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Biochemistry

एक परिपत्र पाड़ पर रिकॉमबिनेंट RNAs के बड़े पैमाने पर उत्पादन ई कोलाई में एक Viroid-व्युत्पन्न प्रणाली का उपयोग

Published: November 30, 2018 doi: 10.3791/58472
Automatic Translation
1, 1, 1
1Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universitat Politècnica de València, Spain

Summary

यहाँ, हम एक viroid पाड़ और एक संयंत्र tRNA ligase में ब्याज की आरएनए शामिल है कि सह-व्यक्त एक chimeric आरएनए के द्वारा ई कोलाई में रिकॉमबिनेंट आरएनए की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं. मुख्य उत्पाद एक परिपत्र अणु कि सजातीयता को शुद्धीकरण की सुविधा है ।

Abstract

आरएनए जीव विज्ञान और परिष्कृत जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में आरएनए अणुओं के उपयोग में बढ़ती रुचि के साथ, रिकॉमबिनेंट RNAs की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के तरीके सीमित हैं । यहां, हम एक viroid पाड़ और एक संयंत्र tRNA ligase में ब्याज की आरएनए शामिल है कि एक chimeric अणु की सह अभिव्यक्ति पर आधारित ई कोलाई में रिकॉमबिनेंट आरएनए की बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । Viroids अपेक्षाकृत छोटे हैं, गैर कोडिंग, उच्च आधार युग्मित परिपत्र RNAs है कि अधिक पौधों के लिए संक्रामक हैं । मेजबान संयंत्र tRNA ligase एक viroids है कि परिवार Avsunviroidae, जैसे बैंगन अव्यक्त viroid (ELVd), circularization पुनरावृत्ति के दौरान आरएनए viroid मध्यस्थता करने के लिए संबंधित द्वारा भर्ती एंजाइम है । हालांकि ELVd ई. कोलाई, एक ELVd अग्रदूत में दोहराने नहीं है कुशलतापूर्वक ई. कोलाई आरएनए पोलीमरेज़ द्वारा लिखित और बैक्टीरियल कोशिकाओं में एम्बेडेड हथौड़ा ribozymes द्वारा संसाधित है, और परिणामस्वरूप मोनोमर द्वारा परिपत्र सह-व्यक्त tRNA ligase एक उल्लेखनीय एकाग्रता तक पहुँचने. ELVd पाड़ में ब्याज की एक आरएनए के सम्मिलन नियमित प्रयोगशाला की स्थिति में बैक्टीरियल संस्कृति के प्रति लीटर रिकॉमबिनेंट आरएनए के मिलीग्राम के उत्पादन में सक्षम बनाता है. आरएनए उत्पाद का एक मुख्य अंश परिपत्र, एक विशेषता है कि आभासी सजातीयता को रिकॉमबिनेंट आरएनए की शुद्धि की सुविधा है । इस प्रोटोकॉल में, एक पूरक डीएनए (सीडीएनए) ब्याज की आरएनए के लिए इसी ELVd सीडीएनए की एक विशेष स्थिति में एक अभिव्यक्ति प्लाज्मिड है कि प्रयोग किया जाता है में डाला जाता है, प्लाज्मिड के साथ सह एक्सप्रेस बैंगन tRNA ligase, ई. कोलाईको बदलने के लिए । मजबूत गठित प्रवर्तकों के नियंत्रण में दोनों अणुओं की सह-अभिव्यक्ति रिकॉमबिनेंट आरएनए की बड़ी मात्रा के उत्पादन की ओर ले जाती है । रिकॉमबिनेंट आरएनए को बैक्टीरियल कोशिकाओं से निकाला जा सकता है और इसके प्रचलन का लाभ उठाते हुए बैक्टीरियल RNAs के थोक से अलग कर दिया जाता है.

Introduction

डीएनए और प्रोटीन के विपरीत, आरएनए की बड़ी मात्रा में आसान, कुशल और लागत प्रभावी उत्पादन के लिए प्रोटोकॉल प्रचुर मात्रा में नहीं हैं । हालांकि, अनुसंधान और उद्योग इन जैव अणुओं की मात्रा में वृद्धि की मांग उनके अद्वितीय जैविक1संपत्तियों की जांच करने के लिए, या अत्यधिक विशिष्ट aptamers के रूप में उनके उपयोग सहित परिष्कृत प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों में कार्यरत हो 2, चिकित्सकीय एजेंटों3, या चयनात्मक कीटनाशकों4। इन विट्रो में प्रतिलेखन और रासायनिक संश्लेषण आमतौर पर आरएनए का उत्पादन करने के लिए अनुसंधान में इस्तेमाल कर रहे हैं. हालांकि, इन पद्धतियों महत्वपूर्ण सीमाओं जब उत्पादों की बड़ी मात्रा में आवश्यक है जोर । तार्किक विकल्प के लिए जीवित कोशिकाओं की अंतर्जात प्रतिलेखन मशीनरी का उपयोग करने के लिए है, एक शुद्धि प्रक्रिया के बाद सेलुलर साथी से ब्याज की RNAs अलग करने के लिए । इस रणनीति के बाद, तरीकों को बैक्टीरियल कोशिकाओं में रिकॉमबिनेंट RNAs उत्पादन के लिए विकसित किया गया है, इस तरह के रूप में प्रयोगशाला के अनुकूल ई कोलाई5 या समुद्री बैंगनी phototrophic अल्फा-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum 6. बैक्टीरिया में रिकॉमबिनेंट आरएनए का उत्पादन करने के लिए सबसे अधिक तरीके एक देशी अत्यधिक स्थिर आरएनए पाड़ की अभिव्यक्ति पर निर्भर करते हैं, जैसे कि एक tRNA या एक rRNA, जिसमें ब्याज की आरएनए7डाला जाता है. इस chimeric अणु से बाहर ब्याज की आरएनए जारी की आवश्यकता लगाता है, अगर अतिरिक्त आरएनए की उपस्थिति के बहाव अनुप्रयोगों के लिए एक समस्या है8. रिकॉमबिनेंट आरएनए जैव प्रौद्योगिकी में एक और अवधारणा रिकॉमबिनेंट ribonucleoprotein कॉम्प्लेक्स है कि प्रति वांछित उत्पाद हो सकता है या ब्याज9की आरएनए की स्थिरता को बढ़ाने के लिए एक सुरक्षात्मक रणनीति के रूप में इस्तेमाल किया का उत्पादन है, 10. इसी तरह, परिपत्र RNAs के उत्पादन में भी अधिक स्थिर उत्पाद पैदा करने के लिए एक रणनीति के रूप में सुझाव दिया गया है11.

हम हाल ही में एक नई विधि के लिए ई. कोलाई में रिकॉमबिनेंट आरएनए कि उपर्युक्त अवधारणाओं के तीन में भाग लेने में बड़ी मात्रा में उत्पादन विकसित किया है: एक अत्यंत स्थिर परिपत्र आरएनए पाड़ में ब्याज की आरएनए के सम्मिलन और सह की अभिव्यक्ति एक बातचीत प्रोटीन के साथ रिकॉमबिनेंट आरएनए की संभावना एक स्थिर ribonucleoprotein जटिल है कि जीवाणु कोशिकाओं में उल्लेखनीय मात्रा में जमा12का उत्पादन. पिछले घटनाक्रम के विपरीत, हम एक आरएनए पाड़ पूरी तरह से ई. कोलाई, अर्थात् एक viroid के लिए विदेशी इस्तेमाल किया । Viroids उच्च संयंत्रों के संक्रामक एजेंटों का एक बहुत ही विशेष प्रकार है कि विशेष रूप से एक अपेक्षाकृत छोटे द्वारा गठित कर रहे है (246-401 nt) अत्यधिक आधार युग्मित आरएनए13। दिलचस्प है, viroids गैर कोडिंग RNAs है और अपने स्वयं के प्रोटीन से कोई मदद के साथ, वे संक्रमित14में जटिल संक्रामक चक्र को पूरा करने में सक्षम हैं । इन चक्रों में आरएनए-टू-आरएनए प्रतिकृति नाभिक या chloroplasts, viroid परिवार पर निर्भर करता है —Pospiviroidae या Avsunviroidae, क्रमशः-संक्रमित संयंत्र और मेजबान रक्षात्मक प्रतिक्रिया की चोरी के माध्यम से आंदोलन शामिल हैं । Viroids प्रकृति में सबसे स्थिर RNAs के बीच क्रमित किया जाना चाहिए, एक नग्न परिपत्र आरएनए होने का एक परिणाम के रूप में और संयंत्र संक्रमित कोशिकाओं के शत्रुतापूर्ण वातावरण में जीवित रहने के लिए होने. इस संपत्ति viroids विशेष रूप से उपयुक्त पाड़ों के रूप में रिकॉमबिनेंट आरएनए के लिए प्रौद्योगिकी के दृष्टिकोण में स्थिर कर सकते हैं । इसके अलावा, नई विधि सह पर आधारित है एक बातचीत संयंत्र प्रोटीन के साथ viroid पाड़ की अभिव्यक्ति । Viroids एक रोलिंग सर्किल तंत्र जिसमें मेजबान एंजाइमों की प्रक्रिया के विभिंन चरणों उत्प्रेरित भर्ती कर रहे है के माध्यम से दोहराने । विशेष रूप से कुछ viroids, अधिक विशेष रूप से उन है कि परिवार Avsunviroidae15से संबंधित हैं, ribozymes भी है कि प्रतिकृति में शामिल हैं । viroid प्रजातियों पर निर्भर करता है, viroid RNAs की प्रतिलिपि मेजबान आरएनए पोलीमरेज़ द्वितीय या chloroplastic परमाणु इनकोडिंग आरएनए पोलीमरेज़ (नेप) द्वारा मध्यस्थता है. Viroid आरएनए प्रोसेसिंग एक मेजबान प्रकार-III RNase द्वारा catalyzed लगता है, हालांकि ribozymes oligomeric आरएनए मध्यवर्ती के साथ viroids में प्रतिकृति के दौरान स्व-सट. अंत में, परिणामस्वरूप viroid मोनोमर, viroid परिवार के आधार पर, मेजबान डीएनए ligase 1 या chloroplastic isoform16,17के tRNA ligase द्वारा परिपत्रित हैं । यह आखिरी एंजाइम परिवार Avsunviroidaeमें viroids के monomeric रूपों के बंधाव में शामिल है, जैसे बैंगन उनक viroid (ELVd)18.

एक काम के दौरान अनुक्रम और ELVd कि बैंगन (मकोय melongena एल) tRNA ligase द्वारा मांयता निर्धारित की संरचनात्मक आवश्यकताओं का विश्लेषण करने के लिए, हम एक प्रयोगात्मक सह पर आधारित प्रणाली की स्थापना की ई. कोलाई में दोनों अणुओं की अभिव्यक्ति 19. हमने देखा है कि अब से अधिक इकाई ELVd टेप स्वयं-कुशलतापूर्वक ई. कोलाई कोशिकाओं में एंबेडेड हथौड़ा ribozymes के माध्यम से और है कि जिसके परिणामस्वरूप viroid मोनोमर के साथ 5 '-हाइड्रॉक्सिल और 2 ', 3 '-phosphodiester टर्मिनी थे कुशलतापूर्वक सह-व्यक्त बैंगन tRNA ligase द्वारा परिपत्र । इससे भी अधिक, परिणामस्वरूप परिपत्र viroid आरएनए ई. कोलाईमें एक अप्रत्याशित उच्च एकाग्रता तक पहुँच, अंतर्जात rRNAs12के उन से अधिक. प्रतिकृति मध्यवर्ती की अनुपस्थिति इन बैक्टीरियल कोशिकाओं में ELVd आरएनए-टू-आरएनए प्रवर्धन की कमी संकेत दिया । दिलचस्प है, viroid अणु की एक विशेष स्थिति में heterologous RNAs की प्रविष्टि परिपत्र viroid के संचय पर एक उदारवादी प्रभाव था-RNAs12व्युत्पंन । इन टिप्पणियों ने हमें बैक्टीरिया में रिकॉमबिनेंट RNAs की बड़ी मात्रा का उत्पादन करने के लिए एक विधि की कल्पना की । इस विधि में, ब्याज की RNAs के लिए इसी cDNAs ELVd सीडीएनए में डाला जाता है और परिणामस्वरूप chimeric आरएनए ई. कोलाई में एक मजबूत गठन प्रमोटर के माध्यम से व्यक्त किया जाता है । काम करने के लिए प्रणाली के लिए, ई. कोलाई सह होना चाहिए एक प्लाज्मिड के साथ परिवर्तित करने के लिए बैंगन tRNA ligase व्यक्त करते हैं । ELVd-प्राप्त अब से अधिक इकाई प्रतिलिपि एंबेडेड हथौड़ा ribozymes द्वारा संसाधित है और उचित टर्मिनी के साथ जिसके परिणामस्वरूप मोनोमर मांयता प्राप्त कर रहे है और सह द्वारा परिपत्र tRNA ligase व्यक्त की है । इस तरह, ब्याज की आरएनए viroid परिपत्र अणु से मिलकर एक बहुत स्थिर परिपत्र पाड़ में डाला जाता है । इस रिकॉमबिनेंट chimeric आरएनए सबसे शायद आगे tRNA ligase के साथ बातचीत के माध्यम से एक ribonucleoprotein परिसर के गठन के द्वारा ई. कोलाई कोशिकाओं के अंदर स्थिर है । इस विधि का प्रयोग (नीचे प्रोटोकॉल देखें), आरएनए aptamers, hairpin RNAs और अन्य संरचित RNAs आसानी से ई. कोलाई संस्कृति की प्रति लीटर की मात्रा में उत्पादन किया गया है नियमित रूप से प्रयोगशाला की स्थितियों में और सजातीयता को ले शुद्ध परिपत्र का लाभ12.

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Protocol

1. प्लाज्मिड निर्माण

  1. पीसीआर द्वारा बढ़ाना (या प्रतिलेखन पीसीआर रिवर्स अगर एक आरएनए से शुरू टेम्पलेट) सीडीएनए अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में विधानसभा की अनुमति देने के लिए 5 ' विस्तार के साथ प्राइमरों का उपयोग कर ब्याज की आरएनए के लिए संगत. अवांछित उत्परिवर्तनों से बचने के लिए, एक उच्च निष्ठा डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करें ।
    1. गिब्सन विधानसभा20द्वारा अभिव्यक्ति प्लाज्मिड में सीडीएनए डालने के लिए, पीसीआर प्राइमरों के लिए निंनलिखित 5 ' एक्सटेंशन जोड़ें: फॉरवर्ड, 5 '-tctccccctcccaggtactatccccttXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3 '; रिवर्स, 5 '-ccctcctagggaacacatccttgaXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3 '; एक्स न्यूक्लियोटाइड मुताबिक़ का प्रतिनिधित्व करता है के लिए ब्याज की आरएनए के टर्मिनल समाप्त होता है ।
    2. ९८ डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए मशीन, ९८ डिग्री सेल्सियस पर 10 एस के 30 चक्र के बाद, 30 एस ५५ डिग्री सेल्सियस पर और 30 एस ७२ ° c पर, और 10 मिनट के एक अंतिम विस्तार में ७२ ° c ।
  2. डाइजेस्ट १०० प्लाज्मिड pLELVd के एनजी-BZB के 10 प्रकार के साथ-आईआईएस प्रतिबंध एंजाइम Bpi मैं 1 के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस में एक 20 µ एल में प्रतिक्रिया में एक ०.५ मिलीलीटर ट्यूब में बफर जी (10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच ७.५, 10 मिमी MgCl2, ५० मिमी NaCl , ०.१ मिलीग्राम/एमएल BSA) ।
    नोट: सभी plasmids इसी लेखक के अनुरोध पर उपलब्ध हैं । Bpi मैं किउ i के समकक्ष है ।
  3. ट्रो द्वारा पीसीआर व पाचन उत्पादों को अलग-थलग कर 1% agarose जेल में ताे बफर (४० एमएम Tris, 20 एमएम एसिटिक एसिड, 1 एमएम EDTA, पीएच ७.२) में भरकर । २०० में झटकों से 15 मिनट के लिए जेल दाग-०.५ µ g/एमएल ethidium ब्रोमाइड की मिलीलीटर । एक यूवी transilluminator का उपयोग कर डीएनए कल्पना और प्रवर्धित सीडीएनए और Bpi मैं पचा प्लाज्मिड (२०४६ बीपी) एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करने के लिए इसी बैंड काट ।
    नोट: Bpi मैं pLELVd के पाचन-BZB भी एक ५२८ बीपी LacZ ब्लू-व्हाइट रिपोर्टर को इसी उत्पाद विज्ञप्ति ।
  4. Elute सिलिका जेल कॉलम का उपयोग कर जेल टुकड़े से DNAs (जेल डीएनए रिकवरी किट सामग्री की तालिकामें) और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक विश्लेषण द्वारा डीएनए एकाग्रता को बढ़ाता है ।
  5. एक गिब्सन विधानसभा प्रतिक्रिया प्रवर्धित सीडीएनए और पचा प्लाज्मिड का उपयोग कर सेट करें । का प्रयोग करें एक 3-दाढ़ संमिलित की अधिक से अधिक वेक्टर बनाम 20। ५० डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन और एक सिलिका जेल कॉलम ( सामग्री की तालिकामें डीएनए स्वच्छ और संकेंद्रक किट) का उपयोग कर प्रतिक्रिया उत्पादों को शुद्ध ।
  6. electroporate सक्षम ई. कोलाई DH5α कोशिकाओं के लिए गिब्सन विधानसभा प्रतिक्रिया के शुद्ध उत्पादों का प्रयोग करें । 1-mm electroporation cuvettes का प्रयोग, निंनलिखित सेटिंग्स लागू करें: १,५०० वी और 5 ms. catabolite दमन (समाज; 20 g/l tryptone, 5 g/l खमीर निकालने, ०.५ g/l NaCl, २.५ mm KCl, 10 मिमी MgCl2 के साथ सुपर अनुकूलित शोरबा में ३७ ° c पर 1 घंटे के लिए मशीन , 20 मिमी ग्लूकोज, पीएच ७.०) तरल मध्यम और फिर Luria पर फैले-Bertani (LB; 10 g/l tryptone, 5 g/l खमीर निकालें, 10 g/l NaCl) आगर (१.५%) प्लेटों वाले ५० µ g/mL एम्पीसिलीन.
    1. करने के लिए इसी की संभावना सम्मिलित ई. कोलाई क्लोन शामिल करने के लिए स्क्रीन करने के लिए, electroporated कोशिकाओं को चढ़ाना से पहले 15 मिनट, प्रसार 30 µ एल के ५० मिलीग्राम/एमएल 5-ब्रोमो-4-क्लोरोफ्लूरोकार्बन-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (एक्स-gal) में dimethylformamide । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर मशीन प्लेटें ।
  7. कई सफेद कालोनियों उठाओ और तरल पौंड मीडिया में ३७ ° c पर रात भर हो जाना । एक miniprep किट ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर plasmids शुद्ध और ताे बफर में 1% agarose जेल में ट्रो द्वारा उनके आकार का विश्लेषण ।
  8. pLELVd-BZB नियंत्रण की तुलना में electrophoretic माइग्रेशन पर आधारित सबसे संभावित रिकॉमबिनेंट प्लाज्मिड का चयन करें । के अनुक्रम की पुष्टि करें चयनित प्लाज्मिड प्राइमर का उपयोग कर sequencing 5 '-CCTTTTTCAATATTATTGAAGC-3 ' और 5 '-GATGCTCGTCAGGGGGGCGGAG-3 ' कि pLELVd-BZB में पूरे अभिव्यक्ति कैसेट पार्श्व ।
    नोट: याद रखें कि इस प्लाज्मिड में LacZ मार्कर के साथ ५२८ बीपी polylinker होता है जो ब्याज की सीडीएनए से बदल दिया जाता है । सही रिकॉमबिनेंट plasmids का चयन करने के लिए प्रतिबंध मैपिंग मदद कर सकता है ।

2. आरएनए अभिव्यक्ति

  1. सह electroporate (१.६ में देखें शर्तें) चयनित ई. कोलाई तनाव (ई. कोलाई BL21 या एक BL21 व्युत्पंन) pLELVd-BZB-व्युत्पंन है कि ब्याज की आरएनए और सीडीएनए प्लाज्मिड के लिए इसी p15LtRnlSm शामिल करने के साथ सह-व्यक्त बैंगन tRNA ligase. ई. कोलाई HT115 (DE3) है, जो RNase III21का अभाव है, का उपयोग करने के लिए लंबे समय से डबल असहाय क्षेत्रों के साथ RNAs व्यक्त करते हैं ।
    नोट: दोनों आरएनए के हित और tRNA ligase mRNA ई. कोलाई आरएनए पोलीमरेज़ द्वारा लिखित हैं । कोई DE3 lysogen T7 आरएनए पोलीमरेज़ व्यक्त करने के लिए ई. कोलाई तनाव में आवश्यक है, हालांकि इस lysogen की उपस्थिति कोई बचके प्रभाव है.
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस में समाज तरल माध्यम में 1 एच की मशीन के बाद, प्लेट electroporated बैक्टीरिया पौंड ठोस मध्यम में ५० µ g/एमएल एम्पीसिलीन और ३४ µ g/एमएल क्लॉरॅंफेनिकोल । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  3. एक कॉलोनी उठाओ और एक 1 एल inoculate Erlenmeyer कुप्पी के साथ २५० मिलीलीटर की तरल भयानक शोरबा (टीबी) मध्यम (12 g/L tryptone, 24 जी/एल खमीर निकालने, ०.४% ग्लिसरॉल, ०.१७ m KH2पो4, और ०.७२ m K2HPO4), युक्त ५० µ g/mL एम्पीसिलीन और ३४ µ g/मब क्लॉरॅंफेनिकोल । प्रति मिनट १८० क्रांतियों पर जोरदार झटकों के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन (rpm) । संस्कृति टीका के बाद 12 और 16 ज के बीच फसल बैक्टीरिया ।

3. आरएनए निष्कर्षण और शुद्धि

  1. विश्लेषणात्मक प्रयोजनों के लिए, वांछित समय अंक में संस्कृति के 2 मिलीलीटर aliquots ले लो और 2 मिनट के लिए १४,००० x g पर केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ें और ५० µ l को ते बफ़र (10 mm Tris-HCl, pH ८.०, और 1 mm EDTA) में से कोशिकाओं को पुनः निलंबित कर दें ।
    1. एक 1:1 के एक खंड (५० µ एल) जोड़ें (v/v) phenol के मिश्रण (पानी के साथ संतृप्त और पीएच ८.० में Tris-एचसीएल, पीएच ८.० के साथ equilibrated) और क्लोरोफॉर्म । जोरदार भंवर से कोशिकाओं को तोड़ने और १४,००० x gपर 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा जलीय और कार्बनिक चरणों अलग
    2. ध्यान से जलीय चरणों (ऊपरी) है कि कुल बैक्टीरियल आरएनए शामिल ठीक हो ।
      नोट: तैयारी बाद में विश्लेषण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है ।
  2. preparative प्रयोजनों के लिए, एक २५० मिलीलीटर की बोतल में संस्कृति डालो और 10 मिनट के लिए १४,००० x g पर नीचे सेल स्पिन । supernatant त्यागें । 30 मिलीलीटर पानी में रिसस्पेंड करके कोशिकाओं को धो लें । एक केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और कोशिकाओं को नीचे फिर से एक ही स्थिति के तहत स्पिन ।
  3. supernatant को छोड़ें और क्रोमैटोग्राफी बफ़र (५० mm Tris-HCl, pH ६.५, १५० mm NaCl, ०.२ mm EDTA) के 10 मिलीलीटर में कक्षों को फिर से निलंबित करें ।
    नोट: इस समय, कोशिकाओं पर जम किया जा सकता है-20 ° c किसी भी अन्य क्षण में शुद्धि के साथ आगे बढ़ने के लिए.
  4. एक ताजा या गल बैक्टीरियल तैयारी का उपयोग करना, phenol के 1 खंड (10 मिलीलीटर) जोड़कर कोशिकाओं को तोड़ने: क्लोरोफॉर्म (३.२ कदम देखें) और जोरदार भंवर ।
  5. १२,००० x gपर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक, जलीय चरण ठीक हो और 1 मात्रा (क्लोरोफॉर्म के 10 मिलीलीटर) के साथ पुनः निकालने के एक ही परिस्थितियों में ।
    नोट: आरएनए तैयारी इस बिंदु पर-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  6. इसके अलावा आयनों-विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा कुल बैक्टीरियल आरएनए शुद्ध. एक ४५ µm सिरिंज फिल्टर और एक 1 एमएल diethylethanolamine (डीएए) स्तंभ पर लोड के माध्यम से आरएनए तैयारी फ़िल्टर.
    1. क्रोमैटोग्राफी शुद्धि के लिए, 1 मिलीलीटर/मिनट की एक प्रवाह दर पर एक तरल क्रोमैटोग्राफी प्रणाली का उपयोग करें । नमूना लोड करने से पहले, क्रोमैटोग्राफी बफ़र के 10 मिलीलीटर के साथ स्तंभ equilibrate (संरचना के लिए चरण ३.३ देखें) ।
    2. नमूना लोड और क्रोमैटोग्राफी बफर के 10 मिलीलीटर के साथ कॉलम धोने । Elute आरएनए के साथ 20 एमएल का रेफरेंस बफर (५० एमएम Tris-एचसीएल, पीएच ६.५, 1 एम NaCl, ०.२ एमएम EDTA) और 1 एमएल aliquots लीजिए ।
      नोट: आरएनए जल्दी प्रारंभिक अंशों में elutes. आगे की शुद्धि के लिए कॉलम का पुन: उपयोग किया जा सकता है । इसके लिए, कॉलम को 10 मिलीलीटर पानी से धोकर 20% इथेनॉल में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें ।
  7. के बाद से रिकॉमबिनेंट आरएनए का एक प्रमुख हिस्सा ई. कोलाई में एक परिपत्र रूप में जमा, इस संपत्ति के लिए एकरूपता12शुद्धि के लिए लाभ हो सकता है । अलग परिपत्र RNAs से रेखीय समकक्षों द्वारा दो आयामी polyacrylamide जेल ट्रो (2d पृष्ठ) संयोजन गैर denaturing और denaturing (8 एम यूरिया) शर्तों12,22.

4. आरएनए विश्लेषण

  1. एक 5% polyacrylamide जेल (37.5:1 acrylamyde:n, n '-methylenebisacrylamide, जन अनुपात) TBE बफर में तैयार (८९ मिमी Tris, ८९ मिमी बोरिक एसिड, 2 मिमी EDTA) 8 मीटर यूरिया युक्त.
  2. 1 खंड (20 µ l) के साथ एक आरएनए तैयारी की 20 µ एल मिश्रण बफर लदान (९८% formamide, 10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच ८.०, 1 मिमी EDTA, ०.००२५% bromophenol नीला, और ०.००२५% xylene cyanol), एक हीटिंग ब्लॉक में ९५ डिग्री सेल्सियस पर १.५ मिनट के लिए मशीन, और बर्फ पर शांत तस्वीर ।
  3. polyacrylamide जेल में नमूने लोड और जेल आयामों के आधार पर उपयुक्त स्थितियों पर ट्रो चलाने (उदा., २.५ एच के लिए २०० V पर १४० x १३० x 2 मिमी जैल भागो) । ०.५ µ जी/एमएल ethidium ब्रोमाइड में 15 मिनट के लिए जेल दाग, पानी से धो, और यूवी प्रकाश के तहत आरएनए कल्पना ।

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Representative Results

ELVd-व्युत्पंन प्रणाली12का उपयोग कर ई. कोलाई में रिकॉमबिनेंट आरएनए का उत्पादन करने के लिए, ब्याज की आरएनए एक ELVd आरएनए पाड़ में भ्रष्टाचारी है । इस chimeric आरएनए सह है ई. कोलाईमें बैंगन tRNA ligase साथ व्यक्त की है । एक बार संसाधित, सट और परिपत्र, chimeric परिपत्र आरएनए, जिसमें से ब्याज बहर की आरएनए, संभावना सह के साथ एक ribonucleoprotein परिसर रूपों-व्यक्त बैंगन एंजाइम कि बैक्टीरियल कोशिकाओं में उल्लेखनीय एकाग्रता तक पहुँच जाता है ( चित्रा 1) । नतीजतन, इस प्रणाली का उपयोग रिकॉमबिनेंट आरएनए का उत्पादन करने के लिए पहला कदम ELVd सीडीएनए में एक विशेष स्थिति में ब्याज की आरएनए के लिए संगत सीडीएनए डालने के होते हैं, T245 अनुक्रम संस्करण T246 में ELVd-AJ536613. प्लाज्मिड pLELVd-BZB, जो दो Bpi मैं मांयता साइटों और एक LacZ ब्लू/सफेद मार्कर जीन के साथ इस स्थिति पर एक polylinker शामिल है, बहुत ही कुशल गिब्सन विधानसभा विधि20द्वारा इस प्रविष्टि की सुविधा । रूपांतरित ई. कोलाई क्लोन का चयन वांछित रिकॉमबिनेंट plasmids युक्त LacZ मार्कर के नीले/सफेद स्क्रीनिंग द्वारा की सुविधा है । Plasmids जिसमें डबल Bpi मैं पाचन अधूरा था और सम्मिलित होने की संभावना एक्स-लड़की की उपस्थिति में नीले रंग की कालोनियों का उत्पादन शामिल नहीं कर सका. चित्रा 2 कई रिकॉमबिनेंट plasmids के electrophoretic विश्लेषण से पता चलता है जिसमें विभिन्न cDNAs सम्मिलित किए गए थे. ये plasmids pLELVd-BZB की तुलना में भिन्न माइग्रेशन दिखाते हैं. ध्यान दें कि pLELVd-BZB में LacZ मार्कर (५२८ bp) होता है जिसे सीडीएनए के द्वारा शाही सेना के हित में प्रतिस्थापित किया जाता है । तो, हालांकि यह डाला सीडीएनए के आकार पर निर्भर करता है, रिकॉमबिनेंट plasmids आमतौर पर तेजी से नियंत्रण प्लाज्मिड (चित्रा 2) से विस्थापित ।

pLELVd-BZB-डेरिवेटिव है कि ब्याज की RNAs के लिए इसी cDNAs शामिल p15LtRnlSm ई. कोलाईसह के साथ प्रयोग किया जाता है । एम्पीसिलीन और क्लॉरॅंफेनिकोल युक्त प्लेटों पर सह-रूपांतरित जीवाणुओं का चयन किया जाता है । फिर, चयनित ई. कोलाई क्लोन अमीर टीबी के माध्यम में मजबूत आंदोलन के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर हो रहे हैं । इस संस्कृति की स्थिति के तहत, रिकॉमबिनेंट आरएनए का उत्पादन12अधिकतम है । बैक्टीरिया में रिकॉमबिनेंट आरएनए की उपस्थिति एक बफर की उपस्थिति में phenol और क्लोरोफॉर्म के मिश्रण के साथ कोशिकाओं को तोड़ने और आरएनए, जलीय बफर में जो विभाजन, denaturing पृष्ठ द्वारा विश्लेषण के साथ आसानी से निगरानी की जा सकती है । चित्रा 3 शो ethidium ब्रोमाइड सना polyacrylamide जैल जिसमें अलग ई. कोलाई क्लोन से कुल RNAs अलग हो गए. चित्र मजबूत बैंड है कि खाली ELVd और chimeric ELVd रूपों जिसमें ब्याज की विभिंन RNAs डाला गया के अनुरूप दिखा । दिलचस्प है कि हम परिपत्र रूप के रूप में रिकॉमबिनेंट आरएनए का एक बड़ा अंश पाते हैं । उच्च और कम ईओण की ताकत पर denaturing शर्तों के तहत दो पृष्ठों का एक संयोजन का उपयोग करना, रिकॉमबिनेंट आरएनए के मुख्य अंश के परिपत्र आसानी से देखा जा सकता है (चित्रा 4).

बहाव आवेदन के आधार पर, ब्याज की chimeric ELVd-आरएनए शामिल कुल ई. कोलाई आरएनए तैयारी वर्तमान प्रोटोकॉल का लक्ष्य हो सकता है. हालांकि, आरएनए तैयारी आगे आयनों-विनिमय क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया जा सकता है जब जरूरत है । 5 चित्रा में वर्णलेख कम ईओण ताकत (१५० mM NaCl) और उच्च ईओण ताकत (1 एम NaCl) में बाद में रेफरेंस पर कॉलम पर ई. कोलाई आरएनए के कुशल प्रतिधारण से पता चलता है । आरएनए के अधिकांश भागों 2 और 3 में एकत्र किया जाता है । रिकॉमबिनेंट आरएनए को एकरूपता के लिए शुद्ध करने के लिए, प्रचलन का लाभ लिया जा सकता है । परिपत्र RNAs denaturing शर्तों22में उनके रैखिक समकक्षों के संबंध में देरी कर रहे हैं । इन RNAs को ethidium ब्रोमाइड दाग के बाद जेल से eluted जा सकता है । एक solubilizable polyacrylamide जेल का उपयोग, जैसे कि उन पार एन के साथ जुड़े हुए, n '-बीआईएस (acryloyl) cystamine23, रिकॉमबिनेंट RNAs (चित्रा 6) की बड़ी मात्रा के शोधन की सुविधा ।

Figure 1
चित्रा 1: viroid-आधारित प्रणाली के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व ई. कोलाईमें रिकॉमबिनेंट आरएनए का उत्पादन करने के लिए । सीडीएनए (९८ nt-लंबी आरएनए aptamer पालक) इस योजना में प्लाज्मिड pLELVd-BZB में डाला जाता है । ई. कोलाई सह है pLELVd-BZB-व्युत्पंन और सह को प्लाज्मिड p15LtRnlSm के साथ बदल-एक्सप्रेस बैंगन tRNA ligase । ई. कोलाई में, chimeric ELVd-पालक आरएनए प्रतिलिपि viroid हथौड़ा ribozymes द्वारा स्वयं-सट (red ऐरोहेड) है । परिणामी मोनोमर सह-व्यक्ती tRNA ligase व परिपत्र द्वारा मान्यता प्राप्त है. रिकॉमबिनेंट आरएनए एक परिपत्र viroid पाड़ जिसमें से ब्याज की आरएनए (हरे रंग में) बहर के होते हैं । tRNA ligase के साथ ribonucleoprotein परिसर के स्थिरीकरण से ई. कोलाई की संभावना परिणाम में बड़ी मात्रा में रिकॉमबिनेंट आरएनए के संचय । विभाजन ELVd सीडीएनए के अलावा, प्लाज्मिड pLELVd-BZB एक पीयूसी प्रतिकृति मूल (पीयूसी ओरि) शामिल हैं, एक एम्पीसिलीन चयन जीन (Ampआर), ई. कोलाई murine लिपोप्रोटीन (lpp) प्रमोटर और rRNA (rrnC) टर्मिनेटर, और LacZ मार्कर. प्लाज्मिड p15LtRnlSm एक p15A प्रतिकृति मूल (p15A ओरि), एक क्लॉरॅंफेनिकोल प्रतिरोध जीन (सेमीआर), ई. कोलाई lpp प्रमोटर और एक फेज T7 प्रतिलेखन टर्मिनेटर शामिल हैं, बैंगन tRNA ligase सीडीएनए के अलावा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: pLELVd-BZB-व्युत्पन्न अभिव्यक्ति plasmids का Electrophoretic विश्लेषण जिसमें रुचि के विभिन्न cDNAs शामिल हैं. Plasmids एक 1% agarose जेल है कि ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग था में ट्रो द्वारा अलग किया गया । लेन 1, बाईं तरफ घटकों में से कुछ के kbp में आकार के साथ डीएनए मार्कर; लेन 2, pLELVd-BZB; लेन 3, pLELVd-BZB एक खाली ELVd व्यक्त करने के व्युत्पंन; गलियाँ 4 से 7, pLELVd-BZB डेरिवेटिव आरएनए aptamer पालक (लेन 4), streptavidin बाइंडिंग aptamer (लेन 5), एक आरएनए hairpin के साथ एक निरंतर ४२ बीपी डबल-कतरा क्षेत्र (लेन 6), और 3 ' कैप-स्वतंत्र अनुवाद बढ़ाने (हवाले) एक संयंत्र के साथ व्यक्त करने के लिए वायरस (लेन 7) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: रिकॉमबिनेंट आरएनए viroid आधारित प्रणाली का उपयोग कर ई. कोलाई में उत्पादित. विभिंन ई. कोलाई क्लोन से कुल RNAs phenol के साथ उपचार द्वारा निकाले गए: क्लोरोफॉर्म और aliquots denaturing पृष्ठ से अलग । जैल ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग दिखाए जाते हैं । रिकॉमबिनेंट RNAs ई. कोलाई (अ) BL21 (DE3) और (ब) HT115 (DE3) में उत्पादित थे. (A और B) गलियाँ 1, बाईं ओर nt में आकारों के साथ आरएनए मार्कर; गलियाँ 2, RNAs ई. कोलाई क्लोन से एक खाली ELVd (३३३ nt) व्यक्त करने के लिए । (क) लेन 3 और 4, RNAs ई. कोलाई क्लोन से aptamer पालक (९८ nt) और streptavidin बंधन aptamer (४२ nt), क्रमशः युक्त एक chimeric ELVd रूप व्यक्त करने के लिए । (ख) लेन 3, एक ई. कोलाई क्लोन से RNAs एक chimeric ELVd एक ४२ बीपी लंबी डबल कतरा आरएनए युक्त फार्म व्यक्त करने के लिए । लाल तीर वृत्ताकार रिकॉमबिनेंट RNAs को इंगित करते हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: रिकॉमबिनेंट आरएनए का प्रचलन ई. कोलाई में उत्पादित viroid-आधारित प्रणाली का उपयोग कर. एक ई. कोलाई क्लोन से कुल RNAs एक chimeric ELVd कि aptamer पालक शामिल व्यक्त करने के लिए 2 डी denaturing पहले उच्च के तहत और फिर कम ईओण ताकत के तहत पृष्ठ से अलग किया गया । जैल ethidium ब्रोमाइड से सना हुआ था । नीले तीर electrophoretic प्रवास के दिशाओं का संकेत है । लाल तीर परिपत्र ELVd-पालक है कि चुनिंदा दो जुदाई के दौरान एक ही आकार के रेखीय समकक्षों से देरी है को इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एक रिकॉमबिनेंट आरएनए के क्रोमेटोग्राफिक शुद्धि viroid आधारित प्रणाली का उपयोग कर ई. कोलाई में उत्पादित. एक ई. कोलाई क्लोन है कि एक chimeric ELVd-3 का हवाला देते है (५५ nt) उत्पादन से कुल RNAs एक डीएए क्रोमैटोग्राफी कॉलम कि १५० mM NaCl की उपस्थिति में धोया गया था पर लोड किया गया । आरएनए १ एम NaCl की उपस्थिति में eluted गया. वर्णलेख २५४ एनएम (नीली रेखा) और एमएस/सेमी (नारंगी रेखा) बनाम मात्रा में चालकता में अवशोषक से पता चलता है । क्रोमेटोग्राफिक जुदाई के विभिन्न स्टेप्स (equilibration, इंजेक्शन, वॉश, रेफरेंस और कॉलम पुनर्जनन) के संकेत दिए गए हैं । एकत्र अंशों को भी दर्शाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: एक रिकॉमबिनेंट आरएनए viroid-आधारित प्रणाली का उपयोग कर ई. कोलाई में उत्पादित की एकरूपता को शुद्धि । एक ई. कोलाई क्लोन है कि एक chimeric ELVd-3 का हवाला देते से कुल RNAs पहले क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध एक डीएए-Sepharose कॉलम का उपयोग कर रहे थे और फिर 2 डी पृष्ठ से अलग है । पहले जेल denaturing शर्तों (8 एम यूरिया, बफर TBE) के तहत चलाया गया था । ethidium ब्रोमाइड के साथ दाग के बाद, जेल बैंड है कि रिकॉमबिनेंट आरएनए के परिपत्र रूप शामिल एक दूसरी जेल है कि गैर denaturing हालत (बफर ताे) के तहत चलाया गया था के शीर्ष पर स्थानांतरित किया गया । दूसरी जेल के acrylamide n, n '-बीआईएस (acryloyl) cystamine, जो शुद्ध रिकॉमबिनेंट आरएनए निहित है कि जेल टुकड़ा की solubilization की अनुमति के साथ पार से जुड़ा हुआ था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

जबकि ELVd अनुक्रम और संरचना बैंगन tRNA ligase द्वारा मांयता में शामिल आवश्यकताओं शोध, हमने देखा है कि सह गैर में दोनों अणुओं की अभिव्यक्ति-मेजबान ई. कोलाई viroid परिपत्र के एक अप्रत्याशित बड़े संचय के लिए नेतृत्व बैक्टीरियल कोशिकाओं में प्रपत्र19. हम समझते है कि ई. कोलाई में viroid आरएनए के बड़े संचय सबसे शायद सह का परिणाम था, जैसे अपेक्षाकृत छोटे (३३३ nt) के रूप में एक अत्यधिक स्थिर आरएनए अणु, व्यक्त, उच्च आधारित युग्मित, परिपत्र viroid, और एक प्रोटीन जिसके लिए यह विशेष viroid उच्च समानता प्रदर्शित करता है । ELVd आरएनए मेजबान tRNA ligase भर्ती करने के लिए संक्रमित संयंत्र17में प्रतिकृति के दौरान अपने circularization मध्यस्थता चाहिए । यद्यपि हम प्रयोगात्मक पुष्टि नहीं है, हम आशा करते है कि दोनों अणुओं ई. कोलाई में एक ribonucleoprotein परिसर के रूप में है कि आगे viroid आरएनए स्थिर और १५० बैक्टीरियल की प्रति लीटर मिलीग्राम की उल्लेखनीय एकाग्रता तक पहुंचने की अनुमति देता है संस्कृति है कि उच्च अंतर्जात RNAs, जैसे rRNAs12के उन लोगों से अधिक है । चूंकि ELVd ई. कोलाईमें नकल नहीं करता है, हम एक heterologous आरएनए की है कि प्रविष्टि के लिए नाटकीय रूप से viroid-आरएनए व्युत्पंन के संचय को प्रभावित नहीं जा रहा था और, वास्तव में, कि मामला था । इस निरीक्षण विधि का आधार है कि हम यहां वर्णन ई. कोलाई में रिकॉमबिनेंट आरएनए की बड़ी मात्रा में उत्पादन । विधि ELVd के परिपत्र आरएनए अणु एक पाड़ है जिस पर ब्याज की आरएनए प्रस्तुत की है के रूप में उपयोग करता है । ई. कोलाईमें एक परिपत्र ELVd पाड़ का उत्पादन करने के लिए, हम viroid हथौड़ा ribozyme के डुप्लिकेट डोमेन के साथ एक अग्रदूत आरएनए व्यक्त की जरूरत है । ELVd ribozymes स्व- ई. कोलाई में बहुत कुशलता से सट और जिसके परिणामस्वरूप viroid मोनोमर मांयता प्राप्त है और सह द्वारा परिपत्र tRNA ligase व्यक्त की है । tRNA ligase की सह-अभिव्यक्ति प्रणाली की एक प्रमुख विशेषता है । ELVd आरएनए शायद ही ई. कोलाई में पता चला है जब तक इस विशेष एंजाइम सह है12व्यक्त की ।

हमारे प्रोटोकॉल में, प्लाज्मिड pLELVd-BZB पदों U245 और U246 ELVd के बीच सरल और कुशल गिब्सन विधानसभा द्वारा ब्याज की आरएनए के लिए इसी सीडीएनए डालने के लिए अनुमति देता है । इस साइट में सबसे अधिक संभावना ELVd अनुरूप24,25में मौजूद एक लंबे hairpin के टर्मिनल पाश से मेल खाती है । इस विशेष स्थिति में प्रविष्टि को बढ़ावा देना चाहिए कि ELVd द्वारा गठित बहुत स्थिर पाड़ से ब्याज बहर की आरएनए और ब्याज और ELVd की आरएनए के बीच intramolecular बातचीत से बचना चाहिए (चित्रा 1). हम ELVd अणु के वैकल्पिक पदों में ब्याज की आरएनए डालने के प्रभाव का पता लगाया नहीं है । प्लाज्मिड p15LtRnlSm बैंगन tRNA ligase की सह अभिव्यक्ति की अनुमति देता है । RNAs एक गठित मजबूत ई. कोलाई प्रमोटर, अर्थात् murein लिपोप्रोटीन (lpp) के नियंत्रण में दोनों plasmids में लिखित रहे हैं । यह प्रेरण की कोई जरूरत के साथ व्यवस्था का गठन करता है । तथापि, हम एक समान प्लाज्मिड (p15tRnlSm) का निर्माण भी करते हैं जो फेज T7 आरएनए पोलीमरेज़ के नियंत्रण के अंतर्गत tRNA ligase को एक isopropyl β-डी-1-thiogalactopyranoside (IPTG) inducible प्रणाली में व्यक्त करता है. इस प्लाज्मिड का प्रयोग, रिकॉमबिनेंट आरएनए के संचय केवल IPTG12जोड़कर tRNA ligase अभिव्यक्ति की प्रेरण के बाद होता है । वर्तमान सिस्टम में, आरएनए ब्याज की एक उच्च प्रतिलिपि संख्या प्लाज्मिड से पीयूसी प्रतिकृति मूल के साथ व्यक्त किया जाता है, जबकि tRNA ligase p15A प्रतिकृति मूल के साथ एक मॉडरेट प्रतिलिपि संख्या प्लाज्मिड से व्यक्त किया जाता है । क्या दोनों plasmids प्रणाली में शामिल की नकल संख्या में फेरबदल रिकॉमबिनेंट आरएनए के संचय में सुधार अब तक नहीं पता लगाया गया है । प्रणाली द्वारा भर्ती किए गए ब्याज की आरएनए की आकार सीमा को व्यवस्थित रूप से जांचा नहीं गया है, हालांकि छोटे RNAs को बड़े लोगों की तुलना में उच्च सांद्रता के लिए तर्कसंगत रूप से संचित करने की अपेक्षा की जाती है ।

vivo में रिकॉमबिनेंट आरएनए का उत्पादन आसान नहीं है कारणों में से एक सबसे शायद आरएनए अणुओं के आंतरिक कम आधा जीवन के कारण है । हमारी प्रणाली इस समस्या के लिए विदेशी नहीं है । वास्तव में, एक देर ई. कोलाई बढ़ते चरण में, रिकॉमबिनेंट आरएनए के संचय के लिए लगभग12गायब हो जाना शुरू होता है । यह एक बलों के लिए सही खिड़की को खोजने के लिए कोशिकाओं फसल । हमने देखा है, हालांकि, कि इस विंडो काफी बड़ी प्रणाली के अनुकूल बनाने के लिए है । लेकिन, हम यह भी कहा कि इष्टतम खिड़की विशेष ई. कोलाई तनाव, संस्कृति माध्यम सहित कई कारकों पर निर्भर करता है, बढ़ती शर्तों (आंदोलन, कुप्पी, प्रसारण, आदि की मात्रा)और बैक्टीरिया की शारीरिक अवस्था तरल संस्कृति शुरू करने के लिए इस्तेमाल किया । हम पिछले दिन inoculated एक थाली से ताजा ई. कोलाई कालोनियों का उपयोग कर रिकॉमबिनेंट आरएनए उत्पादन शुरू करने की सिफारिश और ३७ डिग्री सेल्सियस पर हो गया । फ्रिज में प्लेट भंडारण फसल खिड़की अधिक अप्रत्याशित बनाता है । हम एक दंर्तखोदनी के साथ एक थाली से उठाया बैक्टीरिया के साथ तरल संस्कृतियों शुरू करके सबसे सुसंगत परिणाम प्राप्त की । एक तरल पूर्व संस्कृति का उपयोग, विशेष रूप से यदि संतृप्त, भी उत्पादन प्रोटोकॉल में परिवर्तनशीलता के लिए ड्राइव ।

शुद्धि के बारे में, phenol के साथ बैक्टीरियल कोशिकाओं के उपचार: क्लोरोफॉर्म कोशिकाओं को तोड़ने के लिए एक बहुत प्रभावी तरीके से है और जलीय चरण में कुल बैक्टीरियल आरएनए के मात्रात्मक वसूली के लिए अनुमति देता है. रिकॉमबिनेंट आरएनए के बहाव आवेदन के आधार पर, इस जलीय चरण या तैयारी है कि एक शराब के साथ इस जलीय चरण से शाही सेना के परिणाम के लिए पर्याप्त हो सकता है । यदि आगे शुद्धि की जरूरत है, हम आयनों-विनिमय क्रोमैटोग्राफी एक डीएए आयनों एक्सचेंज कॉलम (चित्रा 5) का उपयोग करने की सलाह देते हैं । इस शुद्धि चरण डीएनए और बैक्टीरियल चयापचयों कि भी जलीय चरण में विभाजित की कुशल हटाने की अनुमति देता है । रिकॉमबिनेंट आरएनए के बहाव आवेदन एकरूपता को शुद्धि की आवश्यकता है, तो viroid-व्युत्पन्न प्रणाली अन्य तरीकों की तुलना में जब एक स्पष्ट लाभ प्रदान करता है. चूंकि रिकॉमबिनेंट आरएनए का एक मुख्य अंश एक परिपत्र रूप के रूप में उत्पादित होता है, इस संपत्ति का लाभ जीवाणु RNAs के थोक से इसे अलग करने के लिए लिया जा सकता है । परिपत्र RNAs एक ही आकार22के रेखीय समकक्षों के संबंध में denaturing स्थितियों में electrophoretic माइग्रेशन में विलंब का अनुभव करते हैं । इस देरी अधिक स्पष्ट है जब आरएनए कम ईओण ताकत के तहत electrophoresed है । व्यवहार में, परिपत्र RNAs भी उच्च और कम ईओण ताकत (चित्रा 4) के तहत दो आयामी denaturing पृष्ठ से अलग किया गया है । electrophoretic जुदाई के बाद, रिकॉमबिनेंट आरएनए जेल से eluted होना चाहिए । acrylamide के एक प्रतिवर्ती क्रॉस-लिंकर का उपयोग, जैसे n, n '-बीआईएस (acryloyl)23cystamine, वसूली की सुविधा, विशेष रूप से जब आरएनए की बड़ी मात्रा में शुद्ध (चित्रा 6). अंत में, उत्पादन आरएनए के बहाव आवेदन viroid पाड़ से ब्याज की आरएनए की जुदाई की मांग, हमारे प्रोटोकॉल पिछले तरीकों के लिए किसी विशेष लाभ की पेशकश नहीं करता है. ब्याज की आरएनए chimeric अणु से ribozymes, DNAzymes या, संभवतः सबसे कुशल के उपयोग के रूप में पहले वर्णित रणनीतियों में से कुछ का उपयोग कर, RNase एच के उपयोग दो डीएनए oligonucleotides7द्वारा निर्देशित किया जाना चाहिए । यह पिछले बोझिल शुद्धि कदम से बचने की कोशिश कर रहा है, हम viroid पाड़ के आकार को कम करने की कोशिश कर रहा पर काम किया है, हालांकि आंशिक सफलता के साथ । हम viroid हटाए गए रूपों का उपयोग रिकॉमबिनेंट आरएनए की उल्लेखनीय मात्रा का उत्पादन करने में सक्षम थे (१७५, २१५ और २४६ nt) लेकिन कम संचय12के साथ संबंधित viroid पाड़ के विलोपन में वृद्धि.

संक्षेप में, यहां एक प्रोटोकॉल के लिए ई. कोलाई में रिकॉमबिनेंट आरएनए की बड़ी मात्रा में उत्पादन का वर्णन है कि, हमारे ज्ञान के लिए, पहले से प्रकाशित तरीकों की उपज में सुधार । प्रोटोकॉल एक viroid (ELVd) पाड़ और बैंगन tRNA ligase, एंजाइम कि संक्रमित पौधों में इस circularizes viroid में डाला ब्याज की आरएनए के ई. कोलाई में सह-अभिव्यक्ति का आधार है । हमारे प्रोटोकॉल का एक विशिष्ट विशेषता यह है कि रिकॉमबिनेंट आरएनए मुख्य रूप से एक परिपत्र रूप, एक संपत्ति है कि बहाव अनुप्रयोगों के लिए एकरूपता के लिए शुद्धि की सुविधा के रूप में उत्पादित है । रिकॉमबिनेंट आरएनए के मिलीग्राम के इस प्रोटोकॉल दसियों का उपयोग आसानी से नियमित प्रयोगशाला की स्थिति में ई. कोलाई संस्कृति के प्रति लीटर का उत्पादन किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि इस प्रोटोकॉल में वर्णित तकनीक का पेटेंट किया गया है (अमेरिका के पेटेंट नं. ep 14382177.5, पीसीटी/EP2015/060912) ।

Acknowledgments

यह काम अनुदान के द्वारा समर्थित किया गया था 2017-83184-R और 91865-EXP से स्पेनी Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (सह वित्त पोषित FEDER फंड).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phusion High-Fidelity DNA polymerase Thermo Scientific F530S
Bpi I Thermo Scientific ER1011
Agarose Conda 8010 D1 low EEO
Tris PanReac AppliChem A1086,1000
Acetic acid PanReac AppliChem 131008.1214
EDTA Sigma-Aldrich E5134-500G
Ethidium bromide PanReac AppliChem A1152,0025 1%
Zymoclean Gel DNA Recovery Zymo Research D4001
NanoDrop ThermoFisher Scientific ND-3300
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix New England BioLabs E2621S
DNA Clean & Concentrator Zymo Research D4003
Eporator Eppendorf 4309000019
Escherichia coli DH5α Invitrogen 18265-017
Tryptone Intron Biotechnology Ba2014
Yeast extract Intron Biotechnology 48045
NaCl PanReac AppliChem 131659.1211
Agar Intron Biotechnology 25999
Ampicillin PanReac AppliChem A0839,0010
X-gal Duchefa X1402.1000
N,N-Dimethylformamide PanReac AppliChem 131785.1611
NucloSpin Plasmid Macherey-Nagel 22740588.250
Escherichia coli BL21(DE3) Novagen 69387-3
Escherichia coli HT115(DE3) Ref. Timmons et al., 2001
Chloramphenicol Duchefa C 0113.0025
Glycerol PanReac AppliChem 122329.1211 87%
KH2PO4 PanReac AppliChem 131509.1210
K2HPO4 PanReac AppliChem 122333.1211
HCl PanReac AppliChem 131020.1211
Phenol Scharlau FE04791000 90%
Chloroform PanReac AppliChem A3691,1000
Filtropur S 0.2 Sarstedt 83.1826.001
HiTrap DEAE Sepharose FF column GE Healthcare Life Sciences 17-5055-01
ÄKTAprime plus liquid chromatography system GE Healthcare Life Sciences 11001313
Acrylamyde PanReac AppliChem A1089,1000 2K
N,N’-methylenebisacrylamide Sigma-Aldrich M7279-100G
Urea PanReac AppliChem 146392.1211
Boric acid PanReac AppliChem A2940,1000
Formamide PanReac AppliChem A0937,2500
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026-5G
Xylene cyanol Sigma-Aldrich X4126-10G
N,N′-Bis(acryloyl)cystamine Sigma-Aldrich A4929-5G

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जैव रसायन अंक १४१ रिकॉमबिनेंट आरएनए परिपत्र आरएनए viroid tRNA ligase आरएनए aptamer ई कोलाई
एक परिपत्र पाड़ पर रिकॉमबिनेंट RNAs के बड़े पैमाने पर उत्पादन <em>ई कोलाई</em> में एक Viroid-व्युत्पन्न प्रणाली का उपयोग
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Cordero, T., Aragonés, V.,… More

Cordero, T., Aragonés, V., Daròs, J. A. Large-scale Production of Recombinant RNAs on a Circular Scaffold Using a Viroid-derived System in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (141), e58472, doi:10.3791/58472 (2018).

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