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Artículo de método

Análisis de expresión génica de las células endoteliales expuestas a estrés mediante múltiples cámaras de placas paralelas flujo del esquileo

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DOI:

10.3791/58478

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21 de octubre de 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Science, University of Toronto, 2Keenan Research Centre in the Li Ka Shing Knowledge Institute, St. Michael's Hospital, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 4Department of Medicine, University of Toronto

En este artículo

Resumen

Aquí, se presenta un flujo de trabajo para el análisis de expresión cultura y genes de células endoteliales bajo tensión de esquileo líquido. Incluido es un arreglo físico para simultáneamente y monitoreo de múltiples cámaras de flujo en un entorno controlado y el uso de un RNA de referencia exógena para PCR cuantitativa.

Resumen

Se describe un flujo de trabajo para el análisis de la expresión génica de las células endoteliales sometidos a un constante flujo laminar utilizando múltiples cámaras monitoreadas flujo de placas paralelas. Las células endoteliales forman el revestimiento celular interno de los vasos sanguíneos y están crónicamente expuestas a la fuerza de fricción del flujo de sangre llamado tensión de esquileo. En condiciones fisiológicas, la función de las células endoteliales en presencia de varias condiciones de esfuerzo cortante. Por lo tanto, la aplicación de las condiciones de tensión de esquileo en vitro modelos permiten comprender mejor una mayor respuesta endotelial in vivo. La cámara de placas paralelas flujo previamente publicada por Lane et al. 9 se adapta para estudiar la regulación de los genes endoteliales en presencia y ausencia de flujo laminar (no pulsátil) constante. Adaptaciones claves en la configuración para flujo laminar como se presenta aquí incluyen un entorno grande, dedicado a los circuitos de flujo concurrente de la casa, el control de caudales en tiempo real y la inclusión de una referencia exógena RNA para la normalización de datos cuantitativos de PCR en tiempo real. Para evaluar varias condiciones de tratamientos con la aplicación de la tensión de esquileo, múltiples circuitos de flujo y bombas se utilizan simultáneamente en la misma incubadora calentada y humidificada. El caudal de cada circuito de flujo se mide continuamente en tiempo real a estandarizar las condiciones de esfuerzo cortante a lo largo de los experimentos. Debido a estos experimentos tienen condiciones múltiples, también utilizamos un RNA de referencia exógena que se enriquecieron en el momento de la extracción de RNA para la normalización de la extracción de RNA y la eficiencia de síntesis de primera-strand cDNA. Estos pasos minimizan la variabilidad entre las muestras. Esta estrategia se emplea en nuestros proyectos para el análisis de expresión génica con tensión de esquileo experimentos usando la cámara de flujo paralelo de la placa, pero partes de esta estrategia, como la exógena de referencia punto de RNA, pueden fácilmente y rentable utilizadas para otras aplicaciones.

Introducción

Las células endoteliales vasculares forman la guarnición celular interna de los vasos sanguíneos en el sistema cardiovascular cerrado de especies mayores. Forman la interfaz entre la sangre y los tejidos y se caracterizan por luminal y abluminal superficies. El endotelio es un sistema diverso, activo y adaptativo que regula el flujo de sangre, trata de nutrientes, inmunidad y el crecimiento de los vasos de sangre nueva1. En el cuerpo, las células endoteliales existen normalmente en un entorno donde están expuestos a la fuerza friccional de la circulación, tensión de cizalla2. Tensión de esquileo es un importante regulador de la célula endotelial gene expression3y células endoteliales intentan mantener la tensión de esquileo dentro de un rango dado2,4. Las células endoteliales muestran angiogénicos patrones en ausencia de tensión de esquileo5 que puede mejorar la perfusión del tejido. Patrones regionales del flujo disturbado y tensión de esquileo alterado se asocia a la expresión de genes inflamatorios6 y el desarrollo de ateroesclerosis7,8. Así, modelos que incluyen la tensión de esquileo son un componente importante de la comprensión de la regulación de los genes endoteliales.

Se describe un método para el estudio de la regulación génica en las células endoteliales vasculares bajo tensión de esquileo. Este sistema utiliza flujo no pulsátil e imita los niveles de tensión de esquileo líquido y concentración de oxígeno condiciones de modelo para las células endoteliales arteriales. Este protocolo incluye los detalles de los métodos para la caída de genes mediante ARN de interferencia (ARNi), la configuración de la aplicación del esfuerzo cortante con el aparato de flujo de placas paralelas y métodos para la espiga de una referencia exógena RNA antes del análisis por reacción en cadena reversa-transcriptase de polimerasa cuantitativa (RT-qPCR). Esta tubería se utiliza para estudiar la regulación de los genes en las células endoteliales en presencia y en ausencia de tensión de esquileo laminar e incluye una adaptación de los aparatos de placas paralelas flujo descritos por Lane et al. 9. esta configuración particular fue diseñado para facilitar la evaluación simultánea de varias condiciones experimentales que permite la comparación directa de las condiciones de esfuerzo cortante, así como la normalización de análisis de ARN. Una gran unidad con humedad controlada se utiliza para permitir que múltiples cámaras de flujo separado y bombas que se ejecutan simultáneamente con tasas de flujo para cada montaje de la cámara de flujo en tiempo real. La aplicación de esta disposición se utiliza para la precipitación del gene mediante RNAi en el ajuste de la tensión de esquileo del flujo laminar /, pero los aspectos de este protocolo se pueden aplicar a cualquier evaluación de la expresión de RNA.

Métodos comunes para la aplicación de la tensión de esquileo para células endoteliales incluyen sistemas de microfluidos10, un viscosímetro de cono y placa11y una cámara de placas paralelas flujo12. Sistemas microfluídicos de diversos fabricantes han sido útiles en el estudio de la mecanobiología y mecanotransducción en múltiples células y tipos de tejidos y una variedad de estímulos biofísicos. Para las células endoteliales, se han utilizado para el estudio de las células endoteliales en aislamiento, así como la interacción de las células endoteliales y el tráfico de células de inmune o tumor10. Sin embargo, estos sistemas son menos convenientes para la recuperación de grandes cantidades de células9. El Viscosímetro de cono y plato y cámaras de placas paralelas de flujo permiten la recuperación de un gran número de células en monocapas confluentes12. Estos sistemas pueden generar una variedad de esquileo las fuerzas y patrones de12. Las placas paralelas flujo cámara Asamblea9 tiene la ventaja de que imagen en tiempo real puede realizarse a través de la ventana de cristal para evaluar la morfología celular en cualquier momento. Además, se puede recoger la solución en condiciones estériles. Para el sistema presentado aquí, el flujo también puede ser monitoreado en tiempo real y en un montaje multicámara, que facilita el mantenimiento de condiciones de cizalla entre las cámaras.

Experimentos representativos, se utilizan células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC), que representan un tipo de célula endotelial macrovasculares, y las condiciones de esfuerzo cortante que utilizamos (1 Pa) reflejan las condiciones arteriales (0.1 - 0.7 Pa). Sin embargo, este protocolo se puede utilizar con otros tipos de células endoteliales, y las condiciones de tensión de esquileo se pueden ajustar según la pregunta experimental. Por ejemplo, la evaluación de células endoteliales humanas en condiciones de circulación venosa del modelo requiere bajos niveles de tensión de esquileo (1-6 Pa) y estudios que modelan la circulación microvascular han utilizado niveles de tensión de esquileo de 0.4 - 1.2 Pa13 , 14. Además, la tensión de esquileo puede variar incluso entre las células endoteliales en el mismo vaso sanguíneo6. En la configuración actual, se utiliza un único sistema de vigilancia que puede monitorear simultáneamente cuatro bucles de flujo separado. Para los laboratorios que necesitan más lazos de flujo, hay espacio en el ambiente dedicado para un sistema de monitoreo adicional.

RT-qPCR se utiliza para la cuantificación absoluta de la expresión génica en el ajuste de tensión de esquileo. La expresión relativa de genes de la blanco a menudo se utiliza para comparar la expresión de RNA en condiciones. Algunas especies de RNA pueden existir en cantidades muy bajas o estar ausente, complicando así mediciones relativas. Por ejemplo, larga noncoding RNAs en las células endoteliales pueden ejercer un efecto potente en números relativamente bajos copia por célula5. Además, las diferencias en la eficiencia de la cartilla pueden conducir a una interpretación inexacta de utilizando el método de delta-delta ciclo umbral (Ct) para analizar los datos. Para abordar esta preocupación, realizamos la cuantificación absoluta mediante la generación de una curva estándar utilizando una cantidad conocida de ADN plásmido. Además, síntesis complementaria de DNA (cDNA) es un proceso ineficiente, y diferencias en la eficiencia de cDNA pueden explicar las diferencias en la expresión de RNA entre condiciones y entre las muestras15. La aplicación de la tensión de esquileo o reactivos de transfección puede afectar viabilidad, apoptosis y proliferación celular, o agregar componentes que puedan interferir con la síntesis de ARN aislamiento o cDNA. Para tener en cuenta la posibilidad de sesgo de aislamiento de RNA y síntesis de cDNA, utilizamos un spike en control de RNA sintetizado en el laboratorio, añadido en el momento de la extracción de RNA y medidos con cada cDNA síntesis mediante RT-qPCR. Esto permite no sólo el ajuste técnico las diferencias en la extracción y cDNA síntesis de RNA pero también permite el cálculo de cantidades absolutas por la célula, cuando se conoce el conteo de células.

Este sistema utiliza medidas adicionales para mantener la similitud o cuenta las diferencias técnicas entre las condiciones. Particularmente enfatizamos estos pasos debido a la naturaleza compleja de estos experimentos, que implican múltiples configuraciones físicas y condiciones experimentales que pueden conducir a la variabilidad experimental.

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Protocolo

1. preparación de referencia exógeno RNA

Nota: Elija una referencia exógena RNA que no existe en la especie o modelo de interés. Para sistemas mamíferos, puede utilizarse la luciferasa de luciérnaga RNA.

  1. Linealización de plásmido de referencia exógeno RNA
    1. Preparación de referencia exógeno RNA al menos 48 h antes de la extracción de RNA anticipada. Obtener o fabricar un clon de cDNA de la referencia solicitada, exógeno RNA, como un clon de cDNA de luciferasa de luciérnaga en un vector plásmido apropiado para transcripción en vitro (véase Tabla de materiales).
    2. Realizar la digestión de la enzima de restricción (RE) de 1 μg de plásmido de larga duración (el plásmido de la luciferasa de luciérnaga es pSP-luc + que tiene 4100 bp) usando solo cortador RE (XhoI) en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Elegir un RE que es un solo cortador (corta el plásmido sólo 1 x) en el extremo 3' de la referencia exógena secuencia de ARN que deja un excedente de 5' o extremo romo. Para una preparación típica, realizar siete reacciones de linearización de plásmido (pasos 1.1.4 - 1.1.7) en paralelo para generar suficiente concentración de RNA y la cantidad para completar un conjunto de experimentos o un proyecto.
      1. Medir la concentración de plásmido mediante espectrofotometría o spectrofluorometry.
      2. Preparar una mezcla RE en cada tubo: Añadir 4 μL de XhoI (20.000 unidades/mL), 8 μl de RE buffer, x µL de plásmido (1 μg) y suficiente de H2O para llegar a una solución total de 80 μl.
      3. Incubar la mezcla RE por 2 h a 37 ° C. Utilice RE según protocolo del fabricante, ya que cualquier modificación puede resultar en aumento de la actividad estrella o escote inespecífica del ADN diana. Inactive por calor la mezcla de reacción por 20 min a 65 ° C.
      4. Terminar el Resumen RE con la precipitación del etanol en cada tubo. A la mezcla RE, directamente añadir 4 μL de 0,5 M EDTA pH 8.0, 8 μl de 3 M sodio acetato pH 5.2 y 184 μl de etanol al 100%. Mezclar bien y la congelación de la mezcla a-20 ° C por 30 minutos.
      5. Desactivación de la mezcla a 4 ° C por 20 min a una fuerza centrífuga relativa (RCF) de 16.100 x g.
      6. Quite el sobrenadante con una punta fina, sin tocar el sedimento. Secar el pellet por 5 min y resuspender en 6 μl de H2O (calentado a 37 ° C) mediante pipeteo arriba y abajo 5 x - 10 x.
      7. Confirmar la linearización del plásmido luciferase ejecutando el producto digerido en gel de agarosa al 2% con bromuro de etidio (EtBr) junto con una 1 kb + escalera, una escalera superenrollado y corte y plásmido sin cortar. Inspeccione el gel y proceda a la transcripción en vitro si el carril para el plásmido corte muestra una sola banda a ~ 4 kb (el plásmido sin cortar tendrá tres bandas; Figura 1).
        PRECAUCIÓN: EtBr es carcinogénico. Trabajar en una campana de humos químicos.
  2. En transcripción de vitro de plásmido de referencia exógeno RNA
    1. Para cada tubo de los productos de los plásmidos digeridos, realizar la transcripción in vitro utilizando un método de transcripción en vitro (véase Tabla de materiales). Siga las instrucciones del fabricante y utilizar el phage apropiado polimerasa del RNA. Si el método de síntesis de cDNA requiere una cola de poly(A), u otras aplicaciones requieren una cola poly(A), elija un método de transcripción en vitro que incluye una adición de la cola de poly(A) (véase Tabla de materiales).
    2. Combinar todo en vitro transcribe los productos en un solo tubo de polipropileno de 1,5 mL antes de la purificación.
  3. Purif y del ARN de la reacción de transcripción en vitro
    1. Purificar en vitro transcritos productos con una en vitro transcripción limpiar kit (véase Tabla de materiales). Por favor, siga el protocolo del fabricante.
    2. Evaluar la concentración de RNA mediante la medición de absorbancia a 260 nm espectrofotómetro.
      Nota: La concentración de RNA se calcula usando la ley de Beer-Lambert. Esto indica que la absorción de los ácidos nucleicos (que absorben la luz fuertemente en 260 nanómetro) es proporcional a la concentración. Una absorbancia de 1.0 es igual a 40 μg/mL de ARN monocatenario.
  4. Tomar el caldo RNA en PCR tubos para uso experimental
    1. Asegúrese de que la concentración de RNA es 1 μg/μl.
      1. Si la concentración de RNA > 1 μg/μl, diluir el caldo a 1 μg / μl. alícuota 1 μL en PCR los tubos y almacenar a-80 ° C.
      2. Si la concentración de RNA es < 1 μg/μl, precipitación adicional con 5 M de acetato de amonio (proporcionado en el kit) puede realizarse según el protocolo del fabricante. Si la concentración de RNA todavía es < 1 μg/μl, proceder a tomar 1 μL en tubos de PCR.

2. Deslice la capa

Nota: Los pasos 2.1-2.10 debe realiza 24-48 h antes de la siembra anticipada de la célula.

  1. Precalentar el horno a 250 ° C.
  2. Usando guantes estériles, envuelva cada diapositiva de cristal 2 x con papel de aluminio. Evite tocar directamente la superficie de la diapositiva.
  3. Hornear las diapositivas en el horno durante 1 hora a 250 ° C y deje que los portaobjetos se enfríen a temperatura ambiente.
    Nota: Este paso es importante para destruir cualquier contaminante de la endotoxina.
  4. Mientras que las diapositivas son refrigeración, hacer una solución madre de 1 mg/mL con agua destilada a fibronectina e incubar durante 30 min a 37 ° C para disolver. Hacer alícuotas de 100 μl. Apartar las alícuotas para su uso inmediato y congelar las restantes alícuotas para uso futuro.
  5. Desenvuelva la cubierta exterior de papel de aluminio antes de colocar el portaobjetos de cristal en una bioseguridad gabinete. Realizar pasos de 2.6-2.7 y 2.9 en el gabinete de seguridad de la biotecnología.
  6. Coloque el portaobjetos de cristal en una placa de cultivo celular de 4 pozos rectangulares estéril.
  7. Diluir fibronectina solución 1: 100 con agua destilada. Cubra cada portaobjetos con 1 mL de fibronectina diluido, gota a gota con una pipeta. Asegúrese de que la diapositiva entera está cubierta.
  8. Incubar los portaobjetos en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C durante 24-48 h.
  9. Después de la incubación, aspirar la fibronectina inclinando la placa de cultivo celular de 4 pozos. Evite tocar el carro directamente con el aspirador.

3. célula de siembra sobre el vidrio se desliza

  1. Contar las células endoteliales humanas en temprano paso (paso 2-5) y semilla de ~1.0 x 106 células cada portaobjetos de vidrio recubierto de fibronectina con 1 mL de medio (1.0 x 106 células/mL: los medios de comunicación). Las células 24 h antes de la aplicación anticipada del flujo laminar de la semilla si no otro tratamiento debe ser realizado.
    Nota: Estos números se utilizan como una guía para los experimentos con 24 h de flujo.
    1. Ajustar la densidad de siembra para lograr una monocapa confluente de células en el momento de la cosecha celular y la extracción de RNA.
  2. Que las células se adhieren a la diapositiva durante 15 min a 37 ° C.
  3. Añadir 3 mL de medio en cada pocillo de la placa de cultivo celular para cubrir la diapositiva e incubar las células a 37 ° C por 24 h con 5% CO2.

4. pequeño interferir ARN (siRNA) transfección

  1. Preparación de las células en portaobjetos de vidrio para experimentos de transfección y flujo de siRNA
    1. Seguir el protocolo en los pasos 2 (capa de diapositiva) y 3 (célula siembra sobre portaobjetos de vidrio) para la preparación de los portaobjetos de vidrio y recubrimiento para los experimentos de flujo.
    2. Las células de semilla 24 h antes del tratamiento siRNA (48 h antes de la aplicación de flujo laminar).
    3. Células endoteliales humanas de semilla en medio libre de antibiótico en 750.000 a 1 x 106 células por diapositiva para lograr la confluencia de 85% - 95% al día siguiente.
      Nota: HUVEC se utilizan en el presente Protocolo.
  2. Preparación de complejos de reactivo de transfección basado en lípidos siRNA (por deslizamiento)
    1. Diseño de siRNAs encargo u orden preconfeccionados siRNAs para el gen deseado de interés.
      Nota: Realice los pasos siguientes en un gabinete de bioseguridad.
    2. Añadir 6 μl de siRNA (stock de 20 μm) en 414 μl de medio de suero reducida (véase Tabla de materiales) y suavemente mezclar mediante pipeteo.
    3. Diluir 49.5 μl de reactivo de transfección suavemente mixto basado en lípidos (véase Tabla de materiales) en 130,5 μl de medio de suero reducido.
    4. Mezclar suavemente e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
    5. Combinar siRNAs diluidos y el reactivo de transfección basada en lípidos, mezclar suavemente e incubar por 15 min a temperatura ambiente. Mezcle suavemente para evitar la interrupción de los complejos de reactivo de transfección basada en lípidos.
      Nota: La solución puede aparecer turbia como forma complejos.
    6. Mientras que se están formando complejos, eliminar el medio de crecimiento y lave las células 1 x medio de suero reducido.
    7. Agregar 2,4 mL de medio de suero reducidos para cada diapositiva.
    8. Añadir 600 μl de complejos de reactivo de transfección suavemente mixto basado en lípidos siRNA a cada placa y la placa a la mezcla de la roca. Garantizar la concentración final de siRNA es de 40 nM. Asegúrese de que la diapositiva está completamente cubierta.
    9. Incube las células a 37 ° C durante 4 horas.
    10. Añadir 1 mL de medio de crecimiento de la célula endotelial libre de antibióticos que contienen 3 x la normal concentración de suero bovino fetal (FBS) sin quitar la mezcla de transfección.
    11. Incube las células a 37 ° C hasta que esté listo para usar.

5. cálculo de la tasa de flujo basada en la tensión de esquileo deseado9

  1. Calcular la tasa de flujo basada en las tensiones de cizallamiento deseadas según la siguiente ecuación:
    figure-protocol-1
    Aquí,
    Q es el caudal en mL/min;
    Τ es la tensión de esquileo deseada en dinas/cm2 (1 Pa = 10 dinas/cm2);
    w es el ancho de la cámara de flujo paralelo de la placa en cm;
    h es la altura de la cámara de flujo paralelo de la placa en cm;
    μ es la viscosidad de los medios de comunicación en cP (g/Resumen).
    Nota: Tensión de esquileo laminares típicos experimentos (no pulsátil) en este flujo de trabajo se llevan a cabo en τ = 1 Pa (10 dinas/cm2). μ puede ser medida con un viscosímetro como un viscosímetro de cono y plato y puede variar según el contenido de los medios de comunicación incluyendo el suero y el dextrano adicional9.
  2. Para lograr una específica τ (esfuerzo cortante), ajustar la velocidad de flujo y viscosidad. A tasas de flujo más altas, las células adherentes pueden disociar de la diapositiva. Las tasas de flujo de la muestra con cámaras de flujo típicos se muestran en la tabla 1.

6. configuración de un entorno dedicado para monitoreo de múltiples cámaras de flujo paralelo de la placa (Figura 2) y sistema de

  1. Uso de una gran unidad climatizada/incubadora con múltiples estantes, acceso interior de la electricidad y puertas de cristal, conocido como la playa (ambiente integrado con ajustable CO2 ) y el calor — albergar múltiples cámaras de flujo al mismo tiempo para experimentos que requiere tensión de esquileo y la comparación directa entre dos o más tratamientos o salidas (es decir, DNA, RNA y proteínas).
    Nota: La playa permite monitoreo frecuente del circuito del flujo, incluyendo la tasa de flujo, sin la interrupción frecuente del medio ambiente.
  2. Asegurar suficiente CO2 para el experimento y que el monitor de CO2 es funcional. Asegurar adecuadamente se llena la bandeja de agua, que habrá aire humidificado.

7. instalación del aparato de flujo de placas paralelas

Nota: Para la fabricación de placas paralelas, por favor vea Lane et al. 9.

  1. Autoclave el flujo cámara de placas, embalse, amortiguador, tubo y luer para cada configuración de cámara de flujo paralelo de la placa como se indica en la tabla 2.
  2. Instalación de la Asamblea de circuito de flujo (Figura 3).
    1. Coloque toallas estériles en la seguridad biológica de gabinete. Montar el sistema de lazo de flujo, primero sin la cámara de flujo de placas paralelas, en el gabinete de seguridad biológica.
    2. Conecte el conjunto de tubería para el depósito:
      1. Inserte un tubo duro #14 un agujero y dos #14 tubos suaves en los otros dos agujeros en la tapa del depósito de flujo. Asegúrese de que uno de los tubos de suaves toque el fondo del embalse como tubería de salida .
      2. Coloque un 1/16" Luer masculino al final de la #14 duro tubo y conecte un filtro estéril como un sistema de ventilación.
      3. Coloque un 1/16" Luer hembra al final de la suave #14 entrada tubo, procedente de la reserva y fijar una llave de 4 vías.
        Nota: Para el análisis de expresión génica u otros estudios donde perfusates no necesitan ser recogidos, llaves de paso de 2 vías pueden utilizarse en lugar de llaves de 4 vías en este protocolo.
      4. Coloque un 1/16" Luer macho en el extremo del tubo de salida suave #14, que viene del depósito.
    3. Conecte el tubo de salida de depósito a la tubería de la bomba: Coloque un 1/16" Luer hembra en cada extremo de un tubo duro #13 (tubos de la bomba). Conecte el tubo de salida suave #14 del depósito al tubo duro #13 mediante la conexión de 1/16" Luer macho y hembra juntos.
    4. Conecte la tubería de la bomba con tubería de 'puente de amortiguador': Coloque una 1/8" Luer masculino y una 1/8" Luer hembra en cada extremo de un tubo suave de #16. Conexión 1/16" Luer hembra del tubo duro #13 (el final de la salida de la tubería de la bomba) con 1/8" Luer macho del tubo suave #16.
    5. Montar la tubería para el amortiguador de flujo: Coloque un 3/16" Luer macho en un extremo del tubo suave #25 y repetir este proceso para el otro lado de la pulsación de flujo. Fije los extremos libres de los tubos suaves #25 a cada lado de la pulsación de flujo.
    6. Conecte el tubo de 'puente de amortiguador' con la tubería para el amortiguador de flujo: Conecte un tubo suave #25 desde el amortiguador de flujo con el tubo suave #16 del 'puente de amortiguador' mediante el 1/8" Luer hembra del lado #16 'puente amortiguador' y la ya colocado 3/16" macho Luer desde el lado del tubo amortiguador suave #25.
    7. Montar el tubo de 'puente de cámara':
      1. Coloque una 1/8" Luer hembra y una 1/8" Luer macho en cada extremo de un tubo suave #16 (tubería de 'puente de cámara').
      2. Conexión 1/8" Luer hembra del 'puente de la cámara' con el 3/16" Luer macho en el tubo suave #25 del extremo libre de la pulsación de flujo.
      3. En el 1/8" Luer macho (extremo libre) de la tubería 'puente de cámara', coloque una llave de 4 vías.
    8. Conecte la llave de 4 vías desde el extremo libre del 'puente de la cámara' a la llave de 4 vías del tubo suave de entrada del depósito (del paso 7.2.2.3). Cerrar las llaves de paso.
    9. Añadir medios al depósito y el amortiguador. Para que la exposición de 48 h a tensión de esquileo, añadir 35 mL de medios de comunicación al embalse y a 25 mL y el de la pulsación. Ajustar el volumen de los medios de comunicación basado en la duración de la experiencia de flujo y el número de células sembradas.
    10. Llevar el sistema de lazo de flujo montado a la bomba en la playa. Coloque el tubo duro #13 (tubos de la bomba) en la cabeza de la bomba y fijarlo. Abrir las llaves de paso.
    11. Encienda la bomba y lentamente aumente la velocidad de la bomba. Los medios de comunicación, deje circular a través del sistema de lazo. Revise cualquier fuga o la obstrucción (p. ej., presión). Asegúrese de que los medios de comunicación está fluyendo hacia el depósito.
  3. Instalación de la Asamblea de la cámara de flujo
    1. Coloque una 1/8" Luer hembra en un extremo de un #16 suave del tubo y colocar una llave de 4 vías. Conecte el extremo libre del tubo a la derecha de la placa superior (entrada lateral) .
    2. Coloque una 1/8" Luer macho en un extremo de un #16 suave del tubo y colocar una llave de 4 vías. Conecte el extremo libre del tubo en el lado izquierdo de la placa superior (salida lateral).
    3. Coloque una 1/8" Luer masculino y una 1/8" Luer hembra en cada extremo de un tubo suave #16 (tubería de la trampa de la burbuja). Acople el tubo de burbuja trampa mediante el 1/8" Luer macho. Coloque una llave de 4 vías en el otro extremo de la tubería a través de la 1/8" Luer hembra.
    4. Utilizando pinzas estériles, transfiera el porta celular semillas de cristal de la placa de cultivo celular de 4 pozos a la hendidura en la placa inferior. Asegúrese de que el lado celular semillas de lo portaobjetos de vidrio quede hacia arriba.
    5. Utilizando una jeringa de 10 mL, añadir 10 mL de medio caliente a la placa inferior dentro de la línea de empaque rojo alrededor de la placa. Permitir que los medios de comunicación para flujo a través de la diapositiva y cubrir las células. Evitar la adición de medios directamente en la diapositiva.
    6. Suavemente Coloque la placa superior sobre la placa inferior, alineando de un lado a otro. Evitar la introducción de burbujas de aire. Atornillar las placas firmemente.
    7. Eliminar burbujas de aire de la botella lavagases abriendo la llave de paso a la derecha (entrada) de la placa y limpiar cuidadosamente 20 mL de medio tibia usando una jeringa de 30 mL. Asegúrese de que está cerrada la llave de paso a la izquierda (salida) de la placa y que los medios de comunicación está fluyendo a través de la llave de la trampa de burbujas (abierto). Desechar el medio sonrojado.
    8. Cierre la llave de paso en la trampa de la burbuja y abrir la llave de paso a la izquierda (salida) de la cámara. Elevar el lado izquierdo (salida) de la cámara en un ángulo de 45° y lave suavemente 20 mL de medio tibia usando una jeringa de 30 mL del lado derecho (entrada) de la cámara para eliminar las burbujas de aire de la cámara. Las burbujas pueden ser visualizadas a través de la ventana. Desechar el medio sonrojado.
    9. Cerrar los grifos en ambos lados de la cámara y la tapa. Examinar a las células por microscopía.
    10. Transporte de la cámara a la playa con el sistema de bucle montado anteriormente.
    11. Poco a poco disminuir la velocidad de la bomba y la bomba de pausa. Cerrar las llaves de paso en el sistema de lazo de flujo para evitar fugas.
    12. Conecte la cámara y lazo sistema juntos a través de grifos. Abra todos los grifos.
    13. Poco a poco aumentar la velocidad de la bomba y examinar la configuración para cualquier fuga o la obstrucción. Asegúrese de que los medios de comunicación circula en una dirección y se devuelve al depósito.
    14. Coloque el sensor de flujo en el tubo de 'puente de cámara' situado en el lado de entrada de la cámara. Asegúrese de que el sensor esté orientado correctamente en la dirección del flujo.
    15. Ajustar la velocidad de la bomba para obtener el caudal que se calculó anteriormente, basado en la tensión de corte deseada.
      Nota: La tasa de flujo puede variar dependiendo de la altura y la anchura de cada cámara, así como la viscosidad de los medios de comunicación.
    16. Encienda el tanque de CO2 para alcanzar 5% CO2 y colocar una bandeja de agua dentro de la playa.

8. recolección de las células y la extracción de ARN de la cámara de flujo

  1. Una vez finalizado el período de tiempo deseado de flujo, lentamente disminuya la velocidad de la bomba peristáltica a 0 y desconecte la energía eléctrica. Cierre todos los grifos abiertos y rápidamente quitar la cámara y el tubo conectado con una llave de paso en cada extremo.
  2. La cámara a una mesa limpia y suavemente Desatornillar todos los tornillos para quitar la placa superior. Con unas pinzas de punta de aguja, retire el portaobjetos de cristal de la placa inferior y colóquelo en un plato de cultivo de tejidos de 100 mm de diámetro.
  3. Lavar el portaobjetos con 10 mL de frío con tampón fosfato salino (PBS)- / - y comprobar las células bajo un microscopio para confirmar la adhesión celular y la alineación en la dirección del flujo.
  4. Aspire el PBS de la placa y transfiera el porta a un plato de diámetro 100 mm limpio. Añadir 350 μl de tampón de lisis de la extracción de RNA (véase Tabla de materiales), del kit que contiene 1/100 de beta-mercaptoetanol, a la diapositiva.
    Atención: Añadir beta-mercaptoetanol en una campana de humos químicos.
  5. Raspar las células de la diapositiva usando un raspador con una hoja de polietileno de la célula. Incline el plato de cultivo de tejidos, permitiendo el líquido a la piscina en el fondo y retirar el portaobjetos de cristal con pinzas. Pipeta de la célula del lisado en un tubo de 1,5 mL y conservar en hielo.
  6. Diluir el stock referencia exógeno RNA (RNA del luciferase) ng/μl 0.0025 por dilución seriada antes de añadir a la muestra. Por ejemplo, si la concentración del stock es 1 μg/μl, una dilución de 1/400.000 es necesaria para lograr 0.0025 ng / μl. Añadir 10 μl del diluido luciferase ARN para cada muestra de lisado para análisis y posterior aislamiento de RNA de la célula.
  7. Proceder con el protocolo de extracción de RNA según las instrucciones del fabricante, o congelar el lisado a-80 ° C hasta que pueda proceder con la extracción.

9. cálculo de la eficiencia de la extracción de RNA y síntesis del cDNA

Nota: Calcular la eficiencia de la luciferase después de RT-qPCR comparando el rendimiento teórico y rendimiento experimental.

  1. Determinar el rendimiento teórico para luciferase RNA.
    1. Determinar la cantidad total de ejemplares de luciferase añadido por muestra. (Añadir 0.025 ng/muestra = 2,73 x 107 copias de luciferase RNA por ejemplo antes de la extracción del RNA.)
    2. Calcular la masa molecular de la luciferase RNA usando una media masa molecular por nucleótido de 330 g/mol y multiplicarlo por la longitud de la luciferasa de luciérnaga ARN, nucleótidos de 1652.
    3. Dividir la cantidad de luciferase RNA añadido (0.025 ng) para cada muestra antes de la extracción de RNA por la masa molecular para producir la cantidad molar. Entonces, multiplicar por el número de Avogadro de ceder los ejemplares añadidos por muestra.
    4. Calcular el rendimiento teórico de las copias de la luciferasa para cada reacción de RT-qPCR utilizando la ecuación:
      figure-protocol-2
  2. Calcular el rendimiento experimental de las copias de la luciferasa para cada reacción de RT-qPCR utilizando el plásmido luciferase para generar una curva estándar para RT-qPCR.
  3. Calcular la eficiencia de la luciferasa (%) utilizando la ecuación:
    figure-protocol-3

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Resultados

Éxito linealización de plásmido de luciferase usando enzimas de restricción fue confirmada por corrientes productos digeridos en un gel de agarosa (figura 1). El tamaño del producto lineal fue confirmado usando escaleras de ADN y comparación con plásmido sin cortar.

Hemos adaptado la instalación de la cámara de flujo paralelo de la placa de Lane et al. 9 para los exp...

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Discusión

Tensión de esquileo es una condición fisiológica que modula la función endotelial, en parte, mediante la expresión de gene de estado estacionario2,5. Modelos de regulación génica en varias condiciones de esfuerzo cortante contribuirá a una mayor comprensión de la función endotelial. Este flujo de trabajo pragmático incluye un circuito de flujo usando una cámara de flujo paralelo de la placa de Lane et al. 9 y representa el flujo l...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por CIHR fregona 142307 a p.a.m. H.S.J.M. es un beneficiario de un programa canadiense de institutos de salud investigación formación en beca de medicina regenerativa. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. y M.K.D. son los destinatarios de las becas de postgrado Reina Elizabeth II en la ciencia y la tecnología.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.05% Tripsina-EDTAgibco25300-062
10 mL JeringaBD302995
10 mm2 Plato de cultivoSarstedt83.3902
30 mLBD302832
Llaves de paso de 4 víasDiscofixD500
Papel de aluminio
PLAYADarwin Chambers CompanyMN: HO85, SN: 4947549
Raspadores
CO2 MeterBioSphenix, Ltd.MN: P120, SN: 0342
Sensor de CO2BioSphenix, Ltd.MN: C700, SN: 52852
Agua destiladagibco15230-170
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) -/-gibco14190-144
Medio de crecimiento de células endoteliales 2Promo CellC-22011
Medio de crecimiento de células endoteliales 2 Supplement MixPromo CellC-39216
Fibronectina (pura)Filtro 11051407001
(0.20 mmm)Sarstedt83.1826.001
Amortiguador de flujo y tapaTaller
Medidor de flujo: Consola de la serie 400 Transonic ScisenseInc.T402
: Tubo de la serie 400Transonic Scisense Inc.TS410
Depósito de flujo y tapade T taller de soplado de vidrio
Sensor de flujoTransónico Scisense Inc.ME4PXL
Isotemp 737F HornoFisher ScientificFI-737F
Paño JTela J Portaobjetos
de microscopio (25 x 75 x 1 mm)Fisherfinest12-544-4
Bolsa de esterilización de papelCardinal Health92713
Bomba (Masterflex L/S Economy Drive)Cole-Parmer7554-90
Cabezal de la bomba (Masterflex L/S Easy Load)Cole-Parmer7518-00
Plato rectangular de 4 pocillosPinzas
NameCompanyNúmero de catálogoComments
>Tubing
Masterflex C-Flex L/S 25 Tubo blandoCole-Parmer06424-25
Masterflex C-Flex L/S 14 Tubo blandoCole-Parmer06424-14
Masterflex C-Flex L/S 16 Tubo blandoCole-Parmer06424-16
Masterflex PharMed BPT L/S 13 Tubo duroCole-Parmer06508-13
Masterflex PharMed BPT L/S 14 Tubo DuroCole-Parmer06508-14
NameCompanyNúmero de catálogoComentarios
Luer
3/16" LuerCole-Parmer45518-08para tubería #25
1/8" LuerCole-ParmerMacho 30800-24Para Tubo #16
1/8" HembraLuer Cole-Parmer30800-08Para Tubo #16
/16" Luer Cole-Parmer Macho45518-00Para Tubo #14
1/16" Hembra LuerCole-Parmer45508-00Para tubo #14
NameCompañíaNúmero de catálogoComments
Knockdown reagents
Oligofectamine ReactivoInvitrogen12252-011
Opti-MEM I Suero Reducido Mediogibco31985-070
Name< strong>CompanyNúmero de catálogoComments
In vitro transcripción
Generuler 1kb+ escalera de ADNThermo ScientificSM1331
MEGAclear KitAmbionAM1908
mMESSSEGE mMACHINE SP6 Kit de transcripciónAmbionAM1340
pSP-luc+PromegaE4471
Escalera de ADN superenrolladaNueva Inglaterra BioLabs Inc.N0472S
UltraPure AgaroseInvitrogen16500-500
UltraPure Ethidium BromuroInvitrogen15585011
XhoI Enzima de restricciónNueva Inglaterra BioLabs Inc.R0146S
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
> extracción de ARN
Beta-mercaptoetanolSigmaM3148-100mL
RNeasy Mini KitQiagen74104
de celdasSigma-Aldrichde soplado de vidrio U de TMedidor de flujo U 267061 Thermo Scientific Macho 1

Referencias

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