In Vitro Método de Control de concentraciones de Gases halogenados en cultivos de células epiteliales alveolares

Resumen

Se describe un protocolo fácil diseñado específicamente para alcanzar precisas y controladas las concentraciones de sevoflurano o isoflurano en vitro con el fin de mejorar nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la lesión pulmonar epitelial y poner a prueba la novela terapias para el síndrome de dificultad respiratoria aguda.

Resumen

Síndrome de dificultad respiratoria agudo (SDRA) es un síndrome de lesión alveolar difusa con deterioro separación líquido alveolar e inflamación severa. El uso de agentes halogenados, como el sevoflurano o isoflurano, para la sedación de pacientes de la unidad de cuidados intensivos (UCI) puede mejorar intercambio del gas, reducir el edema alveolar y atenuar la inflamación durante el SDRA. Sin embargo, se carecen de datos sobre el uso de agentes inhalados para continua sedación en la UCI para tratar o prevenir el daño pulmonar. Para estudiar los efectos de los agentes halogenados en las células epiteliales alveolares bajo condiciones "fisiológicas", describimos un sistema fácil para células en cultivo en la interfase aire-líquido y exponerlos a agentes halogenados para proporcionar fracciones precisa "aire" y concentraciones de "medio" para estos agentes. Hemos desarrollado un compartimiento hermético sellado en el que las placas con células inmortalizadas epiteliales alveolares humanas pudieran estar expuestas a una fracción exacta, controlada de sevoflurano o isoflurano usando un flujo de gas continuo proporcionado por un circuito de la máquina anestésica. Las células fueron expuestas al 4% de sevoflurano y 1% de isoflurano durante 24 horas. Espectrometría de masas de gas se realizó para determinar la concentración de agentes halogenados, disuelto en el medio. Después de la primera hora, las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano en el medio fueron 251 mg/L y 25 mg/L, respectivamente. Las curvas que representan las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano disuelven en el medio demostrado cursos similares en el tiempo, con una meseta que alcanza en una hora después de la exposición.

Este protocolo fue diseñado específicamente para llegar a precisa y controladas las concentraciones de sevoflurano o isoflurano en vitro para mejorar nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la lesión epitelial pulmonar durante el SDRA y probar nuevas terapias para el síndrome.

Introducción

Síndrome de dificultad respiratoria agudo (SDRA) es un síndrome clínico caracterizado por lesión alveolar difusa, edema pulmonar y la insuficiencia respiratoria hipoxémica. Aunque ARDS representa más del 10% de los ingresos de la unidad de cuidados intensivos (UCI) y casi el 25% de pacientes de la UCI que requieren ventilación mecánica, sigue siendo un reto poco reconocidos para los médicos, con una tasa de mortalidad del hospital de 35-45%¹. A pesar de intensa investigación, la identificación de una terapia farmacológica eficaz de SDRA o de prevención ha fracasado hasta la fecha. Dos características principales contribuyen a la mortalidad en S....

Protocolo

1. cultivo de células epiteliales alveolares (hAELVi)

1. El deshelar
   1. Pipetear 4 mL de medio de cultivo listo para su uso humano alveolares epiteliales (huAEC) en un tubo de plástico de 15 mL y descongelar rápidamente el vial en un baño de agua precalentado (37 ° C).
   2. Transferir la suspensión de células descongeladas a un tubo de plástico de 15 mL que contiene 4 mL del medio antes de centrifugar el tubo a 200 x g durante 5 minutos.
   3. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular con 5 mL de medio de cultivo. Luego, se transfieren las células a un matraz de T25.
   4. Cultivar las células en condiciones normales (5% CO....

Resultados

Las concentraciones del sevoflurano y el isoflurano, que disueltos en el medio con el tiempo, se reportan en la tabla 1 y tabla 2, respectivamente.

Los cursos de las concentraciones de sevoflurano y el isoflurano en el medio fueron similares en el tiempo. Inmediatamente después de la concentración requerida de agente halogenado se estableció, las concentraciones aumentaron durante la primera hor.......

Discusión

Nuestro protocolo describe un método sencillo para exponer las células a una fracción exacta de un agente anestésico halogenado, como el sevoflurano o isoflurano. Además, se presenta aquí, por primera vez — una correlación rigurosa entre la fracción de gas y la concentración de sevoflurano y el isoflurano en el medio de cultivo propio. Este paso fundamental ahora nos permite poder usar nuestra cámara hermética para estudiar los efectos de estos agentes halogenados en una monocapa de cultivo de células epiteliales alveola.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sevoflurano	Baxter		Se debe desaconsejar encarecidamente la realización de experimentos con sevoflurano o isoflurano durante el embarazo
Isoflurano	Virbac		Se debe desaconsejar encarecidamente la realización de experimentos con sevoflurano o isoflurano durante el embarazo
Células epiteliales alveolares humanas	InScreenex	INS-CI-1015
huAEC Medio ( listo para usar)	InScreenex	INS-ME-1013-500ml
Circuito de la máquina anestésica	Drager	Fabius
Analizador de gas	Drageer	Vamos Plus
Filtro de gas anestésico	SedanaMedical	FlurAbsord
Humifier calentado	Fisher& Paykel	MR850
	Curvador	de cámara 00012-416-00
Cromatografía de gases acoplada a detección de masas	Thermo Fisher Scientific, San José, CA, EE. UU	Traza 1310 con columna de sílice fundida TSQ 8000evo
(30 m x 1,4 μ m, 0.25 mm ID)	Restek, Lisses, Francia	Rxi-624Sil MS

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