Summary
Describimos el montaje, operación y limpieza de un aparato de flujo diseñado para la formación de biopelículas fúngicas de imagen en tiempo real bajo flujo. También ofrecemos y discutir los algoritmos cuantitativos para ser utilizado en las imágenes adquiridas.
Abstract
En la candidiasis orofaríngea, miembros del género Candida deben cumplir y crecen en la superficie de la mucosa oral mientras que bajo los efectos del flujo salival. Mientras que se han desarrollado modelos para el crecimiento bajo flujo, muchos de estos sistemas son caros, o no permiten la proyección de imagen mientras que las células están bajo flujo. Hemos desarrollado un novedoso aparato que permite el crecimiento y desarrollo de las células de la Candida albicans bajo flujo y en tiempo real de la imagen. Aquí detallamos el protocolo para el montaje y el uso de este aparato de flujo, así como la cuantificación de los datos que se generan. Somos capaces de cuantificar los tipos de las células a y separan de la diapositiva, así como determinar una medida de la biomasa en la diapositiva con el tiempo. Este sistema es económico y versátil, trabajando con muchos tipos de microscopios ópticos, como microscopios de mesa barato, y es capaz de extendido veces en comparación con otros sistemas de flujo de imágenes. En general, se trata de un sistema de bajo rendimiento que puede proporcionar información muy detallada en tiempo real sobre el crecimiento de biofilm de especies fúngicas bajo flujo.
Introduction
Candida albicans (C. albicans) es un patógeno fúngico oportunista de seres humanos que pueden infectar a muchos tipos de tejido, incluyendo superficies de la mucosa orales, provocando candidiasis orofaríngea y resultando en una menor calidad de vida para los individuos afectados1. Formación de biofilms es una característica importante para la patogenia de la C. albicans, y se han realizado numerosos estudios sobre la formación y la función de C. albicans biofilms2,3,4, 5, muchos de los cuales se realizan en estática (sin flujo) en vitro modelos. Sin embargo, C. albicans debe adherirse y crecer en presencia de flujo salival en la cavidad bucal. Han desarrollado numerosos sistemas para permitir que células vivas imágenes6,7,8,9,10. Estos diferentes sistemas han sido diseñados para diferentes propósitos, y por lo tanto cada sistema tiene diferentes fortalezas y debilidades. Hemos encontrado que muchos del flujo de los sistemas apropiados para C. albicans eran costosos, complejo requiere fabricación de partes, o no podía ser había reflejada durante el flujo y tuvo que ser parado antes de la proyección de imagen. Por lo tanto, hemos desarrollado un aparato de flujo novela para estudiar la formación de biopelículas de C. albicans bajo flujo11. Durante el diseño de nuestro aparato de flujo, seguimos estas consideraciones principales. En primer lugar, queríamos ser capaces de cuantificar varios aspectos del crecimiento del biofilm y desarrollo en tiempo real sin requerir el uso de células fluorescentes (permitiéndonos estudio cepas mutantes y aislados clínicos sin modificar fácilmente). En segundo lugar, queríamos que todas las partes a ser comercialmente disponibles con poca o ninguna modificación (es decir., no hay fabricación de encargo), permitiendo que otros más fácilmente recrean nuestro sistema y permitir fácil reparación. En tercer lugar, también hemos querido permitir extendido veces a velocidades de flujo razonablemente alta de imagen. Por último, hemos querido, después de un período de fijación para el sustrato bajo flujo, de células para controlar el crecimiento de biofilm en un período de tiempo sin la introducción de nuevas células.
Estas consideraciones nos llevaron a desarrollar el sistema de flujo recirculación dos frasco, ilustrado en la figura 1. Los dos matraces nos permiten dividir el experimento en dos fases, una fase de apego que extrae del frasco de semillas celular accesorio y una fase de crecimiento que utiliza los medios libres de células para continuar el crecimiento de biopelícula sin la adición de nuevas células. Este sistema está diseñado para trabajar con una cámara de incubación para el microscopio, con la corredera y el tubo anterior (de 2 a 5, figura 1) se coloca dentro de la incubadora, y todos los componentes colocan en un contenedor secundario grande fuera de la microscopio. Además, se utiliza un agitador de placa calefactora con un sensor de temperatura conectado para mantener células fúngicas en el matraz de accesorio a 37 ° C. Mientras está recirculando, este sistema es capaz de la proyección de imagen continua durante el flujo (puede ser más de 36 horas dependiendo de las condiciones) y puede utilizarse en la mayoría de los microscopios, incluyendo microscopios de mesa vertical o invertido. Aquí discutimos el montaje, operación, y la limpieza de los aparatos de flujo, así como proporcionar algunos algoritmos cuantitativos básicos de ImageJ para analizar los videos después de un experimento.
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Protocol
1. montar el aparato de flujo
- Configurar las piezas listadas en la Tabla de materiales de acuerdo con el esquema en la figura 1 con las consideraciones que se discuten más abajo.
Nota: Para mayor comodidad, el flujo de aparatos se dividieron en dos partes, la parte verde (todo aguas arriba de la corredera a los frascos de los medios de comunicación) y la naranja lado (todo aguas abajo de la diapositiva para los frascos de los medios de comunicación).- Asegúrese de que todo el aparato de flujo es hermético para evitar fugas, con la única excepción de los frascos de los medios de comunicación (figura 1, 1). Para lograr esto, aplique cinta de plomería a cualquier macho roscado antes de ensamblar excepto el apagador de la pulsación (PD) y 2 μm filtro botella (FB), que no requieren cinta de plomería como las juntas de goma mantienen hermético.
- Aplique oreja abrazaderas cada arponado que está bajo presión positiva durante el funcionamiento normal (es decir, aguas abajo de la bomba).
- Código de colores de uso cintas de laboratorio para identificar la ubicación de la válvula con una A o G (para fijación y crecimiento, respectivamente), la ubicación de la bomba, los lugares de conexión de la diapositiva y la conexión del filtro de 0.2 μm.
- Determinar la longitud de la tubería a utilizar basado en la distancia entre el sistema de flujo y el microscopio, teniendo en cuenta que todo el aparato de flujo aguas abajo de la bomba para los frascos (mayoría de la parte naranja) debe estar en la contención secundaria. Añadir aproximadamente 1 m de tubo extra aguas arriba de la diapositiva (y preferiblemente la trampa de la burbuja) para colocar dentro de la cámara de incubación del microscopio, ya que esto garantiza que todos los medios llegar a la diapositiva en la temperatura correcta.
- Lugar la trampa burbuja tan cerca como sea razonablemente posible a la diapositiva, preferiblemente dentro de la cámara de incubación durante un experimento (a menudo forma a lo largo de la pared del tubo de burbujas); sin embargo, tenga en cuenta que debe ser conectada a una aspiradora para operar.
- Asegúrese de que la tubería entre el FB y el 0.2 μm filtro desechable es aproximadamente 0,5 m de largo.
- Añadir un aproximadamente barra de agitación magnética de 2 cm en cada matraz de los medios de comunicación.
- Obtener algún tipo de abrazaderas de tubería para actuar como válvulas (pueden utilizarse pinzas hemostáticas).
- Para facilidad de uso, mantenga el aparato de flujo en una canasta de autoclave. Puede ser útil tener una segunda cesta más pequeños en uno más grande para permitir la separación fácil de la verde y la naranja.
- Para el frasco de fijación, usando una broca de 4 mm, perfore un agujero extra en el tapón de goma para la sonda térmica (tenga cuidado de no pasar por otro agujero). Para obtener la tubería a través de los puertos, pasar el tubo con las pinzas; una vez, abrazadera de la tubería para mantenerlo en su lugar y luego tire la pinza retroceda.
Nota: Si no es posible añadir el agujero adicional para el tapón de goma, una botella de boca ancha tornillo con un tapón de rosca de cuatro puertos puede funcionar en lugar del tapón del frasco y goma.
- Una vez montado completamente el sistema de flujo, cierre las válvulas de ambos frascos de crecimiento del lado verde y el naranja. Use agua con el tubo del matraz de accesorio y una probeta graduada a calibrar la bomba peristáltica según las instrucciones del fabricante.
2. realizar un experimento
- El día antes del experimento, comenzar a precalentar la cámara microscopio de incubación a 37 ° C y preparar una cultura de la noche a la mañana de una cepa fúngica (fluorescencia no es necesaria).
- Recoger la bomba y componentes de uso individual y en un estéril bioseguridad gabinete.
- Quitar la trampa de la burbuja y la temperatura de la sonda del aparato de flujo y colocar éstos en el gabinete de seguridad de la biotecnología.
- Desenredar y organizar el tubo, si es necesario.
- Autoclave el aparato de flujo, incluyendo las barras de agitación durante 30 minutos asegurar la esterilidad; al terminar, traslado al gabinete de seguridad de la biotecnología.
- Coloque la trampa de la burbuja, sonda de temperatura y todos los componentes de uso individual (excepto la corredera) como se muestra en la figura 1.
- Para el filtro de 0.2 μm (figura 1, 11), retire el émbolo de la jeringa de 1 mL para que sea como un "adaptador". La tubería de la FB en este extremo de la fuerza y coloque el filtro de 0.2 μm en la tubería hacia el frasco de crecimiento.
- Aplique grasa de vacío de silicona alrededor de la lengüeta del adaptador deslizante (tenga cuidado de no tener grasa en el interior) antes de conectar, como este ayuda a prevenir fugas de aire en el sistema.
- Llene el matraz de accesorio con 100 mL de extracto de levadura 1% (p/v), peptona 2% (p/v) y glucosa de 2% (w/v) (YPD) y llene el frasco de crecimiento con 200 mL de YPD. Asegúrese de que la tubería del lado verde llega a los medios de comunicación en cada matraz.
- Asegúrese de que todas las válvulas están abiertas. Coloque la trampa de la burbuja en un vacío y conecte la bomba a la tubería verde del lado aguas abajo de la trampa de la burbuja.
- La bomba el líquido con un caudal de 3.3 mL/min totalmente llenar el lado verde, luego dispensar y desechar aproximadamente 1 – 2 mL de los medios de comunicación porque los dos primeros mililitros contienen a menudo las células muertas o escombros al azar. Asegúrese de que el lado verde de la tubería se llena con los medios de comunicación y sin burbujas de aguas abajo de la trampa de la burbuja antes de proceder.
- Se llenan de la diapositiva del canal y el embalse de YPD, teniendo cuidado de no para introducir burbujas.
- Conectar la diapositiva con el aparato de flujo y la bomba más líquido para crear un buffer de unos 0,5 m en el lado naranja. Esto es para evitar que accidentalmente el aire reventado en la diapositiva en caso de reflujo.
- Preparar el aparato de flujo para el transporte al microscopio: abrazadera cerrada la entrada y salida de la trampa de burbujas y el verde y el naranja accesorio válvulas de frasco cerradas de laterales de la abrazadera. Asegurar que los tapones para el PD y el FB apretados como pueden aflojarse durante el autoclavado.
- Desconecte la bomba de la tubería para facilitar el transporte. Mueva todos los componentes, incluyendo el agitador de placa calefactora, en un contenedor secundario cerca del microscopio.
- Preparar el aparato de flujo para la proyección de imagen.
- Conecte la sonda de temperatura para el agitador de placa calefactora y comenzar a calentar el matraz de accesorio a 37 ° C. Remover los medios de comunicación a 300 rpm y mantener esto para el experimento entero.
- Montar el portaobjetos en el microscopio y utilizar cinta si es necesario, para sujetarla firmemente.
- Coloque la trampa de la burbuja en un vacío (no ha deshacer la abrazadera).
- Conecte la bomba al aparato de flujo en el lugar indicado en la figura 1.
- Arrancar la bomba con un caudal de 3.3 mL/min, déjelo funcionar durante aproximadamente 5 – 10 s y luego quite la abrazadera de entrada y salida de trampa de burbujas.
- Permita que la bomba continúe funcionando mientras calienta el matraz del accesorio. Una vez que los medios de comunicación ha circulado en todo el sistema de flujo, compruebe el funcionamiento normal.
- Revise los accesorios para escaparse en el aire arriba de la bomba (algunos formación de burbujas es normal), o el líquido escaparse hacia fuera más abajo.
- Verifique que el frasco de medio de crecimiento, PD y FB están todos los medios de goteo por el tubo de entrada (si no, esto podría indicar un filtro obstruido o una pinza de oído demasiado apretada).
- Con el microscopio, busque células adjuntas o balanceo de la diapositiva del canal. Un número excesivo de células puede indicar contaminación durante la preparación, o que la membrana de politetrafluoroetileno (PTFE) de la burbuja de la trampa hay que sustituir.
- Una vez que la cámara de incubación y matraz de accesorio son a 37 ° C, agregar suficiente cultura durante la noche de las células fúngicas al matraz de accesorio para llegar a 1 x 106 células/mL.
Nota: El volumen en μL puede calcularse mediante esta fórmula:
- Esperar 15 minutos para permitir que las células se adapte.
- Abra ambas válvulas de frasco verde y naranja lado accesorio al cerrar ambas válvulas del frasco de crecimiento para iniciar el flujo de las células.
- Espere aproximadamente 5 minutos permitir que las células llegar a la diapositiva y permiten el enfoque inicial del microscopio (este tiempo puede necesitar ser ajustado dependiendo de la longitud de la tubería del lado verde). Durante este tiempo, ajustar el microscopio a los mismos parámetros de proyección de imagen utilizado en experimentos anteriores. Si se trata de la primera carrera, siga estos pasos:
- Cambiar a un objetivo de aire de baja magnificación.
- Encontrar y centrarse en una celda adjunta o pequeño florecimiento.
- Configurar el condensador para la iluminación de Köhler, luego cambie a campo oscuro.
- Configurar el tiempo de exposición a ms de 300.
- Ajuste la intensidad de luz hasta que una pequeña célula es dim todavía claramente visible contra el fondo (una relación señal a fondo de aproximadamente 7-8 para una célula de la hija de florecimiento es un valor razonable). Nota/marca la intensidad de iluminación para experimentos futuros.
- Configurar el software para obtener una imagen cada 2 min durante 2 h.
- Comenzar la adquisición de imágenes para la fase de apego. Compruebe detrás después de aproximadamente 5 y 10 min para enfoque se ha mantenido. Si no es así, trate de ajustar el enfoque inmediatamente después de adquirir la siguiente imagen.
- Inmediatamente después de finalizada la fase de apego, guarde el archivo y luego ambas válvulas de frasco de crecimiento laterales verdes y naranjas al cerrar ambas válvulas del frasco de accesorio. Tenga cuidado de no para golpear la etapa si ninguna está dentro de la cámara de incubación.
- Desconecte la sonda del termómetro del agitador de placa calefactora.
- Retirar el matraz de accesorio el agitador de placa calefactora y coloque el frasco de crecimiento en su lugar.
- Configurar el software para adquirir una imagen cada 15 minutos más de 22 h y comenzar la adquisición de la imagen de la fase de crecimiento. Nuevo enfoque no debería ser necesario, pero se recomienda revisar el aparato de flujo después de unas horas.
- Revise los accesorios para escaparse en el aire arriba de la bomba (otra vez algunos formación de burbujas es normal), o el líquido escaparse hacia fuera abajo
- Comprobar que el frasco de medio de crecimiento, PD y FB todos goteando los medios de comunicación (si no, esto podría indicar un filtro obstruido, una pinza de oído demasiado apretada o un estorbo en un montaje de púas si las células flocular).
- Compruebe el nivel del líquido en el FB. Si los medios de comunicación se aproxima a la parte superior de la botella (más de 1,5 cm por encima de la parte superior del filtro), apriete ambos screwcaps (no afloje, como este frasco está bajo presión). Si no se aprieta más, continuar con el experimento (aunque esto puede resultar en una pérdida) y sustituir las juntas de goma en el PD y el FB después de la próxima limpieza.
- Cuando la adquisición de la fase de crecimiento ha terminado, guarde el archivo y luego abrir las válvulas de frasco de accesorio de lado verde y el naranja que pueden hacer un ruido como libera la presión en el lado naranja. Jale hacia arriba el tubo de lado verde provenientes de dos frascos de media hasta por lo menos varios centímetros por encima de los medios de comunicación. Funcionar la bomba a una velocidad alta (aproximadamente 100 mL/min o pulsado el botón de avance rápido en la bomba) para eliminar todos los medios de comunicación de la tubería, que hace la limpieza más fácil. Durante el vaciado, desconectar el aparato de flujo de la bomba y retire del microscopio.
3. Limpie el aparato de flujo
- Retire todos los componentes no autoclavables (componentes de uso individual, trampa de burbujas y sonda de temperatura) y autoclave aparato flujo durante 30 minutos descartar componentes desechables, sonda limpia con etanol al 70% y apartar trampa de burbujas.
- Finalizada la esterilización en autoclave, desechar los medios de comunicación y enjuagar y reservar frascos de medios de comunicación. Luego vuelva a conectar la trampa de la burbuja, conectar una diapositiva de ibidi canal a utilizar para la limpieza (reutilizable) y conectar el sistema de flujo a la bomba en la ubicación que se muestra en la figura 1.
- Abrazadera cierre la válvula de frasco de crecimiento lateral naranja.
- Colocar aproximadamente 200 mL de lejía sin diluir en un vaso de precipitados. Coloque los tapones de goma en el blanqueador y luego arrancar la bomba a una velocidad alta para circular cloro en todo el aparato de flujo (excepto todos los filtros). Una vez llena de cloro, detenga la bomba porque dejando la bomba en a alta velocidad puede usar y romper el tubo.
- Después del blanqueo por 15 min, mantenga los tapones de goma sobre el vaso y encienda la bomba para quitar el cloro del aparato de flujo.
- Repita los pasos 3.4 y 3.5 dos veces con exceso de agua en vez de lejía para limpiar el sistema de flujo. Durante este tiempo, limpie los filtros con agua debido a otros agentes de limpieza se corroe o atascar los filtros.
- Coloque la tubería que normalmente conectaría con el filtro de los medios de comunicación de 0.2 μm (procedente del μm 2 FB) en el agua del vaso de precipitados con los tapones de goma del paso 3.6.
- Desconecte el tubo conectado a la entrada del filtro 20 μm en línea, que generalmente puede ser tirado aparte con facilidad a pesar de la pinza de oído.
- Utilizar un frasco de vacío del filtro y una sección larga de la tubería a través de un tapón de orificio de 3 repuesto para crear un sistema de vacío que se puede conectar al aparato de flujo.
- Conectar este sistema de vacío a la entrada de la entrada del filtro 20 μm y empezar el vacío; Esto tirará agua por los filtros en la dirección inversa, eliminando las células muertas.
- Tire por lo menos 200 mL de agua a través de los filtros, luego quite la tubería del agua para vaciar las líneas de filtro de agua.
- Desconecte el sistema de vacío del filtro 20 μm, y vuelva a conectar el filtro a su tubería normal.
4. cuantificación de los Videos
Nota: Todos los archivos necesitan para convertirse en el etiqueta de imagen (TIF) formato para trabajar. Además, para comparar entre experimentos, es crítico que todas las imágenes se toman con el mismo microscopio y parámetros de proyección de imagen, como hemos comentado anteriormente.
- Descargar e instalar ImageJ si no ya instalado.
- Descargar el archivo de macro suplemental y colocarlo en la carpeta ImageJ\macros.
- Ajustar la macro provista:
- Abrir una pila de imágenes de un experimento anterior en ImageJ y seleccione un punto del tiempo con las células presentes.
- Seleccione del menú vía "imagen | Tipo | 8-bit".
- Seleccione del menú vía "imagen | Ajustar | Umbral". Marque la casilla "fondo oscuro" . Establece el menú de lista desplegable derecha rojo.
- Ajustar el valor más bajo hasta que se cubran todas las celdas en rojo con mínimo ruido exceso (algunas células no moteado está bien y se tramitarán por el macro). Anote este valor más bajo.
- Cierre la ventana de umbral y la imagen abierta.
- Seleccione del menú vía "Plugins | Las macros | Editar". Cuando se le pida para abrir un archivo: "subir de nivel una carpeta", luego seleccione la carpeta de macros y abra el archivo de macro de cuantificación de biofilm de flujo.
- Cambie el valor 15 en todas las instancias de "setThreshold (15, 255);" en el valor determinado en el paso 4.3.4. Guarde el archivo y cerrar esta ventana.
- Seleccione del menú a través de "Plugins | Las macros | Instalar"y seleccione el archivo de cuantificación del biofilm de flujo.
- Ahora, bajo el "Plugins | Las macros" menú, aparecen seis nuevas opciones para distintas cuantificaciones videos. Ejecute el análisis completo y seleccione el accesorio y el crecimiento de archivos de vídeo cuando se le pida para realizar todos los análisis disponibles sobre los datos adquiridos y generar automáticamente los archivos de salida.
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Representative Results
Imágenes representativas de un normal noche Time-lapse experimento usando tipo C. albicans las células a 37 ° C se aprecia en la figura 2A y 1 de Video suplementaria. Las imágenes han sido contraste mejorado para mejorar la visibilidad. Se realizó la cuantificación de los datos originales, y gráficos representativos pueden verse en la figura 2B. Para generar estos gráficos, los datos fueron normalizados en primer lugar a la zona de proyección de imagen (es decir, dividido por el total de área de la proyección de imagen), y la separación fue más normalizada a la biomasa, como se describe anteriormente. Además, el apego y destacamento muestran los valores acumulados en tiempo, en lugar de los valores individuales del marco generados por la macro de cuantificación del biofilm de flujo. Una vez que los gráficos han llegado a esta etapa, se pueden realizar comparaciones estadísticas mediante análisis de regresión.
Figura 1 : Esquema del aparato bifásico de caudal recirculación. Conexión líneas negras indican tubos y puntas de flecha indican la dirección del flujo durante la operación normal. (A) A general Descripción esquemática del sistema de flujo se ilustra. Para mayor comodidad, el sistema de flujo se divide en un lado verde (aguas arriba de la corredera) y un lado de la naranja (aguas abajo de la diapositiva). Números negrilla corresponden a piezas que se indican en la tabla de materiales. Etiquetas para válvulas simplemente marcan la ubicación de tubería pinzas o pinzas hemostáticas que se colocará durante los experimentos. Orden del filtro es el siguiente: 8 – 20 μm en línea filtro, filtro en línea de 9 – 10 μm, μm filtro botella (FB) 10-2 y 11 – 0.22 μm filtro desechable de uso único. Esquema no es a escala. (B) una vista cercana del tapón de goma para el frasco adjunto, ilustrando los cuatro componentes que pasan a través de los puertos: la salida de los medios de comunicación, el filtro de aire de 0.2 μm que permite intercambio de gases, la sonda de temperatura (requiere perforar un orificio extra), y los medios de comunicación volver. (C) A ver cerca del apagador de la pulsación (PD) y el FB, así como el conjunto de tapón utilizado para cada puerto. Estas botellas deben ser herméticas a la función. La tubería de salida para el PD debe alcanzar más profundo dentro de la botella que el tubo de entrada para que funcione correctamente. El rectángulo gris en el FB representa el filtro de acero. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Candida albicans tipo salvaje las células cultivadas bajo flujo a 37 ° C. (A) imágenes de microscopia de campo oscuro representante de las microcolonias que forman bajo flujo a 37 ° C en los puntos de tiempo indicado. Barra de escala = 100 μm. (B) imagen representativa del datos de cuantificación. La biomasa total en la región imágenes (determinada por análisis de densitometría ósea), la tasa acumulativa de adjunto de la celular y la separación de la biomasa por ciento (tasa de desprendimiento normalizada a la biomasa) con el tiempo se muestran para cada cepa. Datos son medios de n ≥ 3 experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video suplementario 1. Candida albicans las células de tipo salvaje cultivadas bajo flujo a 37 ° C. Esta muestra video de microscopía darkfield Time-lapse la sujeción del peso de las células al sustrato durante la fase de fijación (tiempo indicado en la esquina superior izquierda; imágenes obtenidas cada 2 min), seguido por el posterior crecimiento y desarrollo durante la fase de crecimiento (comienza a las 2 h; imágenes adquiridas cada 15 min). Media de células sembradas (1 x 106) fueron utilizado durante la fase de apego, mientras que los medios libres de células fueron utilizados durante la fase de crecimiento. Flujo es de izquierda a derecha. Barra de escala = 50 μm. por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
Utilizando el sistema de flujo señalados anteriormente permite la generación de vídeos Time-lapse cuantitativas de biofilm hongos crecimiento y desarrollo. Para permitir comparaciones entre experimentos es de vital importancia para poder garantizar los parámetros de proyección de imagen son el mismo. Esto incluye asegurar que el microscopio está configurado para la iluminación Köhler para cada experimento (muchas guías están disponibles en línea para este proceso). Aparte de los parámetros de la proyección de imagen, hay algunos pasos importantes a tener en cuenta cuando se trabaja con el aparato de flujo. En primer lugar, es importante asegurarse de que la trampa de la burbuja se mantiene bajo vacío durante el flujo, como no hacerlo conducirá al aire que se succiona a través de la trampa de la burbuja. Del mismo modo, cuando la trampa de la burbuja no es vacío (es decir, al transportar el aparato de flujo) la entrada y salida deben permanecer afianzada con abrazadera de cierre; de lo contrario saldrá a aire en a través de la membrana PTFE. Esta abrazadera no necesita ser retirado hasta que la trampa de la burbuja una vez más se coloca bajo vacío. Por último, es muy importante controlar su aparato de flujo posibles obstrucciones o fugas. La manera más eficiente para verificar obstrucciones en su sistema, es comprobar que los medios de comunicación de las entradas del frasco de crecimiento o accesorio, el PD y el FB. Los medios de comunicación de estos deben ser goteo en tasas relativamente similares si todo está funcionando sin problemas. Si una obstrucción está presente, generalmente se puede determinar la ubicación de la tubería justo aguas arriba de la obstrucción será más rígida.
Una vez obtenidos los datos, le ofrecemos numerosos macros de ImageJ para cuantificar los videos. Estas macros determinan varios parámetros de crecimiento del biofilm y el desarrollo, incluyendo una medida de la biomasa y la tasa de las células a y separan de la superficie o biofilm. A continuación se proporcionan las descripciones de las macros proporcionadas.
Análisis completo salidas automáticamente los datos y realiza todos los análisis que se indican a continuación. Esta macro puede ser ejecutada sin un archivo de imagen abierto mientras que todos los demás requieren un video abierto. Cuando se ejecuta, le indicará al usuario abrir un archivo adjunto de pila, entonces un archivo de pila de crecimiento. Después de esto, automáticamente analizar las imágenes y una carpeta de datos que contiene la información de las tablas, como se describe a continuación, en la misma carpeta que el archivo de imagen del accesorio de salida. El macro contador de accesorio se realiza sólo en el archivo adjunto; todos los análisis se realizan en una pila concatenada de los archivos de fijación y crecimiento. Los datos de salida los archivos generados son archivos de texto, pero deben ser importados en excel para facilitar su uso.
El análisis de intensidad suma a analizar cada fotograma de la ventana activa. Suma todos los valores de gris de cada píxel que esté por encima del umbral inferior señalado en el paso 4.3.7 y salidas un valor acumulado por fotograma. Los valores generados están proporcionales a la biomasa presente en el marco, hasta cualquier saturación de cámara que se produce. Los datos se deben normalizarse luego a la zona de la región de la imagen; Esto no se realiza por la macro.
El análisis del área de cobertura a analizar cada fotograma de la ventana activa para el área de la estructura que está cubierto por las células (por encima del valor umbral inferior) como un porcentaje.
El contador de conexión utilizará resta marco para determinar la intensidad de la suma de todas las células que se conectan entre cada fotograma. Así, el primer punto de datos es la biomasa de las células que se adhieren entre los fotogramas 1 y 2; el segundo punto de datos es la biomasa de las células de conexión entre los cuadros 2 y 3, etcetera. Estos datos se deben normalizarse en el área de la región de imagen. Para la legibilidad fácil, también es útil integrar este valor antes de graficar.
El contador de separación funciona de la misma como el contador de accesorio, pero invierte la sustracción de marco, que determina la intensidad de la suma de las células que separar entre cada fotograma. Estos datos también deben normalizados al área de la proyección de imagen de la región e integrados antes de graficar. Antes de la integración, estos datos pueden ser más normalizados a la intensidad de la suma total de la estructura anterior calculada en el análisis de la intensidad de la suma . Este nuevo valor representa la proporción de células que se separan de la biopelícula en ese momento, que es a menudo más datos valiosos, puesto que la biomasa de extraer células de voluntad aumentan con cada vez mayor biomasa de biofilm.
Mientras que el sistema de flujo presentado aquí es más complicado de construir y operar que otros sistemas de flujo, ofrecen varias ventajas. Muchas de estas ventajas derivan de la utilización de una diapositiva de canal disponible en el mercado. El cultivo de tejidos tratamiento disponible para estas diapositivas es suficiente para que las células de Candida para adherirse a la superficie. Además, el perfil de esta diapositiva de canal es similar a un tobogán tradicional le permite ser utilizado fácilmente en una amplia variedad de sistemas del microscopio, incluyendo microscopios verticales utilizando luz transmitida en la ampliación baja. Usando este tipo de microscopio nos permitió usar microscopía de campo oscuro, que hizo la cuantificación de datos mucho más fáciles, sobre todo en comparación a la microscopía fluorescente (como no fotoblanqueo y fototoxicidad baja). Microscopía tradicional (sin seccionamiento óptico), es el poder conservador, significado de las células objetivo contribuir con números similares de fotones a una imagen como en las células de foco de similar tamaño12. Esto significa que, a pesar de nuestro único plano de proyección de imagen, el biofilm creciente 3D aún está siendo cuantificado durante todo el experimento, a pesar de que las regiones más altas están fuera de foco. Esta proyección de imagen de plano solo tiene la ventaja de reducir significativamente el daño de fototoxicidad a las células, pero no proporciona ninguna información sobre la arquitectura 3D de la biopelícula. Sin embargo, este sistema de flujo puede también utilizarse con células fluorescentes y microscopios confocales para obtener esta información13.
Los únicos dos frasco de configuración de nuestro aparato de flujo de recirculación también tiene muchas ventajas. Primero, muchos sistemas requieren que las diapositivas previamente ser sembrado con células, sin embargo el uso de un frasco separado accesorio celular semillas nos permite la imagen y cuantificar las células que se adhieren a la diapositiva mientras que bajo flujo, y creemos que esto es más similar a lo que ocurre < C0 > en vivo. Además, previamente hemos sido capaces de ajustar nuestro microscopio para eventos de adhesión imagen y proyección de imagen de alta velocidad como ocurrieran en tiempo real, en lugar de cuantificarlos después de los hecho11. En segundo lugar, tener un frasco de crecimiento celular sin que recircula y se puede mantener libre sobre una duración extendida nos permitió entender cómo biopelículas crecen bajo flujo por más de 24 h, una duración que normalmente no se puede lograr con sistemas sin recirculación . Todavía no hemos determinado el límite superior del tiempo de lo que se puede lograr con nuestro sistema de flujo, pero hemos completado con éxito experimentos de 36 h; sin embargo, el más largo experimento, mayor será la posibilidad de una fuga o filtro tapado. Numerosos factores pueden afectar la duración posible de un experimento, incluyendo la tasa de crecimiento de las células, cómo adhesivo que son y el grado de formación de hifas, lo que hace difícil definir un límite en la duración de un experimento. Sin embargo, si se desean duraciones mucho más largas que se logra con el aparato de flujo tal como se presenta, los filtros pueden reemplazarse con una caja de esterilización en línea ULTRAVIOLETA (UV) como ha sido descrito previamente8. Esta caja de esterilización también puede permitir que el aparato de flujo a utilizar a las bacterias de la imagen; nuestro anterior intento de cepas bacterianas imagen dio lugar a la rápida obstrucción del filtro 0.2 μm. Finalmente, optamos por no para adoptar la esterilización ultravioleta, la caja es personalizada fabricada, y esto resultaría en la recirculación de las células muertas.
Otra ventaja de este sistema de flujo es que es bastante barato en comparación con sistemas comerciales, especialmente si usted necesita comprar un microscopio con él. En nuestro laboratorio, hemos sido capaces de comprar un microscopio básico mesa luz transmitida y coloque el microscopio todo dentro de una incubadora de convección estándar grande. El único requisito es que el microscopio debe tener una función de obturador (mecánica o eléctrica) para realizar microscopía de Time-lapse.
Aunque este sistema es versátil y ofrece muchas ventajas, es un método de bajo rendimiento. Nuestro aparato de flujo es incapaz de crecer cepas múltiples en paralelo, a diferencia de otros sistemas de flujo disponible. Debido a la extensa preparación y tiempo de limpieza, que sólo son capaces de realizar dos experimentos a la semana. Sin embargo, muchos otros sistemas de flujo son bastante costosas y pueden obstruir cuando se cultivan células de Candida en hifas formando las condiciones.
Además, este sistema de flujo es bastante compleja en comparación con otros y puede ser difícil de mantener en funcionamiento. Después de muchos experimentos, filtros comienzan a obstruir la tubería comienza a usar delgadamente y piezas comienzan a oxidarse o aflojan; por lo que requiere estos componentes a ser reemplazado. El uso de filtros hace que este sistema incompatible con condiciones de crecimiento de algunas cepas fúngicas; en particular, cualquier cosa que induce la floculación rápida obstruirá el filtro 20 μm. Sin embargo, con suficiente experiencia utilizando el sistema de flujo, es más fácil detectar problemas potenciales antes de que deriven en un experimento fallido. Una cosa que se puede hacer para simplificar la operación diaria de los aparatos de flujo un poco es que un maquinista de hacer una réplica de la trampa de la burbuja de la vivienda de un material apto para el autoclave (como aluminio o acero inoxidable), le permite autoclave la burbuja trampa con el resto de los aparatos de flujo, como los componentes de membrana y adaptador PTFE de la trampa de la burbuja son esterilizables en autoclave.
En conclusión, el aparato dos fases de flujo recirculación presentado representa un modelo único de la imagen y cuantificar en vitro la formación de biopelículas de hongos bajo flujo y en tiempo real. Mientras que el sistema tiene sus limitaciones, es altamente adaptable y funciona bien con la mayoría de los microscopios.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores desean reconocer el Dr. Wade Sigurdson para proporcionar valiosas contribuciones en el diseño de los aparatos de flujo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pump | Cole Parmer | 07522-20 | 6 |
| Pump head | Cole Parmer | 77200-60 | 6 |
| Tubing | Cole Parmer | 96410-14 | N/A |
| Bubble trap adapter | Cole Parmer | 30704-84 | 3 |
| Bubble trap vacuum adapter for 1/4” ID vacuum line | Cole Parmer | 31500-55 | 3 |
| In-line filter adapter (4 needed) | Cole Parmer | 31209-40 | 8,9 |
| Orange-side Y | Cole Parmer | 31209-55 | 7 |
| Green-side Y | ibidi | 10827 | 2 |
| * Slides | ibidi | 80196 | 4 |
| * Slide luers | ibidi | 10802 | 4 |
| Vacuum assisted Bubble trap | Elveflow/Darwin microfluidics | KBTLarge - Microfluidic Bubble Trap Kit | 3 |
| Media flasks | Corning | 4980-500 | 1 |
| 0.2 µm air filter | Corning | 431229 | 1 |
| Threaded glass bottle for PD and filter flask (2 needed) | Corning | 1395-100 | 5,10 |
| Ported Screw cap for PD and filter flask (2 needed) | Wheaton | 1129750 | 5,10 |
| Screwcap tubing connector | Wheaton | 1129814 | 5,10 |
| Tubing connector beveled washer | Danco | 88579 | 5,10 |
| Tubing connector flat washer | Danco | 88569 | 5,10 |
| Clamps for in-line filters and downstream Y (7 needed) | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 15100002-100 | 7,8,9 |
| Clamp tool | Oetiker/MSC Industrial Supply Company | 14100386 | N/A |
| 20 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1331 | 8 |
| 10 μm in-line media filter | Analytical Scientific Instruments | 850-1333 | 9 |
| 2 μm inlet media filter | Supelco/Sigma-Aldrich | 58267 | 10 |
| * 0.22 µm media filter | Millipore | SVGV010RS | 11 |
| * 0.22 µm media filter “adapter” | BD Biosciences | 329654 | 11 |
| Rubber stopper | Fisher Scientific | 14-131E | 1 |
| Hotplate stirrer with external probe port | ThermoFisher Scientific | 88880006 | N/A |
| Temperature probe | ThermoFisher Scientific | 88880147 | N/A |
References
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