Medición de la temperatura del cuerpo de ratón con termómetro infrarrojo pasiva Anafilaxia sistémica y evaluación de la alergia alimentaria

Resumen

Aquí presentamos un nuevo método para medir con precisión las diferencias de temperatura del cuerpo en pasiva Anafilaxia sistémica (PSA) y modelos de ratón de alergia de alimentos utilizando un termómetro infrarrojo. Este procedimiento ha sido duplicado exactamente en resultados anteriores de PSA.

Resumen

Medición de temperatura corporal del ratón es de suma importancia para la investigación de las alergias y síntomas anafilácticos. Sondas rectales para las lecturas de temperatura es común, y se han demostrado para ser exacta y valiosa en este sentido. Sin embargo, este método de medición de la temperatura requiere los ratones anestesiados con el fin de introducir la sonda sin lesión al animal. Esto limita la capacidad de observar otros fenotipos del ratón al mismo tiempo. Para investigar otros fenotipos y medir la temperatura, sondas rectales no son ideales, y se desea otro método. Aquí, presentamos un método no invasivo de medición de la temperatura que renuncia el requisito para la anestesia del ratón manteniendo fiabilidad igual a las sondas rectales en la medición de la temperatura corporal. Usamos un termómetro infrarrojo que detecta la temperatura de la superficie corporal en rangos entre 2 y 150 milímetros. Este método de medición de la temperatura corporal tiene éxito en reproducir confiablemente las tendencias de cambio de temperatura durante los experimentos de anafilaxia pasiva sistema en ratones. Nos muestran que las temperaturas superficiales del cuerpo son aproximadamente 2,0 ° C inferiores a las mediciones de la sonda rectal, pero el grado de caída de temperatura sigue la misma tendencia. Además, utilizamos la misma técnica para observar los ratones en un modelo de alergia alimentaria para evaluar niveles de actividad y la temperatura simultáneamente.

Introducción

Medición de la temperatura corporal ha sido una parte esencial del control de los efectos de los síntomas anafilácticos en animales modelos^1,2. Las diferencias de temperatura se han medido tradicionalmente por Termómetros de sonda rectal en ratones^3,4. Con estas mediciones, los investigadores han retratado confiablemente las diferencias de temperatura entre las variables; sin embargo, este método es un procedimiento lento y causa señal de socorro a los ratones, que pueden aumentar la temperatura del núcleo corporal. Sondaje rectal también puede causar lagrimeo y la infección mucosa³. Por otra parte, los ratones se deben anestesiar para humanamente Introduzca la sonda rectal para medir la temperatura³. Este es un proceso lento, y prohíbe la medición de las temperaturas sucesivas dentro de un período corto de tiempo. Además, no se puede observar fenotipos de actividad de ratones durante este tiempo hasta que el anestésico se usa totalmente apagado, que es otro proceso desperdiciador de tiempo. Más recientemente, otros métodos confiables para medir la temperatura del cuerpo han utilizado etiquetas transpondedor infrarroja pasiva implantados subcutáneamente o transmisores de radio que incluyen un sensor de temperatura^3,5,6. Aunque se aceptan como la práctica ideal por algunos investigadores, estos métodos no son ampliamente utilizados debido a los altos costos iniciales y la angustia a los ratones, debido a la implantación quirúrgica de un sensor de temperatura debajo de la piel u otra parte del cuerpo.

Para demostrar que una diferencia de temperatura es un reflejo exacto de los síntomas en una enfermedad modelo^1,2, ratones deben estar despierto durante la medición de la temperatura y poder volver a su normal actividad fenotípica inmediatamente antes y después de la medición. Para ello, se buscó un método por el cual esto se podría conseguir.

Nuestro objetivo era conocer con precisión y a bajo costo la temperatura corporal del ratón, sin necesidad de anestesia y sin restricciones en la actividad, para permitir la observación de fenotipos conductuales durante y después del tiempo de medición de la temperatura. Para lograr este objetivo, era evidente que una técnica menos invasiva que la temperatura rectal estándar se requiere. Los termómetros infrarrojos se han utilizado durante décadas en medicina clínica, especialmente en pediatría, para obtener una lectura precisa de la temperatura. Ha sido un método alternativo que ha permitido a los clínicos en forma rápida y precisa obtener mediciones de temperatura en bebés y niños inquietos que son activamente móviles. Implementado esta misma técnica en ratones y han desarrollado un método exitoso para obtener temperaturas sin anestesia. Lo importante, nos demuestran que este método es capaz de replicar los resultados de Anafilaxia sistémica pasivo bien establecidas con respecto a cambios de temperatura, mientras que también siendo capaces de observar la actividad del ratón a través de la medición. Además, utilizamos el mismo método para evaluar temperaturas corporales de ratones alérgica a los alimentos, mientras al mismo tiempo investigar otros síntomas, para demostrar que la temperatura corporal es un fiel reflejo del nivel de actividad y fenotipo general de la ratón.

Protocolo

Todos los experimentos en animales fueron aprobados por la Comisión de uso del Institute de La Jolla y de Animal Care para Alergia e Inmunología.

1. ratón medición de temperatura corporal durante la anestesia

1. Coloque el ratón en una caja de inducción de la anestesia. Anestesiar mediante el uso de flujo de 1 L/min de oxígeno con 5% de isoflurano.
   Nota: La anestesia se confirma cuando el ratón deja de movimiento voluntario y ha estado inmóvil por más de 30 s. alternativamente, frecuencia respiratoria de monitor, y una vez ratones son respiración a 1 respiración por cada 2 s o más, se confirma la anestesia.
2. Mantenga el ratón por la nuca con un dedo índice y el pulgar y mantiene la cola con el dedo meñique para exponer la parte inferior del abdomen.
3. Coloque el sensor del termómetro infrarrojo debajo de la parte baja del abdomen manteniendo el ratón con su cuerpo paralelo al suelo.
   Nota: La superficie plana exterior del termómetro (no de la superficie del sensor) debe ser aproximadamente de 2 a 5 mm de la superficie del abdomen. Este replicar resultados de temperaturas medición mientras que los ratones no son anestesiados (descrito en la sección 2). Es importante determinar el sitio de destino del abdomen. Con el objetivo entre dos pezones superiores permite resultados consistentes.
4. Mantenga oprimido el gatillo para medir la temperatura. Asegurar la explotación estable del ratón y termómetro.

2. ratón medición de la temperatura del cuerpo sin anestesia

1. Levante el ratón por el centro de la cola.
2. Exponer el abdomen del ratón.
   1. Permitir que el ratón a una superficie de borde recto, como el labio de una jaula abierta o la tapa de la jaula con sus patas delanteras.
      Nota: Esto permite que el ratón estirar la parte superior del cuerpo y exponer el abdomen.
   2. Por otra parte, permite el ratón para mantener el borde derecho superior del termómetro y hacer el ratón sentado sobre la superficie plana exterior del termómetro con su abdomen justo sobre el sensor de infrarrojos.
      Nota: Cualquier momento que las patas traseras están descansando en la superficie del termómetro, asegúrese de que los pies no están obstruyendo el sensor de la superficie abdominal. Termómetros con pie obstrucción medirá una temperatura más baja que la del abdomen.
3. Mantenga oprimido el gatillo para medir la temperatura.
   Nota: Ratones tienden a moverse; Tenga cuidado en el mismo lugar del cuerpo de medición constantemente tomando mediciones de temperatura cuando los ratones son relativamente menos móviles.

3. pasiva Anafilaxia sistémica⁷

1. Día 0: Sensibilizar con la inmunoglobulina E (IgE).
   1. Preparar 200 μl (ratón) de IgE anti-dinitrofenilo (DNP) a una concentración de 100 μg/mL en PBS.
   2. Inyectar por vía intraperitoneal 200 μL de IgE anti-dinitrofenilo (DNP) preparado sólo en paso 3.1.1 o PBS (PBS-sólo es el control negativo). Use una aguja de 26 G para inyección. Realizar las inyecciones justo lateral a la línea media, aproximadamente entre los dos pezones más inferiores.
2. Día 1: Inducir anafilaxia con DNP-HSA.
   1. Preparar 100 μl (ratón) de DNP-HSA en una concentración de 10 mg/mL en 0.9% NaCl.
   2. Anestesiar los ratones como se describe en el paso 1.1.
   3. Medir la temperatura del cuerpo mediante la técnica descrita en el paso 1.
   4. Por vía intravenosa inyectar 100 μl de DNP-HSA preparado en el paso 3.2.1. Utilice una aguja de 30 G para la inyección. Realizar las inyecciones en el seno venoso retroorbital. Inserte la aguja en el lado medial del ojo en un ángulo bajo, con el objetivo de detrás del ojo.
   5. Después de la inyección, coloque los ratones en jaulas individuales. Asegúrese de que los ratones se recuperan de la anestesia. Observar que despertar y ser voluntariamente móviles.
   6. Medir la temperatura del cuerpo con el termómetro infrarrojo y observar su actividad cada 10 min durante 70 minutos.

4. ratón modelo de alimentos alergia^8,9

Nota: El diagrama esquemático se muestra en la figura 2.

1. Día 0: Sensibilizar a los ratones con OVA/alum.
   1. Preparar 100 μl (ratón) de huevos (0.5 mg/mL) y alumbre (10 mg/mL) en PBS. Vórtice en el ajuste bajo durante 30 minutos.
   2. Anestesiar los ratones como se describe en el paso 1.1.
   3. Utilizando una aguja de 26 G, inyectar por vía intraperitoneal cada ratón con 100 μl de la mezcla de óvulos/alumbre preparada en el paso 4.1.1.
      Nota: Vórtice la mezcla de óvulos/alumbre una vez más, brevemente antes de cada inyección, para mejor asegurar una mezcla homogeneizada. Ver paso 3.1.3 para más detalles en el sitio de inyección.
   4. Después de la inyección, coloque ratones en sus jaulas originales. Asegúrese de que los ratones se recuperan de la anestesia. Observar que despertar y ser voluntariamente móviles.
2. Día 14: Realizar una sensibilización segundo con OVA/alum.
   1. Repita los pasos 4.1.1, 4.1.2 y 4.1.3.
3. Días 28-46: desafiar a los ratones con óvulos cada dos días.
   1. Preparar 100 μl (ratón) de óvulos en una concentración de 250 mg/mL en PBS.
      Nota: La mezcla debe hacerse meciendo suavemente hacia adelante y hacia atrás con la mano en lugar de con un vórtex para minimizar la formación de burbujas.
      1. Si está usando inhibidores de alergia alimentaria, preparar los inhibidores de la⁹. Preparar 100 μl (ratón) de inhibidor a una concentración de 1 mg/mL en PBS. Esto permite una entrega de 100 μg de inhibidor para cada ratón.
         Nota: No exceda 100 μl de inhibidor por ratón, ya que los ratones sólo son capaces de manejar 200 μL de volumen total por sonda nasogástrica durante el día uno de los desafíos. Como necesario para afrontar el reto de óvulos también 100 μl, 100 μl es el máximo recomendado el volumen para el uso del inhibidor.
   2. Anestesiar los ratones como se describe en el paso 1.1.
   3. Por vía oral por sonda nasogástrica cada ratón con 100 μl de la solución de OVA (25 mg de OVA en 100 μl de PBS gavaged por ratón) que se preparó en el paso 4.3.1.
      1. Si está usando inhibidores de, utilizar las mismas técnicas que se describen en los siguientes pasos para la sonda de inhibidor (o control de PBS) preparado en el paso 4.3.1.1 30 minutos antes el desafío de la OVA. Después de 30 min, pasemos al siguiente paso.
      2. Utilice una aguja de la sonda con una jeringa de 1 mL. Tomar 100 μl de óvulos en la jeringa.
      3. Inserte la aguja en la boca; Luego, señalando la aguja hacia la izquierda o derecha de la garganta, deslice suavemente la aguja a través del esófago. Inyectar 100 μl de OVA.
         Nota: Para asegurarse de que la aguja no está en la tráquea, observar activo de respiración antes de inyectar los óvulos. La inserción de la aguja también se resistió temprano si ha entrado en la tráquea en lugar de esófago.
   4. Coloque el ratón en sus jaulas individuales. Para la observación fácil de la calidad de la materia fecal, uso de jaulas sin ropa de cama.
   5. Garantizar la recuperación de la anestesia. Observar que los ratones despertaran y voluntariamente móviles.
   6. Medir la temperatura corporal de los ratones en los puntos de tiempo 10, 20, 40 y 60 min utilizando la técnica descrita en la sección 2.

Resultados

Anafilaxia sistémica pasiva: para inyección iv, 10 semanas viejo mujer ratones BALB/c fueron anestesiados. Antes de la inyección, medimos su temperatura del cuerpo (Video 1) como se describe en el paso 1. La figura 1 muestra la tendencia de la temperatura de ambas poblaciones después de la inyección iv. El ratón sensibilizados por IgE demostró una disminución de la temperatura máxima de 3,0 ° C en 20 min, mientras que el ratón de control PBS ...

Discusión

El protocolo descrito se estableció con el objetivo de medir la temperatura corporal sin utilizar anestesia. A pesar de su relativa facilidad con que la temperatura pueden obtenerse lecturas, hay varias advertencias que acomodar a esta técnica, además de los efectos más obvios tales como manejo de estrés y diferentes temperaturas.

En primer lugar, para mantener las lecturas de la temperatura constante durante todo el experimento, el lugar donde la temperatura se está midiendo debe ser predeter...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Termómetro infrarrojo sin contacto	SinoPie	DT-8861
Anti-dinitrofenil (DNP) IgE	Sigma Aldrich	D8406-.2MG
Aguja PrecisionGlide 30 G	BD	305128
Aguja PrecisionGlide 26 G	BD	305111
Jeringa de 1 ml	BD	309659
Dinitrofenilo - albúmina sérica humana	Biosearch Technologies	D-5059-10
Ovoalbúmina de clara de huevo de gallina	Sigma Aldrich	A5503-50G
Imject Alum	ThermoFisher Scientific	77161
Agujas de alimentación animal, desechables	Fisher Scientific	01-208-87