Después de la inyección, venda el sitio de inyección con presión doblando la gasa de algodón 4 x 4 4 veces y colocando cintas sobre la gasa de 4 x 4 doblada.
  10. Instruir al paciente a permanecer todavía durante 60 min permitir el accesorio de la célula.
  11. Instruir al paciente a limitar las actividades para un mínimo de 1 semana tras el alta de la clínica.
  12. Regresar a la clínica de tres inyecciones adicionales de PRP activado por cloruro de calcio durante 3 semanas.

5. después del tratamiento de seguimiento

  1. Evaluar el paciente en la semana del 2, 4 y 16 (18 o 22) para la mejora del dolor en escala visual analógica (VAS) y mejora de la función en términos de parámetros de terapia física. Determinar el índice de clasificación funcional (Vie), VAS y rango de movimiento (ROM) como se describió anteriormente26,27.
  2. Seguir al paciente después del tratamiento RM 3 meses después del tratamiento.

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Resultados

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Tres pacientes (una mujer de 87 años de edad con la etapa 3 OA, un hombre de 68 años de edad con etapa 3 OA, y una mujer de 60 años de edad con etapa 3 OA) sin cualquier pasado significativo historial médico presentó a la clínica con dolor de rodilla persistente y deseado para potencial tratamiento SVF derivadas de tejido adiposo autólogo. Los tres pacientes tenían su rodilla examinada por un cirujano ortopédico y se ofrecieron a reemplazo total de rodilla (TKR) y eran reacios a la cirugí...

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Discusión

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En 2001, Zuk et al. células madre aisladas del tejido adiposo por romper la matriz de colágeno colagenasa6. Luego, el grupo demostró que estas células madre aisladas del tejido adiposo podría transformar en cartílago y otros tejidos del mesodermo en origen, demostrando que estas células madre eran de origen mesenquimales.

Asimismo, el procedimiento presentado en este artículo es un modificado protocolo para aplicar el método similar a pacientes humanos. La prin...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El autor reconoce el apoyo del personal de la clínica médica Mipro y el diseño de la figura de Jaepil/David Lee. Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la bioenergía y programa de desarrollo de tecnología médica de la NRF financiada por MSIT número NRF-2017M3A9E4078014; y el nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia y TIC (números NRF-2017R1A2B4002315 y NRF-2016R1C1B2010308).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Material
5% Betadine (povidona yodada) Firson Co., Ltd.
2% de lidocaína Daehan Pharmaceutical Co.
Solución tumescente Myungmoon Pharm. Co. Ltd.N01BB01La solución estaba compuesta por 500 mL de solución salina normal, 40 mL de lidocaína al 2%, 20 mL de marcaína al 0,5% y 0,5 mL de epinefrina 1:1000.
Grado de investigación Liberase TL y TM Roche Applied Science 5401020001
D5LRDahan Pharm. Co., Ltd.645101072Dextrosa 5% en solución de Ringer lactato 
Solución anticoagulante de citrato dextrosa  Fenwal, Inc.NDC: 0942-0641La solución estaba compuesta por ácido cítrico al 0,8 %,
citrato de sodio al 0,22 % y dextrosa al 0,223 %.
3% (p/v) Cloruro de calcio Choongwae Farmacéutica Co.
0,5% (p/v) de HA (ácido hialurónico)Dongkwang pharm. Co., Ltd.
0.25% RopivacaínaHuons Co., Ltd.670600150
Equipo
3.0 mm Cánula WOOJU Instrumentos Médicos Co.
jeringa Luer-Lock de 60 mlBD (Becton Dickinson) 
Kit de barril de centrífuga CPL Co., Ltd.30-0827044
Homogeneizador de tejidos que contiene cuchillasCPL Co., Ltd.30-0827045
Mezclador de incubadora giratorioMedikan Co., LtdMS02060092
centrífugaHanil Scientific Inc.CE1133
Imágenes por resonancia magnéticaPhilips Medical Systems Inc.18068
Sistema de imágenes de ultrasonidoSamsung Medison co., LtdCT-LK-V10-ICM-09.05.2007
657400260670603480644902101645902030ML30200309653

Referencias

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