Summary
Burada, sıvı kesme stres altında endotel hücre kültür ve gen ifade analizi için iş akışı gösterilmektedir. Dahil aynı anda konut ve kontrollü bir ortamda ve eksojen başvuru RNA kullanım kantitatif PCR için birden çok akış odalarında takibi için fiziksel bir düzenlemedir.
Abstract
Gen ifadesinin birden çok izlenen paralel-plaka akışı chambers kullanarak sabit bir laminar akış tabi endotel hücrelerden analizi için bir iş akışı açıklanmaktadır. Endotel hücreleri kan damarlarının iç hücresel astar formu ve kronik kan akışını kesme stres denilen sürtünme kuvveti maruz kalır. Fizyolojik koşullar altında endotel hücreleri işlevi çeşitli kesme stres koşulları huzurunda. Böylece, vitro modelleri kesme stres koşullarında uygulanması endotel yanıt içinde vivoiçine daha fazla fikir sağlayabilir. Daha önce Lane ve ark. tarafından yayınlanan paralel-plaka akışı odası 9 sabit (pulsatil olmayan) laminer akış de endotel gen düzenlemesi çalışmaya adapte olduğunu. Kurulum laminar burada sunulan akış için anahtar uyarlamalar house eşzamanlı akış devreleri, akış oranları izleme büyük, kendini işine adamış ortamına dahil gerçek zamanlı ve bir eksojen başvurusunu RNA normalleşme için dahil nicel gerçek zamanlı PCR veri. Birden çok tedaviler/koşul kesme stres uygulanması ile değerlendirmek için birden çok akış devreler ve pompalar aynı anda aynı ısıtmalı ve oksijen inkübatör içinde kullanılır. Her akış devre debisi sürekli olarak ölçülür deneyler kesme stres koşullarını standartlaştırmak için gerçek zamanlı. Bu deneyler birden çok koşul olduğundan, ayrıca RNA ayıklama zaman RNA çıkarma ve ilk iplikçikli cDNA sentez verimliliği normalleştirme için çivili içinde ki bir eksojen başvuru RNA kullanın. Aşağıdaki adımları değişkenlik örnekleri arasında en aza indirmek. Bu strateji ile paralel-plaka akışı odası kullanarak kesme stres deneyler gen ifade analizi için bizim potansiyel olarak istihdam edilmektedir, ancak eksojen gibi bu stratejinin parçaları spike-RNA içinde başvuru, kolay ve düşük maliyetle kullanılabilir diğer uygulamalar.
Introduction
Vasküler endotel hücreleri daha yüksek tür kapalı kardiyovasküler sistem kan damarlarının iç hücresel astar oluştururlar. Onlar kan ve doku arasında arayüz oluşturmak ve luminal ile karakterizedir ve abluminal yüzeyler. Endotel kan akımı, besin ticareti, bağışıklık ve yeni kan damarları1büyüme düzenleyen farklı, etkin ve edinilmiş bir sistemdir. Vücutta, endotel hücreleri normalde nerede dolaşımı, yamultma stres2sürtünme kuvveti için sunulan bir ortamda adlı biri yok. Yamultma stres endotel hücre gen ifade3önemli bir düzenleyicisidir ve endotel hücreleri kesme stres verilen aralığı2,4içinde korumak deneyin. Endotel hücreleri doku perfüzyon artırabilir kesme stres5 yokluğunda biçimlenme anjiogenik göstermektedir. Bölgesel desen rahatsız akışı ve değiştirilmiş kesme stres inflamatuar genler6 ifade ve ateroskleroz7,8gelişimi ile ilişkili olan. Böylece, yamultma stres içeren endotel gen düzenlemesi anlama önemli bir parçasını modellerdir.
Gen düzenlemesi kesme stres altında vasküler endotel hücrelerde çalışmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu sistem pulsatil olmayan kullanır ve sıvı kesme stres düzeyleri ve oksijen konsantrasyonu arteriyel endotelyal hücreler için bu modeli koşulları taklit eder. Bu iletişim kuralı için RNA müdahale (RNAi), kesme spike-in bir eksojen başvurusu RNA Analizi önce tarafından paralel-plaka akışı cihazları ve yöntemleri kullanarak stres uygulanması için set-up kullanarak gen nakavt metodun ayrıntıları içerir ters transkriptaz nicel polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR). Bu boru hattı laminer kesme stres de endotel hücrelerindeki gen düzenlemesi eğitim için kullanılır ve Lane ve ark. tarafından açıklanan paralel-plaka akışı aparatı uyarlaması içerir 9. belirli bu kurulum doğrudan karşılaştırma kesme stres koşulları, hem de RNA Analizi normalleştirme sağlar aynı anda birden çok deneysel koşullar değerlendirilmesi kolaylaştırmak için tasarlanmıştır. Büyük ısıtmalı birimi Kontrollü nem ile birden çok ayrı akışı odalar ve pompaları akış oranları gerçek zamanlı olarak her akış odası derleme için izlenen ile aynı anda çalışması için izin vermek için kullanılmaktadır. Bu kurulum uygulanması gen nakavt RNAi laminar akış/makaslama stres ayarıyla kullanmak için kullanılır, ancak bu protokolü yönlerini RNA ifade herhangi bir değerlendirme için uygulanabilir.
Endotel hücreleri için kesme stres uygulanması için yaygın bir yaklaşım mikrosıvısal sistemleri10, bir koni ve plaka Vikozimetre11ve bir paralel-plaka akışı odası12içerir. Çeşitli üreticilerin mikrosıvısal sistemleri mechanobiology ve mechanotransduction birden çok hücre ve doku tipleri ve biyofiziksel uyaranlara çeşitli eğitim yararlı olmuştur. Endotel hücreleri için bunlar yalıtım yanı sıra arasındaki etkileşimin endotel hücreleri ve bağışıklık veya tümör hücreleri10/ kaçakçılığı endotel hücrelerinde eğitim için kullanılmıştır. Ancak, bu sistemler daha az sayıda hücre9kurtarma için uygundur. Koni ve plaka Vikozimetre ve paralel-plaka akışı chambers konfluent monolayers12hücrelerde çok sayıda kurtarma sağlar. Bu sistemler kesme kuvvetleri ve desenler12bir dizi oluşturabilirsiniz. Paralel-plaka akışı odası derleme9 o gerçek zamanlı görüntüleme avantajı vardır, herhangi bir zaman hücresel morfoloji değerlendirmek için cam pencere aracılığıyla gerçekleştirilebilir. Ayrıca, perfusate Steril koşullar altında toplanabilir. Burada sunulan sistem için akışını da gerçek zamanlı olarak ve odaları arasında kesme koşulları bakımından kolaylaştıran bir çok odası kurulumu, izlenebilir.
Temsilcisi deneyler için bir tekrarlamışlar endotel hücre türü temsil, insan göbek damar endotel hücreleri (HUVEC), kullanılan ve yamultma stres koşulları kullandığımız (1 Pa) arteryel koşulları yansıtır (0.1 - 0.7 Pa). Ancak, bu iletişim kuralı-ebilmek var olmak kullanılmış ile diğer endotel hücre tipleri ve yamultma stres koşulları deneysel soru göre ayarlanabilir. Örneğin, insan endotel hücreleri venöz dolaşım model koşullarında değerlendirilmesi kesme stres (1-6 Pa) daha düşük düzeyde gerektirecektir ve mikrovasküler dolaşımı model çalışmaları 0.4 - makaslama stres düzeyleri kullanıldığında 1.2 Pa13 , 14. Ayrıca, yamultma stres hatta aynı kan damarı6içinde endotel hücreleri arasında değişebilir. Geçerli kurulumu, tek bir izleme sistemi kullanılır olarak dört ayrı akışı döngü aynı anda izleyebilir. Daha fazla akış döngüler gerekir labs için yer içinde özel çevre için ek bir izleme sistemi.
RT-qPCR kesme stres ayarında Gen ifadesinin mutlak Nefelometri için kullanılır. Hedef genlerin göreli ifade kez RNA ifade koşullar arasında karşılaştırmak için kullanılır. Bazı RNA türleri çok düşük miktarlarda var veya yok, böylece göreli ölçüler karmaşık hale getiren olmak. Örneğin, endotel hücrelerinde uzun kodlamayan RNA'ların nispeten düşük kopya numaralarından hücre5başına güçlü efektleri uygulamak. Buna ek olarak, astar verimliliği farklılıkları yanlış bir yoruma delta delta döngüsü eşik (Ct) yöntemini kullanarak verileri çözümlemek için yol açabilir. Bu endişe adrese, mutlak Nefelometri plazmid DNA bilinen bir miktar kullanarak standart bir eğri oluşturarak gerçekleştiriyoruz. Ayrıca, tamamlayıcı DNA (cDNA) sentezi verimsiz bir süreçtir ve cDNA verimliliği farklılıkları koşullar arasında örnekleri15arasında farklılıklar RNA ifade için hesap. Yamultma stres ve/veya transfection reaktifler uygulanması hücre çoğalması, apoptozis ve canlılığı etkiler veya RNA izolasyon ve/veya cDNA sentezi ile girişime neden olabilir bileşenleri ekleyin. Önyargı olasılığı için hesap RNA izolasyon ve cDNA sentezi için laboratuarda sentezledim, RNA ayıklama saatinde eklendi ve her cDNA sentez yolu ile ile RT-qPCR ölçülen bir spike RNA denetimi kullanın. Teknik RNA ayıklama ve cDNA sentezi farkları ama aynı zamanda hücre sayısı bilindiğinde mutlak miktarların hesaplanması hücre başına sağlar sadece ayarlama sağlar.
Bu sistem benzerliği korumak veya koşulları arasındaki teknik farklar için hesap için ek adımlar kullanır. Özellikle birden çok fiziksel set-up ve deneysel değişkenlik açabilir deneysel koşullar içeren bu deneyler karmaşık doğası nedeniyle bu adımları vurgulamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. eksojen başvuru RNA hazırlanması
Not: bir eksojen başvuru yok RNA türler veya modeli ilgi olarak belirleyin. Ateş böceği luciferase RNA memeli sistemleri için kullanılabilir.
-
Eksojen başvuru RNA plazmid doğrusallaştırma
- Eksojen başvuru RNA en az 48 saat önce beklenen RNA çıkarımı hazırlayın. Elde etmek veya seçilen eksojen başvuru RNA, örneğin bir ateş böceği luciferase cDNA klon vitro transkripsiyon için uygun bir plazmid vektör cDNA klonu ürettikleri ( Tablo malzemelerigörmek).
- Tam uzunlukta plazmid 1 µg Restriksiyon enzimi (RE) hazım gerçekleştirmek (ateş böceği luciferase plazmid pSP olduğunu-luc + 4100 bp olan) tek-kesici kullanarak (XhoI) yeniden 1.5 mL microfuge tüpler. Tek bir kesici bir RE seçin (plazmid keser sadece 1 x) sonunda 3' eksojen başvuru 5' çıkıntı veya künt sonunda bırakır RNA dizisi. Tipik bir hazırlık için yeterli RNA konsantrasyon ve miktar komple bir set deneyler veya bir proje oluşturmak için paralel olarak yedi plazmid doğrusallaştırma reaksiyonlar (adım 1.1.4 - 1.1.7) gerçekleştirin.
- Spectrophotometry veya spectrofluorometry kullanarak plazmid konsantrasyon ölçmek.
- Her tüp bir RE karışımı hazırlayın: XhoI 4 µL ekleyin (20.000 adet/mL), tampon, plazmid (1 µg) ve yeterli H2O 80 µL toplam bir çözüme ulaşmak için x µL yeniden, 8 µL.
- RE karışımı 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya Herhangi bir değişiklik artan yıldız etkinliği veya non-spesifik bölünme hedef DNA neden olabileceğinden üreticinin protokolüne göre RE kullanın. Isı devre dışı bırakabilirsiniz 65 ° C'de 20 dk tepki karışımı
- RE Özet her tüpün etanol yağış ile sonlandırın. RE karıştırmak için doğrudan 0,5 M EDTA pH 8.0, 3 M sodyum asetat pH 5.2 8 µL ve 184 µL % 100 etanol 4 µL ekleyin. Mix iyi ve karışımı 30 dk-20 ° C'de dondurmak.
- Spin aşağı için göreli bir merkezkaç kuvveti (RCF), 20 dk 16,100 x g4 ° C'de karışımı.
- Süpernatant ile a iyi uç, Pelet dokunmadan kaldırın. 5 min için Pelet kurumasına ve H2O (37 ° C sıcak) 6 µL içinde x - 10 x 5 yukarı ve aşağı pipetting tarafından resuspend.
- Luciferase plazmid doğrusallaştırma sindirilir ürün üzerinde % 2 özel jel etidyum bromür (EtBr) içeren çalıştırarak bir merdiven 1 kb +, supercoiled merdiven ve kesim ve kesilmemiş plazmid ile birlikte onaylamak. Jel incelemek ve lane kesme plazmid için tek bir bant ~ 4 kb (uncut plazmid üç grup; olacaktır gösterir, vitro transkripsiyon devam Şekil 1).
Dikkat: EtBr kanserojen. Kimyasal duman mahallede çalışıyorum.
-
İçinde eksojen başvuru RNA plazmid, vitro transkripsiyon
- İçin her tüp sindirilir plazmid ürünlerin içinde vitro transkripsiyon bir vitro transkripsiyon yöntem kullanarak gerçekleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek). Üreticinin yönergeleri izleyin ve uygun fajının RNA polimeraz kullanın. CDNA sentez yöntemi poli(a) kuyruğu gerektirir veya diğer uygulamalar poli(a) kuyruğu gerektirir, bir poli(a) kuyruğu ek içerir vitro transkripsiyon bir yöntem seçin (bkz. Tablo malzeme).
- Tüm birleştirmek vitro transkripsiyonu ürünleri içine bir tek 1.5 mL polipropilen boru arıtma önce.
-
Purif ication in vitro olarak transkripsiyon reaksiyon gelen RNA'ın
- Vitro transkripsiyonu arındırmak bir vitro transkripsiyon temizlik ürünleriyle kiti ( Tablo malzemelerigörmek). Lütfen üreticinin iletişim kuralı uygulayın.
- 260 absorbans ölçerek RNA konsantrasyon değerlendirmek spectrophotometry kullanarak nm.
Not: RNA konsantrasyon bira-Lambert Yasası kullanılarak hesaplanır. Bu devletlerin nükleik asitler absorbans (hangi absorbe ışık güçlü 260 nm) için konsantrasyon ile doğru orantılıdır. Bir absorbans 1.0 40 µg/mL tek iplikçikli RNA'ın eşittir.
-
Aliquoting deneysel kullanım için stok RNA içine PCR tüpleri
- RNA konsantrasyonu 1 µg/µL olduğundan emin olun.
- RNA konsantrasyon > 1 µg/µL ise, hisse senedi için 1 µg seyreltik / µL. Aliquot 1 µL PCR içine tüpleri ve-80 ° C'de saklamak
- RNA konsantrasyon < 1 µg/µL ise, 5 M amonyum asetat (Seti'nde sağlanan) kullanarak ek yağış üreticinin Protokolü başı olarak gerçekleştirilebilir. Eğer RNA konsantrasyon < 1 µg/µL hala ile aliquoting 1 µL PCR tüpler içine devam edin.
- RNA konsantrasyonu 1 µg/µL olduğundan emin olun.
2. slayt kaplama
Not: Adımlar 2,1-2,10 beklenen cep tohum önce gerçekleştirilen 24-48 h olmalıdır.
- 250 ° c fırında
- Steril eldiven kullanarak, her bir cam slayt 2 şal x alüminyum folyo ile. Slayt yüzeyine doğrudan dokunmaktan kaçının.
- Slaytlar 1s 250 ° c fırında pişirin ve oda sıcaklığında soğumaya slayt sağlar.
Not: Bu herhangi bir bulaşıcı endotoksin yok etmek için önemli bir adımdır. - Slaytları soğutma, fibronektin hisse senedi çözüm olarak 1 mg/mL distile su ile olun ve 37 ° C'de çözülmeye 30 dk için kuluçkaya. 100 µL aliquots olun. Acil kullanım için aliquots bir kenara ve ileride kullanmak için kalan aliquots dondurma.
- Cam slayt bir Biyogüvenlik kabini koymadan önce dış kaplama alüminyum folyo paketini açmak. Adımları 2.6-2.7 ve 2,9 Biyogüvenlik kabini gerçekleştirin.
- Cam slayt bir steril dikdörtgen 4-şey hücre kültür tabak yerleştirin.
- Distile su ile fibronektin hisse senedi çözüm 1: 100 oranında seyreltin. Her slayt ile seyreltilmiş fibronektin, damla damla, bir pipet kullanarak 1 mL kat. Tüm slayt ele emin olun.
- Slaytlar için 24-48 h 37 ° C'de bir doku kültürü kuluçka kuluçkaya.
- Kuluçka sonra 4-şey hücre kültür çanak eğerek fibronektin Aspire edin. Aspiratör ile doğrudan slayt dokunmaktan kaçının.
3. hücre cam tohum slaytlar
- Erken geçiş (geçit 2-5), insan endotel hücreleri saymak ve ~1.0 x 106 hücreler ile 1 mL (1.0) x 106 hücre/mL medya ortamının her fibronektin kaplı cam slayt üzerine tohum. Başka bir tedavi yapılması için ise hücreler laminar akış beklenen uygulamadan önce 24 h tohum.
Not: Bu numaraları akışı 24 h ile deneyler için bir kılavuz olarak kullanılır.- Konfluent monolayer hücrelerinin hücre hasat ve RNA çıkarma anda ulaşmak için tohum yoğunluğu ayarlayın.
- Slayt 37 ° C'de 15 dakika uygun hücreleri izin
- Medya 3 mL slayt kapsayacak şekilde hücre kültür çanak her kuyuya ekleyin ve % 5 CO224 h 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
4. küçük Interfering RNA (siRNA) Transfection
-
SiRNA transfection ve akış deneyler için hücreleri cam slaytlara hazırlanması
- Adım 2 (slayt kaplama) ve 3 (cam slaytlar tohum hücresi) protokolü için cam slayt hazırlama ve kaplama akış deneyler için izleyin.
- Tohum siRNA tedavi (laminer akış uygulamadan önce 48 saat) önce 24 h hücreleri.
- Tohum insan endotel hücrelerinde antibiyotik ücretsiz medya % 85 - % 95 izdiham ertesi gün ulaşmak için slayt başına 750.000-1 x 106 hücre.
Not: HUVEC bu protokol için kullanılır.
-
SiRNA-lipid tabanlı transfection reaktif kompleksleri (slayt) hazırlanması
- Tasarım özel çift veya çift ilgi istenilen gen için erken sipariş.
Not: bir Biyogüvenlik kabini içinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin. - 6 µL siRNA (20 µM hisse senedi), düşük serum orta 414 µL içinde eklemek ( Tablo malzemelerigörmek) ve karışımı yavaşça pipetting tarafından.
- Hafifçe karışık lipid tabanlı transfection reaktif 49,5 µL seyreltik ( Tablo malzemelerigörmek) indirimli serum orta 130.5 µL içinde.
- Karışımı yavaşça ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Seyreltilmiş çift ve lipid tabanlı transfection reaktif birleştirmek, karışımı yavaşça ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya. Karışımı yavaşça lipid tabanlı transfection reaktif kompleksleri bozulma önlemek için.
Not: Çözüm kompleksleri form olarak bulutlu görünebilir. - Kompleksleri şekillendirme, büyüme orta kaldırmak ve hücreleri 1 yıkama x düşük serum orta ile.
- İndirimli serum Orta 2.4 mL her slayta eklemek.
- Hafifçe karışık siRNA-lipid tabanlı transfection reaktif kompleksleri 600 µL her plakasına eklemek ve ileri geri karıştırmak için plaka rock. SiRNA son konsantrasyonu sağlamak 40 nM. Slayt tamamen kaplı emin olun.
- 4 h için 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
- 1 mL transfection karışımı kaldırmadan 3 x fetal Sığır serum (FBS) normal konsantrasyonu içeren antibiyotikler ücretsiz endotel hücre büyüme medya ekleyin.
- 37 ° C'de hücreler kullanıma hazır kadar kuluçkaya.
- Tasarım özel çift veya çift ilgi istenilen gen için erken sipariş.
5. istenen kesme stres9 tarihinde dayalı debi hesaplanması
- İstenen kesme gerilmeler aşağıdaki denklemi göre temel akış oranını hesaplamak:
Burada,
Q mL/dak akışını oranıdır;
τ olduğunu istenen kesme stres dynes/cm2 ' deki (1 Pa = 10 dynes/cm2);
w cm paralel-plaka akışı odasında genişliktir;
h cm paralel-plaka akışı odasında yüksek olması;
µ viskozite cP (g/cm·s) medya var.
Not: τ tipik laminer kesme stres deneyler (non-bu iş akışında pulsatil) yapılmaktadır = 1 Pa (10 dynes/cm2). µ ve bir Vikozimetre bir koni ve plaka Vikozimetre gibi kullanarak ölçülen serum ve ek dextran9dahil olmak üzere medya içeriğine bağlı olarak değişebilir. - Belirli bir τ (shear stres) elde etmek için akış hızı ve/veya viskozite ayarlayın. Daha yüksek akış oranları, yapışık hücreleri slayttan ayırmak. Örnek akış oranları tipik akışı chambers ile Tablo 1' de gösterilmiştir.
6. Kurulum izleme sistemi ve birden çok paralel-plaka akışı Chambers (Şekil 2) için özel bir ortam
- Birden fazla raflar, iç elektrik erişim ve cam kapı ile büyük bir ısıtmalı birim/kuluçka kullanın — BEACH (ayarlanabilir CO2 ile yapılı-içinde çevre) ve ısı anılacaktır — birden çok akış salonları aynı anda için evine bu deneyler Yamultma stres ve iki veya daha fazla tedaviler veya çıkışları (yani, DNA, RNA ve protein) arasında doğrudan karşılaştırma gerektirir.
Not: Plaj çevrenin sık sık kesinti olmadan akış hızı da dahil olmak üzere akış devrenin sık izlenmesi için izin verir. - Yeterli CO2 deneme için kullanılabilir ve CO2 monitör işlevsel olduğundan emin olun. Öyle ki orada-ecek var olmak oksijen hava su tepsisi uygun şekilde doldurulur, emin olun.
7. set-up paralel-plaka akışı cihazları
Not: paralel plakaların üretimi için lütfen bkz: Lane vd. 9.
- Otoklav akışını odası tabaklar, rezervuar, TAV, boru ve yapma Tablo 2' de gösterildiği gibi her paralel-plaka akışı odası kurulum için.
-
Set-up akışı döngü derleme (Şekil 3).
- Steril havlu biyolojik emanet dolabına koyun. Akışı döngü, ilk şifre olmadan sisteme biyolojik güvenlik kabini paralel-plaka akışı odasında bir araya getirin.
- Boru montaj için rezervuar Bağlan:
- Bir delik ve iki #14 yumuşak tüpler içine akışı depo kapağı diğer iki delik #14 sabit tüp takın. Yumuşak tüpler biri su deposu olarak Çıkış boru alt dokunduğundan emin olun.
- 1/16" yerleştirmek zor #14 sonunda erkek radarı tüp ve bir hava deliği olarak steril bir filtre ekleyebilirsiniz.
- 1/16" yer #14 yumuşak giriş akımı sonunda kadın radarı Tüp, su deposu gelen ve 4 yönlü stopcock ekleyebilirsiniz.
Not: gen ifade analizi veya nerede perfusates toplanan olması gerekmez diğer çalışmalar için 2 yönlü Kesme muslukları yerine 4-yol Kesme muslukları bu protokol kullanılabilir. - 1/16" yer havzanın gelen erkek radarı #14 yumuşak çıkım tüp sonunda.
- Depo çıkış boru pompa boru için bağlanmak: 1/16" yer her iki ucuna bir #13 zor tüp (pompa boru) adlı kadın radarı. #14 yumuşak çıkım tüp su deposu #13 sabit boru 1/16" bağlanarak bağlanmak erkek ve kadın yapma birlikte.
- Pompa boru 'sönümleyici Köprüsü' boru ile bağlanmak: 1/8" yer erkek radarı ve bir 1/8" #16 yumuşak tüp her ucunda kadın radarı. 1/16" bağlanmak (Pompa Boru çıkış sonunda) #13 sert boru ile 1/8" kadın radarı #16 yumuşak boru erkek radarı.
- Akış sönümleyici için boru montajı: 3/16" yer #25 yumuşak boru bir ucundaki erkek radarı ve bu akışı sönümleyici diğer taraf için tekrarlayın. #25 yumuşak tüpler ücretsiz uçları akışı düzenleyiciyi her tarafına takın.
- 'Sönümleyici Köprüsü' boru boru ile bağlanmak için akış sönümleyici: #25 yumuşak tüp akışı sönümleyici ' 1/8" kullanarak sönümleyici Köprüsü' #16 yumuşak tüp ile bağlanmak kadın radarı #16 'sönümleyici Köprüsü' yan ve zaten yerleştirilmiş 3/16" erkek radarı #25 yumuşak sönümleyici tüp taraftan.
- 'Odası Köprüsü' boru montajı:
- 1/8" yer kadın radarı ve bir 1/8" her ucunda bir #16 yumuşak tüp ('odası Köprüsü' boru) erkek radarı.
- 1/8" bağlamak ile 3/16" 'odası Köprüsü' nün kadın radarı #25 yumuşak Tube ücretsiz akış sönümleyici sonundan itibaren erkek radarı.
- 1/8" erkek radarı (ücretsiz son) 'odası Köprüsü' hortumunun yerleştirin 4 yönlü stopcock.
- 4-yol stopcock 4 yönlü stopcock depo girişi yumuşak boru (7.2.2.3. adımdaki) üzerinden 'odası Köprüsü' ücretsiz ucunu bağlayın. Kesme muslukları kapatın.
- Medya rezervuar ve sönümleyici ekleyin. 48-h pozlama stres yamultmak rezervuar ve düzenleyiciyi için 25 mL 35 mL medya ekleyin. Medya akışı deney ve seribaşı hücre sayısı süresi tabanlı ses düzeyini ayarlayın.
- Beach pompa monte akışı döngü sistemi getirmek. #13 zor tüp (pompa boru) pompa içimizi yerleştirin ve güvenli. Kesme muslukları açın.
- Üzerinde bir pompa ve yavaş yavaş pompa hızını artırmak. Döngü sistemi üzerinden sirküle medya izin. Herhangi bir sızıntı veya tıkanıklık (Örneğin, basınç birikmesi) olup olmadığını denetleyin. Medya geri havzanın akıyor emin olun.
-
Kurulum akış odası Meclisi
- 1/8" yer bir # 16 yumuşak bir ucunda kadın radarı tüp ve 4 yönlü stopcock ekleyebilirsiniz. Tüp Ücretsiz ucunu üst plaka (girişi yan) sağ tarafına takın.
- Bir 1/8" yer erkek radarı bir # 16 yumuşak bir uçta tüp ve 4 yönlü stopcock ekleyebilirsiniz. Tüp Ücretsiz ucunu üst plaka (Çıkış tarafı) sol tarafına takın.
- 1/8" yer erkek radarı ve bir 1/8" #16 yumuşak tüp her ucunda kadın radarı (kabarcık tuzak boru). Kabarcık tuzak yoluyla için 1/8" tüp takmak erkek radarı. 4-yol stopcock boru ile 1/8", diğer ucunu takın kadın radarı.
- Steril Cımbız kullanarak, cep numaralı seribaşı cam slayt 4-şey hücre kültür yemek için ara alt plaka üzerinde aktarın. Cam slayt hücre numaralı seribaşı yüzün dönük olduğundan emin olun.
- 10 mL şırınga kullanarak, alt plaka plaka etrafında kırmızı conta çizgi içinde 10 mL sıcak ortam ekleyin. Medya slayt akışı ve hücreleri kapak izin. Medya slayda doğrudan eklemekten kaçının.
- Yavaşça bir taraftan diğer tarafa hizalama alt plaka üst tabağa yerleştirin. Hava kabarcıkları giriş kaçının. Tabakları birlikte sıkıca canı cehenneme.
- Hava kabarcıkları kabarcık tuzak stopcock plaka (giriş) sağ tarafında açılış ve yavaşça bir 30 mL şırınga kullanarak sıcak ortamın 20 mL sifonu kaldırın. Stopcock sol tarafında (çıkış) plaka kapalı ve medya kabarcık tuzak stopcock (açık) akıyor emin olun. Kızarmış medya atmak.
- Stopcock üzerinde kabarcık tuzak kapatın ve sol tarafında (çıkış) odasının stopcock açın. Odası sol tarafta (çıkış) 45 ° açılı yüceltmek ve yavaşça odanın sağ tarafında (giriş) 30 mL şırıngadan hava kabarcıkları odasından kaldırmak için sıcak ortamı 20 mL sifonu. Kabarcıklar pencereden görüntülenmeyecektir. Kızarmış medya atmak.
- Kesme muslukları odası ve kap her iki tarafında kapatın. Hücreleri tarafından mikroskobu inceleyin.
- Önceden monte devre sistemi ile plaj odasına taşımak.
- Yavaş yavaş bağlantı pompa hızını azaltın ve pompa duraklatabilirsiniz. Kesme muslukları kaçağı önlemek için akışı döngü sistemi kapatın.
- Odası bağlanmak ve sistem birlikte yolu ile Kesme muslukları döngü. Kesme muslukları açın.
- Yavaş yavaş pompa hızını artırmak ve kurulum herhangi bir sızıntı veya tıkanıklık için inceleyin. Medya tek yönde dolaşır ve rezervuar için verir emin olun.
- Akış sensoru odası girişi tarafında bulunan 'odası Köprüsü' boru yerleştirin. Sensör düzgün akış yönünde odaklı emin olun.
- Daha önce hesaplanmıştır akış hızı elde etmek için pompa hızı üzerinde istenen kesme stres göre ayarlayın.
Not: Akış hızı yükseklik ve genişlik, her odasının yanı sıra medyasının viskozite bağlı olarak değişebilir. - CO2 tank % 5 CO2 elde etmek ve bir su tepsisi BEACH içinde yer açın.
8. hasat hücreleri ve RNA çekme--dan akışı odası
- İstediğiniz zaman dönemi akışı tamamlandıktan sonra yavaş yavaş peristaltik pompa hızı 0 geri çevirmek ve gücü kapatın. Hızlı bir şekilde açık Kesme muslukları kapatın ve odası ve her ucunda bir stopcock ile ekli boru kaldırın.
- Odası için temiz bir benchtop al ve yavaşça üst plaka kaldırmak için tüm vidayı sökün. İğne-burun Cımbız kullanarak, cam slayt alt plaka çıkarın ve 100 mm çapında doku kültürü çanak yerleştirin.
- Slayt soğuk fosfat tamponlu tuz (PBS)- / - 10 mL ile yıkayın ve hücreler mikroskopla hücre bağlılık ve uyum içinde akış yönünü onaylamak için kontrol edin.
- PBS plaka Aspire edin ve slayt temiz 100 mm çapında çanak transfer. 350 µL lizis arabelleği RNA çekme--dan eklemek (bkz. Tablo reçetesi) kit 1/100, beta-mercaptoethanol, slayt içeren.
Dikkat: beta-mercaptoethanol bir kimyasal duman mahallede ekleyin. - Hücre polietilen kanatlı hücre kazıyıcı kullanarak slaydın dışına kazı. Havuzu alt, sıvıya etkinleştirme doku kültürü çanak eğilme ve forseps ile cam slayt kaldırın. 1.5 mL tüp içine lysate hücre pipette ve buz üzerinde tutun.
- Hisse senedi eksojen RNA (luciferase RNA) referansı 0.0025 ng/µL örnek için eklemeden önce seri seyreltme yoluyla sulandırmak. Hisse senedi toplama 1 µg/µL ise, örneğin, 1/400.000 seyreltme 0.0025 ulaşmak için gereken ng / µL. eklemek 10 µL, seyreltilmiş luciferase RNA hücre aşağı akım RNA izolasyon ve analiz için lysate her örneği için.
- Üreticinin yönergelerine göre RNA ayıklama kuralıyla devam veya lysate mümkün kadar çıkarma ile devam etmek-80 ° C'de dondurmak.
9. RNA ayıklama ve cDNA sentez verimliliğini hesaplanması
Not: teorik verim ve deneysel verim karşılaştırarak RT-qPCR sonra luciferase verimlilik hesaplamak.
- Luciferase RNA için teorik verim belirlemek.
- Örnek eklendi luciferase kopya toplam miktarını belirlemek. (0.025 ng/örnek ekleme 2,73 x 107 kopya luciferase örnek RNA ayıklama önce RNA =.)
- Luciferase RNA moleküler kütlesi nükleotit başına bir ortalama molekül ağırlığı 330 g/mol kullanarak ve ateş böceği luciferase RNA, 1652 nükleotit boyla çarparak hesaplar.
- Luciferase eklendi RNA miktarı bölün (0,025 ng) RNA ayıklama molar miktar vermeye molekül ağırlığı tarafından önce her örnek için. O zaman, bu Avogadro sayısı örnek eklendi kopya vermeye tarafından çarpın.
- Her RT-qPCR tepki luciferase kopyalar için teorik verim denklemi kullanarak hesaplar:
- Her RT-qPCR tepki luciferase kopyalar için deneysel verim RT-qPCR için standart bir eğri oluşturmak için luciferase plazmid kullanarak hesaplar.
- Luciferase verimlilik (%) denklemi kullanarak hesaplar:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Luciferase plazmid enzimleri kullanarak başarılı doğrusallaştırma sindirilir ürünlerde çalışan bir özel jel (Şekil 1) tarafından doğrulandı. Doğrusallaştırılmış ürünün DNA merdivenleri kullanarak doğrulandı ve kesilmemiş plasmid Noir'de.
Paralel-plaka akışı odası kurulum Lane ve ark. üzerinden adapte olması birden çok koşul/tedaviler kesme stres ile veya birden fazla kesme stres koşulları gerektirir deneyler için 9 . Özel bir ortam, birden fazla evi, BEACH, kullandığımız tüm akış oranları (Şekil 2) izlenen tam olarak birleştirilmiş akışı devreleri. Akış hızı izlenir sadece ters yönde paralel-plaka derleme (Şekil 3). Akış devreler ve oranları sıcaklık, nem veya gaz içeriği plaj içinde dalgalanmalar neden olmadan doğrudan cam kapı ile izlenebilir.
Üretim süreçleri odası yükseklik küçük değişimler yol açabilir. Böylece, akış oranları aynı kesme stres (Tablo 1) elde etmek her odası hesaplanması gerekir. Teorik olarak, odalar aynı yükseklikleri ile aynı akış oranları aynı kesme stres elde etmek için kullanabilirsiniz ve serisinde kullanılan. Endotel hücreleri ile tipik deneyler kullanmak kesme stres 0 - 1 1,5 baba. laminer kesme stres Pa bu iş akışındaki modeli arteriyel endotelyal shear strese kullanıldı. Ayrıca olabilir değişimleri pompa baş ayarları arasında ve pompa başkanları içinde kullanımı ile zaman içinde. Akış ölçer kullanarak bu farklar için hesap.
Uygulama kesme stres genelde kullanarak deneyler birden fazla kesme stres koşulları, tedavi koşulları ve zaman puan gerektirir. Mümkün olan yerlerde, için deneysel kurulum herhangi bir variabilities hesap endojen bir referansı RNA kullanın. Bazı deneyler için bir endojen başvuru RNA ile kantitatif istikrar bulmak mümkün16değil. Ayrıca, nicel istikrar veya örnekleri arasında endojen referans gen istikrarsızlık her iki uyarıcı bağımlı hücresel ifade düzeyleri üzerine etkisi veya verimliliği değişimler RNA çekimi veya Ters transkripsiyon bağlanabilir. Bu yetersizliklere ve endojen referans gen kantitatif istikrarlı olmadığı ortamda hesap için bir spike bileşenini eksojen referans gen kullanın. Laminer kesme stres memeli endotel hücrelerinde birleşmeyle deneyler için biz bir ateş böceği luciferase RNA bir eksojen RNA spike-(Şekil 4A) kullanın.
Şekil 4 gösterir analiz RT-qPCR kesme stres deneyler Krüppel benzeri faktör 2 (KLF2) değerlendirilmesi deneysel verilerden işlev kaybı siRNA kullanarak. KLF2 bir transkripsiyon faktörü upregulated endotel hücrelerinde laminar akış ve laminar akış2ayarında endotel Gen ifadesinin büyük bir transkripsiyon arabulucu tarafından var.
Şekil 4A luciferase verimliliği için üç ayrı deneyler, her iki akış odaları kullanarak gösterir. Luciferase verimliliği bir deney (1 deneme) örnekleri arasında benzer veya bazı değişkenliği (deneyler 2 ve 3) göstermek (Şekil 4A). Bu sonuçlar deneysel sistemlerinde özellikle değerli nerede sadece küçük mutlak değişiklikler görülür. Eksojen referans gen kullanımı deneysel tedaviler Ters transkripsiyon veya PCR17verimliliği ile nerede engelleyebilir deneylerde özellikle önemli olabilir. Şekil 4A tasvir tipik sonuçlarıdır. Luciferase verimliliği % 5'lik bu örnek RNA ayıklama önce eklenen % 5 luciferase (yani, RNA'ın ilk başlangıç tutarı) RNA RT-qPCR tarafından algılanır gösterir. Örnekleri ya da tek bir deney içinde koşullar arasında luciferase verimliliği ± % 50 genellikle. Eğer luciferase verimliliği değişkenliği > %50 ve deneysel prosedürler ve koşulları gözden içermelidir sonuçları dikkatle yorumlanmalıdır.
Şekil 4B tipik deneysel sonuçlarından RT-qPCR tekrarlayan shear strese deneyler, her birden çok paralel-plaka akışı chambers kullanarak gösterir. Her deneme içinde KLF2 mRNA ifade üç yoldan normalleştirilmiş. İlk normalleştirme endojen başvuru RNA, Cyclophilin A (CycA) kullanır. İkinci normalleştirme eksojen başvuru RNA, ateş böceği luciferase (Luc) kullanır. Üçüncü normalleştirme hem endojen ve eksojen başvuruyu RNA kullanır. Şekil 4B' gösterilen her deney içinde her üç normalleştirme Yöntem (endojen referans gen, eksojen referans gen ve her iki endojen ve eksojen referans genler birlikte normalleştirme) benzer sonuçlar verir. Normalleştirme yöntemi (Örneğin, olur > %50 fark) sonuçları önemli ölçüde değiştirirse, sonuçları dikkatle yorumlanmalıdır. Normalleştirme yöntemleri arasında önemli ölçüde değişkenlik zaman deneysel sistemdeki bağımlı bir değişken olması gibi endojen başvuru gene(s), gözden geçirilmelidir. Benzer şekilde, deneysel prosedürler ve koşulları gözden geçirilmelidir. Şekil 4B', KLF2 nakavt siRNA kullanarak üç ayrı deneyler (deneme 1, 2 ve 3) arasında benzer devirme verimlilik üretir. Biz üç farklı biyolojik örnek iki aynı anda çalışan akış odaları kesme stres ile 1 kullanarak bu deneyler için kullanılan her deneme için Pa.
Şekil 1: özel jel görüntü eksojen luciferase plazmid doğrusallaştırma. Supercoiled ve 1 kb + DNA merdivenler imleyicileri kesilmemiş her ikisi de belirlemek ve luciferase plazmid boyutları kilobases (kb) kesmek için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: özel çevre (BEACH) içinde birden çok akışı devre derleme şematik bakış. Her iki akış devrelerde akış oranları kolayca gerçek zamanlı olarak izlenir, bozmadan çevre ve her iki devreler aynı anda çalıştırabilirsiniz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 3: bir tek akış devre derleme şematik bakış. Tüp boyutları ve kullanılan yapma bu şekilde belirtilmiştir. AKIS METRESI akış yönünde odaklı olduğundan ve akış TMMOB ters yönde yerleştirildiğinden emin olun. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: temsilcisi sonuçları KLF2 işlev kaybı deneyler insan endotel hücrelerinde stres yamultmak için maruz üzerinden (1 Pa) 24 h için (A) Bu paneli üç ayrı akışı deneylerde eksojen luciferase RNA miktar gösterir. Luciferase verimliliği bir deney (1 deneme) örnekleri arasında benzer veya bazı değişkenliği (deneyler 2 ve 3) gösterir. Luciferase (mutlak kopya) luciferase transkriptaz kantitatif PCR (RT-qPCR) tarafından standart bir eğri kullanarak mutlak Nefelometri tarafından algılanan RNA kopya sayısıdır. Luciferase verimliliği teorik luciferase kopyalar (bkz. Adım 8 iletişim kuralı) 100 ile çarpılarak her örnek için bölü deneysel luciferase kopya olduğunu. Göreli luciferase verimliliği her deney içinde başvuru durumu (akış + Ctlsi) bölünen her örnek luciferase verimliliği olduğunu. Her iki endojen ve eksojen referans genleri kullanarak (B) aşağıdaki panelleri gösterir bir küme örnek kesme stres gen ekspresyonu normalleştirme deneyleri. Ters transkriptaz kantitatif PCR (RT-qPCR) sonuçlarıdır. Nakavt KLF2 mRNA ifade huzurunda laminar akım kesme stres 1 ile gösterilir Pa için 24 h FC = kat değişiklik; CycA = cyclophilin A, endojen bir başvuru RNA; olarak kullanılan Luc luciferase, RNA eksojen bir başvuru olarak kullanılan =. Adam ve ark. uyarlanmış veri 5. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Oda yüksekliği (mikron; µm) |
Oda genişliği (santimetre; cm) |
1 Pa shear strese debi (mL/dk) | Viskozite (centipoise; cP) |
| 303.80 | 1.90 | 19.48 | 0,90 |
| 326.10 | 1.90 | 22.45 | 0,90 |
| 344.84 | 1.90 | 25,10 | 0,90 |
| 319.06 | 1.90 | 21,49 | 0,90 |
Tablo 1: Odası yükseklikleri ve akış oranları kesme stres 1 elde etmek çeşitli akış chambers için örnekleri baba.
| J bezler |
| Cımbız |
| Rezervuar şişe ve Cap |
| TAV ve Cap |
| Akışı döngü |
| 1/16" erkek radarı x 3 |
| 1/16" kadın radarı x 3 |
| 1/8" erkek radarı x 2 |
| 1/8" kadın radarı x 4 |
| 3/16" erkek adaptör x 2 |
| 14 L/S sabit tüp (2 inç) x 1 |
| 14 L/S yumuşak tüp (5 inç) x 2 |
| 16 L/S yumuşak tüp (3 inç) x 2 |
| 25 L/S yumuşak tüp (3 inç) x 2 |
| 13 L/S sabit tüp (10 inç) x 1 |
| Akış odası |
| 1/8" erkek radarı x 2 |
| 1/8" kadın radarı x 2 |
| 16 L/S yumuşak tüp (3 inç) x 3 |
| Üst ve alt plaka |
| Vidalar |
Tablo 2: parçaları protokolün 6.2 adımda autoclaved olmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yamultma stres endotel fonksiyonları, kısmen, kararlı durum gen ifade2,5etkileyen tarafından gelen fizyolojik bir durumdur. Gen düzenlemesi çeşitli kesme stres koşullarında modellerinin endotel fonksiyonları daha büyük bir anlayış için katkıda bulunacaktır. Bu pragmatik iş akışı Lane ve ark. uyarlanmış bir paralel-plaka akışı odası kullanarak akış devre içerir 9 ve temsil laminer, pulsatil olmayan akışı. Genel kurulum gerektiren birden çok akış odaları ve deneysel değişkenlik bu ortamda en aza indirmek deneyler kolaylaştırmak için tasarlanmıştır.
Akış devre derleme bu iş akışı, önemli bir bileşenidir ve Lane ve ark. adapte 9. bu derleme ve protokol çeşitli uyarlamalar deneysel sistemleri farklılıkları yansıtacak şekilde yapılmıştır. Büyük bir ısıtmalı ünitesi, plaja, eşzamanlı operasyon ve aynı ortamda çeşitli akış devrelerin izleme kolaylaştırır bir uyum olduğunu. Bu sistem başarıyla kesme stres endotel hücrelere uygulanması için çeşitli dönemlere, 1 h 7 gün için ve yamultma stres çeşitli düzeylerde kullanılmaktadır (Örneğin, 1.0, 1.5 ve 2.0 Pa). Bu sistem ayrıca gen devirme çalışmaları için bir akış duyarlı endotel gen kesme stres (Şekil 4)5ortamda işlevini değerlendirmek için kullanıldı. Pompalar ve ayrıca normal aşınma ve yıpranma nedeniyle zamanla değişebilir pompa başkanları arasında önemli ölçüde değişkenlik vardır. Yer alan bir akış sensoru kullandığımız bu farklar için hesap için sürekli akış oranları izlemek için akış odasına proksimal. Çeşitli boyutlarda yapma ve boru her bileşen için sıkı bir uyum sağlamak ve deneyler sırasında herhangi bir sızıntı önlemek için kullanılır. Biz hücre sayılan ve yaklaşık 1.000.000 hücreleri cam slayt, dropwise, tohumlari ve bağlılık verimliliğini artırmak 15 dakika 37 ° C'de kuluçkaya hücreleri izin. Yamultma stres9uygulamadan önce kısa bir süre için seeded, endotelyal progenitor hücreler için karşılaştırıldığında en az 24 h kesme stres uygulamadan önce insan endotel hücreleri tohum. Daha kısa süreler hücrelerinin akışı veya kesintili bir katman bile uygun tohumlama yoğunluğu ile endotel hücrelerinin sırasında kekii için yol açabilir. Biz önce ve yamultma stres uygulamadan sonra endotel hücrelerinin konfluent monolayer slaytlarını incelenmesi vurgulamak. Biz bir doğal hücre dışı matriks bileşen18, fibronektin ile kaplı slaytlar endotel monolayer jelatin ile kaplı iki taraf için de sürekli olarak karşılaştırıldığında daha fazla korumak bulmak (fibriler denatüre tip ı kollajen). Son olarak, bu iletişim kuralı akışı sönümleyiciler medya, medya diğer üreticileri için 190 mL göre 30 mL kullanmak için optimize edilmiştir.
Akış devre derleme birkaç adımda ek bir dikkat gerektirir. Hatta bir monolayer endotel hücrelerinin kesme stres uygulama öncesinde kurulmalıdır. Dropwise slayt ve en genel slayt kapsama, böylece, uygun hücre sayısını artırmak için cam slayt üzerine tohum hücrelere önemlidir. Slayda uygun yerine uzak birden çok slayt tepsisine yıkanması hücreler için yeterli zaman sağlar gibi tohum ve ilave her türlü medya genellikle için slayt ekleme hücre arasındaki bekleme süresine tohumlama etkili olmasını sağlar. Hücreler öncesinde, sırasında ve yamultma stres uygulama sonrası kontrol edin. Mikroskop-ebilmek konmak plaj bu amaç için. Akış sensoru doğru yönde bağlanması gerekir ve hedef akış hızı için her bireysel akışı odası kontrol edilmelidir. Akış döngü sistemi olmadan hiçbir medya sızıntı veya hücreleri gerçek deneyler sırasında perturbing önlemek için basınç birikmesi gibi diğer sorunları önlemek amacıyla odası periosteum. İçin incelemek ve baloncuklar içinde belgili tanımlık sistem ortadan kaldırmak. Akış döngü sistemi test ederken, Kesme muslukları peristaltik pompa kesintisiz, tek yönlü akışı sağlamak için açmadan önce tüm açık olduğundan emin olun. Tüm Kesme muslukları için döngü akış odası bağlama önce kapalı ve tam olarak pompa yeniden başlatmadan önce açılan emin olun.
Biz bir eksojen referans gen ilavesi çeşitli senaryolarda yararlı bulacaksınız. Endotel hücre medya genellikle bir inhibitörü PCR17heparin içerir. Bazı RNA çıkarma protokolleri heparin kaldırmak için adımları dahil ederken, eser miktarda PCR verimliliği örnekleri arasında farklılıklar neden olabilir. Güçlü tedaviler de kantitatif stabil bir endojen referans gen tanımlaması engel. Laboratuarımızın eksojen başvuru RNA olarak kullanılmak üzere 5'-şapkalı ve poli A kuyruklu luciferase RNA sentez için verimli bir iletişim kurallarını oluşturmuştur. Bu strateji piyasada bulunan bir RNA satın alma için karşılaştırıldığında düşük maliyetli bir yaklaşım olduğunu kanıtlamıştır. Eksojen başvuru RNA hazırlanması sırasında birden çok donma-çözülme döngüsü önlemek için aliquot RNA tek kullanımlık aliquots içine önemlidir. Ayrıntılı karıştırma ve doğru pipetting arası aliquot tutarlılığı korumak açısından önemlidir. Tipik deneyler luciferase verimliliği % 5 ± %2,5 aralığında gösterir ancak % %1 - 10 arasında olabilir. Eksojen başvuru RNA verimliliği ve endojen başvuru (düzeni) gen için RT-qPCR sonuçları düzeltmek akıllıca olur.
Biz kuralları deneyler için ateş böceği luciferase dizileri memeli spike içinde başvuru RNA olarak memeli modelleri kullanılır. Nerede ateş böceği luciferase hücrelerde ifade edilir deneylerde, bu bir uygun başvuru gene olmaz. Diğer species-specific başvuru genler, Caenorhabditis elegans miRNA cel-miR-3919 ve Ribuloz bisphosphate carboxylase bitki RNA20de dahil olmak üzere kullanılabilir.
Bu akış devre endotel hücre doku kültürü plastik ya da oldukça sert cam üzerinde yetiştirilen bir 2-B monolayer modelleri. Matris sertlik sıvı kesme stres21endotel yanıt etkileyebilir. Bu modeli sistem nispeten yüksek oksijen konsantrasyonu venöz oksijen konsantrasyonları arter için benzer kullanır. Bu modeli yakından daha büyük damarlarının düz parçalar kapalı bir kardiyovasküler sistem benzer ve slayt üzerinde endotel hücreleri için nispeten homojen bir ortam sağlar. 3-b yapıları, bifurcations veya eğrilikleri değişik gemiler gibi diğer özel durumlar bu model ile gösterilir. Diğer sistemleri damarlara eğri bölgeleri de dahil olmak üzere diğer akış modelleri model ama bu iletişim kuralında tanımlanan sistemini daha az sayıda hücre verim. Benzer şekilde, > 1 x 106 hücreler gerekli olduğunda ya da bir tek hücre Analizi gerekiyorsa diğer derlemeler daha uygun olabilir. Bizim Şu anki uygulama pulsatil olmayan laminar akış modelleri. Ancak, bu model akış oranları sürekli takip pulsatil veya salınım dalga biçimleri, tutarlılık ile dahil olmak üzere diğer dalga biçimleri oluşturmak için kullanılabilir.
Genel olarak, pragmatik bu iş akışı için birden çok akış chambers izlenen akış oranları ile eşzamanlı uygulamaya kesme stres bir sistemi sağlar. Malzeme ve bu iş akışı yordamlarda örnekleri ve koşullar arasında deneysel değişkenlik en aza indirmek için tasarlanmıştır. Bu iş akışı başarıyla laminar akım ayar olarak RNAi deneyler için kullanılan ve laminer kesme stres ile birden çok koşul veya birden çok laminer kesme stres büyüklükleri ve/veya zaman puan da dahil olmak üzere, gerektiren herhangi bir deney için de kullanılabilir. Alternatif dalga biçimleri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser için Pam. CIHR paspas 142307 tarafından desteklenen H.S.J.M. bir Kanada kurumları, sağlık araştırma eğitim programı rejeneratif tıp kardeşlik bir alıcı olduğunu. H.S.J.M., A.N.S., K.H.K. ve M.K.D. Kraliçe Elizabeth II Lisansüstü Bursları bilim ve teknolojideki alıcıları vardır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | gibco | 25300-062 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 10 mm2 Culture Dish | Sarstedt | 83.3902 | |
| 30 mL Syringe | BD | 302832 | |
| 4-Way Stopcocks | Discofix | D500 | |
| Aluminum foil | |||
| BEACH | Darwin Chambers Company | MN: HO85, SN: 4947549 | |
| Cell Scrapers | |||
| CO2 Meter | BioSphenix, Ltd. | MN: P120, SN: 0342 | |
| CO2 Sensor | BioSphenix, Ltd. | MN: C700, SN: 52852 | |
| Distilled water | gibco | 15230-170 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) -/- | gibco | 14190-144 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 | Promo Cell | C-22011 | |
| Endothelial Cell Growth Medium 2 Supplement Mix | Promo Cell | C-39216 | |
| Fibronectin (pure) | Sigma-Aldrich | 11051407001 | |
| Filter (0.20 um) | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| Flow Dampener and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Meter: 400 Series Console | Transonic Scisense Inc. | T402 | |
| Flow Meter: 400 Series Tubing | Transonic Scisense Inc. | TS410 | |
| Flow Reservoir and Cap | U of T glass blowing shop | ||
| Flow Sensor | Transonic Scisense Inc. | ME4PXL | |
| Isotemp 737F Oven | Fisher Scientific | FI-737F | |
| J cloth | J cloth | ||
| Microscope Slide (25 x 75 x 1 mm) | Fisherfinest | 12-544-4 | |
| Paper sterilization pouch | Cardinal Health | 92713 | |
| Pump (Masterflex L/S Economy Drive) | Cole-Parmer | 7554-90 | |
| Pump Head (Masterflex L/S Easy Load) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| Rectangular 4 Well Dish | Thermo Scientific | 267061 | |
| Tweezers | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tubing | |||
| Masterflex C-Flex L/S 25 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-25 | |
| Masterflex C-Flex L/S 14 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-14 | |
| Masterflex C-Flex L/S 16 Soft Tubing | Cole-Parmer | 06424-16 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 13 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-13 | |
| Masterflex PharMed BPT L/S 14 Hard Tubing | Cole-Parmer | 06508-14 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luer | |||
| 3/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-08 | For #25 tubing |
| 1/8" Male Luer | Cole-Parmer | 30800-24 | For #16 tubing |
| 1/8" Female Luer | Cole-Parmer | 30800-08 | For #16 tubing |
| 1/16" Male Luer | Cole-Parmer | 45518-00 | For #14 tubing |
| 1/16" Female Luer | Cole-Parmer | 45508-00 | For #14 tubing |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockdown reagents | |||
| Oligofectamine Reagent | Invitrogen | 12252-011 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | gibco | 31985-070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| In vitro transcription | |||
| Generuler 1kb+ DNA ladder | Thermo Scientific | SM1331 | |
| MEGAclear Kit | Ambion | AM1908 | |
| mMESSSEGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Ambion | AM1340 | |
| pSP-luc+ | Promega | E4471 | |
| Supercoiled DNA Ladder | New England BioLabs Inc. | N0472S | |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-500 | |
| UltraPure Ethidium Bromide | Invitrogen | 15585011 | |
| XhoI Restriction Enzyme | New England BioLabs Inc. | R0146S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RNA extraction | |||
| Beta-mercaptoethanol | Sigma | M3148-100mL | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
References
- Aird, W. C.
- Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease. Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).
- Garcia-Cardena, G., Comander, J., Anderson, K. R., Blackman, B. R., Gimbrone, M. A. Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (8), 4478-4485 (2001).
- Cybulsky, M. I., Marsden, P. A. Effect of disturbed blood flow on endothelial cell gene expression: a role for changes in RNA processing. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (9), 1806-1808 (2014).
- Man, H. S. J., et al. Angiogenic patterning by STEEL, an endothelial-enriched long noncoding RNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2401-2406 (2018).
- Won, D., et al. Relative reduction of endothelial nitric-oxide synthase expression and transcription in atherosclerosis-prone regions of the mouse aorta and in an in vitro model of disturbed flow. The American Journal of Pathology. 171 (5), 1691-1704 (2007).
- Baeyens, N., et al. Vascular remodeling is governed by a VEGFR3-dependent fluid shear stress set point. eLIFE. 4, 04645 (2015).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Fleming, I. The atherosusceptible endothelium: endothelial phenotypes in complex haemodynamic shear stress regions in vivo. Cardiovascular Research. 99 (2), 315-327 (2013).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of Visualized Experiments. (59), 3349 (2012).
- Gray, K. M., Stroka, K. M. Vascular endothelial cell mechanosensing: New insights gained from biomimetic microfluidic models. Seminars in Cell and Developmental Biology. 71, 106-117 (2017).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. Review of Scientific Instruments. 53 (12), 1851-1854 (1982).
- Resnick, N., Gimbrone, M. A. Hemodynamic forces are complex regulators of endothelial gene expression. The FASEB Journal. 9 (10), 874-882 (1995).
- Malek, A. M., Alper, S. L., Izumo, S. Hemodynamic shear stress and its role in atherosclerosis. The Journal of the American Medical Association. 282 (21), 2035-2042 (1999).
- DeStefano, J. G., Xu, Z. S., Williams, A. J., Yimam, N., Searson, P. C. Effect of shear stress on iPSC-derived human brain microvascular endothelial cells (dhBMECs). Fluids and Barriers of the CNS. 14 (1), 20 (2017).
- Thormar, H. G., et al. Importance of the efficiency of double-stranded DNA formation in cDNA synthesis for the imprecision of microarray expression analysis. Clinical Chemistry. 59 (4), 667-674 (2013).
- Johnston, S., Gallaher, Z., Czaja, K. Exogenous reference gene normalization for real-time reverse transcription-polymerase chain reaction analysis under dynamic endogenous transcription. Neural Regenation Research. 7 (14), 1064-1072 (2012).
- Vaughan-Shaw, P. G., et al. A simple method to overcome the inhibitory effect of heparin on DNA amplification. Cellular Oncology (Dordrecht). 38 (6), 493-495 (2015).
- Collins, C., et al. Haemodynamic and extracellular matrix cues regulate the mechanical phenotype and stiffness of aortic endothelial cells. Nature Communications. 5, 3984 (2014).
- Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circulation Research. 107 (5), 677-684 (2010).
- Smith, R. D., Brown, B., Ikonomi, P., Schechter, A. N. Exogenous reference RNA for normalization of real-time quantitative PCR. Biotechniques. 34 (1), 88-91 (2003).
- Kohn, J. C., et al. Cooperative effects of matrix stiffness and fluid shear stress on endothelial cell behavior. Biophysical Journal. 108 (3), 471-478 (2015).
