Producción a gran escala de ARN recombinante en un andamio Circular utilizando un sistema derivado de Viroide en Escherichia coli

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para producir grandes cantidades de RNA recombinante en Escherichia coli Co expresando un ARN quimérico que contiene el ARN de interés en un andamio de Viroide y una planta de Arnt Ligasa. El principal producto es una molécula circular que facilita la purificación a homogeneidad.

Resumen

Con el aumento de interés en la biología del RNA y el uso de moléculas de ARN en aplicaciones biotecnológicas sofisticadas, los métodos para producir grandes cantidades de ARN recombinante son limitados. Aquí, describimos un protocolo para producir grandes cantidades de RNA recombinante en Escherichia coli , basado en la expresión de una molécula quimérica que contiene el ARN de interés en un andamio de Viroide y una planta de Arnt Ligasa. Los viroides son RNAs circular relativamente pequeños, no codificante, altamente vinculado de base que son infecciosos a las plantas superiores. El anfitrión planta Arnt Ligasa es una enzima reclutada por viroides que pertenecen a la familia Avsunviroidae, como berenjena viroid latente (ELVd), para mediar la circularización del RNA durante la replicación del Viroide. Aunque ELVd no replicar en e. coli, un precursor de ELVd eficientemente es transcrito por la ARN polimerasa de e. coli y procesado por la ribozimas de cabeza de martillo incrustado en células bacterianas, y los monómeros resultantes son circular por el Co expresado Arnt Ligasa alcanzando una notable concentración. La inserción de un RNA de interés en el andamio ELVd permite la producción de decenas de miligramos de recombinantes RNA por litro de cultivo bacteriano en condiciones de laboratorio regulares. Una fracción principal del producto RNA es circular, una característica que facilita la purificación del ARN recombinante a homogeneidad virtual. En este protocolo, un complementario DNA (cDNA) correspondiente del ARN de interés se inserta en una particular posición del cDNA ELVd en un plásmido de expresión que se utiliza, a lo largo de los plásmidos expresar Co berenjena Arnt Ligasa, para transformar e. coli. Coexpresión de ambas moléculas bajo el control de promotores constitutivos fuertes conduce a la producción de grandes cantidades de ARN recombinante. El ARN recombinante puede ser extraído de las células bacterianas y separado de la mayor parte del ARN bacteriano aprovechando su circularidad.

Introducción

En contraste con el ADN y las proteínas, los protocolos para producción fácil, eficiente y rentable de grandes cantidades de ARN no son abundantes. Sin embargo, investigación e industria demanda cantidades crecientes de estas biomoléculas para investigar sus propiedades biológicas únicas¹, o a emplearse en sofisticadas aplicaciones biotecnológicas, incluyendo su uso como aptámeros altamente específicos ², agentes terapéuticos³o pesticidas selectivo⁴. Transcripción in vitro y la síntesis química se utilizan en la investigación para producir RNA. Sin embargo, estos métodos im....

Protocolo

1. construcción de plásmido

1. Amplificar por PCR (o por transcripción reversa PCR si a partir de una plantilla de RNA) el cDNA correspondiente al RNA de interés usando las cartillas con extensión de 5' para permitir el montaje en el plásmido de expresión. Para evitar las mutaciones no deseadas, utilice una DNA polimerasa de alta fidelidad.
   1. Para insertar el cDNA en el plásmido de expresión por Gibson Asamblea²⁰, agregar las siguientes extensiones de 5' a los iniciadores de la polimerización en cadena: hacia delante, 5'-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'; reverso, 5'-ccctcctagggaacacatccttgaXX....

Resultados

Para producir RNA recombinante en e. coli utilizando el sistema derivado ELVd¹², el RNA de interés se injerta en un andamio ELVd ARN. Este ARN quimérico es co expresado a lo largo de la berenjena Arnt Ligasa de e. coli. Una vez procesado, troceados y circular, el ARN circular quimérico, de la que sobresale el RNA de interés, probablemente forma una ribonucleoproteína complejo con la enzima berenjena Co expresó que alcanza notable concentración en .......

Discusión

Durante la investigación los ELVd secuencia y estructura requisitos implicados en el reconocimiento por la berenjena Arnt Ligasa, nos dimos cuenta de que la expresión conjunta de ambas moléculas en el host no e. coli conducido a una inesperado gran acumulación de Viroide circular se forma en las células bacterianas¹⁹. Comprendimos que la gran acumulación de Viroide RNA en e. coli probablemente fue consecuencia de expresar Co una molécula de ARN altamente estable, como el relativa.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad	Thermo Scientific	F530S
Bpi I	Thermo Scientific	ER1011
Agarosa	Conda	8010	D1 baja EEO
Tris	PanReac AppliChem	A1086,1000
Ácido acético	PanReac AppliChem	131008.1214
EDTA	Sigma-Aldrich	E5134-500G
Bromuro de etidio	PanReac AppliChem	A1152,0025	1%
Zymoclean Gel Recuperación de ADN	Zymo Research	D4001
NanoDrop	ThermoFisher Scientific	ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England BioLabs	E2621S
DNA Clean & Concentrador	Zymo Research	D4003
Eporator	Eppendorf	4309000019
Escherichia coli DH5α	Invitrogen	18265-017
Triptona	Intron Biotechnology	Ba2014
Extracto de levadura	Intron Biotechnology	48045
NaCl	PanReac AppliChem	131659.1211
Agar	Intron Biotechnology	25999
Ampicilina	PanReac AppliChem	A0839,0010
X-gal	Duchefa	X1402.1000
N,N-dimetilformamida	PanReac AppliChem	131785.1611
NucloSpin Plásmido	Macherey-Nagel	22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3)	Novagen	69387-3
Escherichia coli HT115(DE3)			Ref. Timmons et al., 2001
Cloranfenicol	Duchefa	C 0113.0025
Glicerol	PanReac AppliChem	122329.1211	87%
KH2PO4	PanReac AppliChem	131509.1210
K2HPO4	PanReac AppliChem	122333.1211
HCl	PanReac AppliChem	131020.1211
Fenol	Scharlau	FE04791000	90%
Cloroformo	PanReac AppliChem	A3691,1000
Filtropur S 0.2	Sarstedt	83.1826.001
HiTrap DEAE Columna Sepharose FF	GE Healthcare Life Sciences	17-5055-01
Ä Sistema de cromatografía líquida KTAprime plus	GE Healthcare Life Sciences	11001313
Acrylamyde	PanReac AppliChem	A1089,1000	2K
N,N' -metilenobisacrilamida	Sigma-Aldrich	M7279-100G
Urea	PanReac AppliChem	146392.1211
Ácido bórico	PanReac AppliChem	A2940,1000
Formamida	PanReac AppliChem	A0937,2500
Azul de bromofenol	Sigma-Aldrich	B8026-5G
Xileno cianol	Sigma-Aldrich	X4126-10G
N,N′-Bis(acriloil)cistamina	Sigma-Aldrich	A4929-5G