Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la construcción de un modelo de derrame pleural en ratas por la instilación intratraqueal de poliacrilato/Nanosílice.
Abstract
Derrame pleural es un hallazgo clínico frecuente de muchas enfermedades pulmonares. Tener un modelo útil animal derrame pleural es muy importante para el estudio de estas enfermedades pulmonares. Modelos anteriores de la efusión pleural pagaron más atención a los factores biológicos en lugar de nanopartículas en el medio ambiente. Aquí, presentamos un modelo para que la efusión pleural en ratas por la instilación intratraqueal de poliacrilato/Nanosílice y un método de aislamiento de nanopartículas en la efusión pleural. Mediante instilación intratraqueal de poliacrilato/Nanosílice con concentraciones de 3.125, 6.25 y 12.5 mg/kg∙mL, la efusión pleural en ratas presentada el día 3, alcanzó su punto máximo a los 7-10 días en 6,25 y 12,5 mg/kg∙mL grupos, luego poco a poco disminuyó y desapareció el día 14. Cuando la concentración de poliacrilato/Nanosílice aumenta, la efusión pleural es producido más y más rápido. Este líquido pleural fue detectado por ecografía o TC de tórax análisis y confirmado por la disección de ratas. Nanopartículas de sílice se observaron en la efusión pleural las ratas por microscopio electrónico de transmisión. Estos resultados mostraron que la exposición a polyacrylate/Nanosílice conduce a la inducción de la efusión pleural, que era constante con nuestro anterior informe en seres humanos. Además, este modelo es beneficioso para el estudio adicional de la Nanotoxicología y las enfermedades de la efusión pleural.
Introduction
Derrame pleural es una manifestación clínica muy común de enfermedades pulmonares con una variedad de causas. Tener un modelo útil animal derrame pleural es muy importante para el estudio de estas enfermedades pulmonares, los papeles de las dos capas de la membrana pleural, los mecanismos de la efusión pleural y su tratamiento. Sin embargo, algunos divulgan modelos de derrame pleural se centran principalmente en el derrame pleural maligno o factores biológicos en lugar de las nanopartículas en el medio ambiente1,2. Aquí, presentamos un nuevo modelo de derrame pleural que es sencilla, segura y eficaz.
Con el desarrollo de la nanotecnología y el uso extensivo de los nanoproductos, existe una preocupación sobre los peligros potenciales de los nanomateriales para el medio ambiente y la salud humana3,4. Nanomateriales introducen factores de riesgo y potencialmente conducen a nuevos riesgos en el lugar de trabajo o a través de la contaminación ambiental. Los estudios in vitro e in vivo demuestran que los nanomateriales pueden resultar en daño a múltiples órganos a los pulmones, el corazón, el hígado, el riñón y el sistema nervioso, así como el sistema inmune y reproductivas5,6. Además, algunos estudios informaron que la toxicidad específica de nanomateriales fue debido a sus propiedades fisicoquímicas únicas3,4,7.
Nos han informado que un grupo de trabajadores con exposición ocupacional a los nanomateriales presentó clínico con derrame pleural y pericárdico, fibrosis pulmonar y granuloma8,9. Nanopartículas de sílice fueron aisladas en derrame pleural9 estos pacientes. Para reproducir y comprobar la efusión pleural inducida por las nanopartículas inhaladas en humanos, se realizó el experimento por inculcar el polyacrylate/Nanosílice (PA/NPSi) a través del tracto respiratorio en ratas, que mímico la respiración humana en una verdadera medio ambiente y encontrado eso intratraqueal instilación de PA/NPSi podría resultar en derrame pleural en ratas. Aquí, presentamos cómo hacer efusión pleural en ratas por la instilación intratraqueal de PA/NPSi y cómo aislar las nanopartículas en la efusión pleural. Este modelo puede ser útil para el estudio adicional de la Nanotoxicología y la efusión pleural enfermedades.
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Protocol
El estudio siguió las directrices de la Universidad de medicina de la Capital (Beijing, República Popular China) para el cuidado y uso de animales de experimentación. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Animal ético Comité de Capital Universidad médica de China.
1. experimentales preparados
Nota: Adapte el femenino específico libre de patógeno las ratas Wistar (peso: 200 ± 10 g) a los ambientes experimentales durante una semana antes de la administración (condiciones ambientales: luz / oscuridad: 12h / 12h, temperatura 22 ± de 2 ° C, humedad 50 ± 10%).
- Utilice un fresco 10 mL de suspensiones de PA/NPSi (Nanosílice Ø:20 ± 5 nm por la polimerización de la emulsión en situ) diluido en solución salina normal en concentraciones de 3.125, 6.25 y 12.5 mg/mL, respectivamente10. Antes de la administración, someter a ultrasonidos las suspensiones para 20-30 min y agitar durante 10 minutos con el fin de prevenir la agregación de las nanopartículas.
- Igualmente se dividen un total de 20 ratas en cuatro grupos: un grupo para cada concentración de PA/NPSi (0, 3.125, 6.25 y 12.5 mg/mL).
- Para anestesiarlos, coloca las ratas en un envase cerrado con 1,5 mL de éter (99.5%) o cualquier otros protocolos IACUC aprobado. Después de 60-90 s de anestesia, Compruebe la falta de respuesta al pedal del reflejo. Asegúrese de que las ratas están respirando.
- Poner la rata anestesia en el tablero y fijar sus dientes delanteros con una línea esterilizada de nylon en el tablero también.
- Abrir la boca y exponer su fisura de glotis con la ayuda de una pinza quirúrgica y lente frontal.
- Inculcar las ratas con 0.5 mL de suspensión de PA/NPSi en pulmón de la rata para un total de 1 mL utilizando un tubo fino con una aguja embotada esterilizada en el bronquio bilateral.
- Coloca las ratas en un tablero de plástico en una posición supina y deje que las ratas recuperarán lentamente en 5-10 minutos.
2. ecografía para derrame pleural
- Utilizar un sistema de ultrasonido con un transductor de matriz lineal (frecuencia: 8 MHz) para examinar las ratas en días 1, 3, 7 y 1410.
- Anestesia (hidrato de cloral 10%, 0,35 mL/100 g, i.p.) a las ratas y Compruebe la ausencia de los reflejos pedal.
- Quitar el pelo de pecho y parte superior del abdomen las ratas usando una máquina de afeitar eléctrica. Luego coloque la rata en una placa de montaje en una posición supina.
- Cubrir la piel con el gel cubierto y luego coloque el transductor en el espacio intercostal y subcostal zona para detectar el líquido pleural.
Nota: Para detectar con precisión la efusión, la izquierda y las posiciones laterales derecha fueron seleccionadas para llevar a cabo un examen por ultrasonido. - Colocar la rata en un tablero de plástico en una posición supina después de la examinación del ultrasonido y dejar que las ratas recuperarán lentamente en 10 minutos.
3. pecho exploración del CT para derrame pleural
- En post-administración días 7 y 14, anestesiar las ratas con hidrato de cloral 10% (i.p). Parece suficiente profundidad de la anestesia cuando la rata no reacciona a los reflejos del pedal.
Nota: Después de la administración día 7 es el momento más adecuado para observar derrame pleural mediante la exploración de CT. - Colocar la rata en una lámina de plástico en una posición propensa y luego analizar su pecho para investigar derrame pleural con un canal de 64 CT. Use la siguiente configuración: configuración del detector de 64 x 0,625 mm, 120 kV (pico) y mAs de 350.
4. colección de aislamiento de las nanopartículas en el derrame pleural y derrame pleural
- Después pecho CT exploración de ratas y bajo anestesia de hidrato de cloral, compruebe el reflejo pedal de las ratas, afeitar el pelo del abdomen al pecho y luego desinfectar la piel por el yodo.
- Traer las ratas a la zona quirúrgica.
- Bajo anestesia, corte rápidamente 1-1.5 cm de la piel y los músculos abdominales a la xifoides a lo largo de la línea media con el diafragma intacto.
- Con cuidado abre el cofre e inspeccionar cavidades pleurales bilaterales con la ayuda de pinzas, especialmente los ángulos frénicos costales bilaterales. Recoger 1-2 mL de la efusión pleural de amarillo claro con una jeringa estéril de 2 mL.
- Una vez hecho esto, sacrificar a las ratas con el protocolo aprobado del IACUC.
- Centrifugue la efusión pleural en un tubo de 2 mL durante 15 min a 300 x g para aislar las nanopartículas.
- Utilice una gota de la capa superior que es el líquido brillante y observar bajo una microscope(TEM,) electrónica de transmisión a un voltaje de aceleración de 60-80 kV.
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Representative Results
No usando una ecografía torácica, encontramos efusiones pleurales el día 1 en todos los grupos. Sin embargo, el día 3, la efusión pleural apareció en los grupos de 6,25 y 12,5 mg/kg∙mL. El derrame fue principalmente en el ángulo frénico derecho costal, mientras que el derrame pericárdico presentado sólo 12,5 mg/kg∙mL grupo. Además, en el día 7, efusión pleural (Video 1) y derrame pericárdico (Video 2) detectaron en 6,25 mg/kg∙mL grupo (figura 1). Efusión pleural aumentó lentamente en la mayor medida en los días 7-10 y luego disminuyó gradualmente. El día 14, derrame pleural no fue encontrado ya pero con el signo de la adherencia de la pleura en todos los grupos. 10
A los 7 y 14 días, no había muestras de la efusión pleural en 6.25 y 3.125 mg/kg∙mL grupos10. Sin embargo, en el grupo de 12,5 mg/kg∙mL, la exploración de CT de tórax fue anormal con el ángulo costofrénico posterior Romo, que insinuó una pequeña cantidad de derrame pleural(Figura 2a, b). No hay signos del nivel de líquido se observaron, que fue explicada por una cantidad insuficiente de agua.
En la disección de ratas, observamos efusiones incoloras o color ámbar en los 6,25 mg/kg∙mL y grupos de 12,5 mg/kg∙mL en los días 3 y 7. Los volúmenes del derrame pleural varían de 1-1.8 mL en cada cavidad pleural en el mg/kg∙mL 6,25 y 12,5 mg/kg∙mL grupos. En el grupo de 3,125 mg/kg∙mL, ningún líquido en las cavidades pleurales aparecieron en el proceso completo experimental.
Con el TEM, NPSi nanopartículas presentadas individualmente los grupos forman en el líquido pleural drenado. El diámetro promedio (Ø: 20 ± 5 nm) y la morfología en el líquido pleural eran constantes con el NPSi en la suspensión preparada. Las nanopartículas fueron en su mayoría esféricos y bien disperso, y el tamaño promedio de una nanopartícula individual fue 20 ± 5 nm (figura 3a, b).
Figura 1 : Imágenes representativas de un derrame pleural por resultados sonográficos en el día 7. (a, b) Imágenes sonográficas de una rata en el grupo de 3,125 mg/kg∙mL con ningún líquido en las cavidades pleurales y pericárdicas. (c, d) Imágenes sonográficas de una rata en el grupo de 6,25 mg/kg∙mL con aparente derrame pleural y derrame pericárdico. (e, f) Imágenes sonográficas de una rata en el grupo de 12,5 mg/kg∙mL con mucho más fluido en las cavidades pleurales y pericárdicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Imágenes representativas de las imágenes de TAC torácicas en ratas. CT de la imagen de una rata en el grupo 3,125 mg/kg∙mL no derrame pleural (un) y TC imagen de una rata en el grupo de mg/kg∙mL 12.5 con un hallazgo negativo de líquido libre, pero el ángulo costofrénico posterior Romo en la cavidad pleural (b). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Nanopartículas de sílice en suspensión de Nanosílice/poliacrilato y la efusión pleural de una rata. (un) nanopartículas de sílice en nanocompuestos de poliacrilato/sílice. (b) nanopartículas de sílice en la efusión pleural de una rata grupos o de forma individual. Barra de escala: 200 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video de 1. La efusión pleural en una rata en el grupo de 6,25 mg/kg∙mL. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Video 2. El derrame pericárdico en la rata en el grupo de 6,25 mg/kg∙mL. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
La sonografía es la herramienta más conveniente para la determinación de enfermedades pulmonares, debido a su excelente sensibilidad a líquido libre en la cavidad pleural11. Es que la sonografía puede detectar inmediatamente el contraste de impedancia acústica del aire y de líquidos en el pulmón12. Además, la sonografía es más flexible en el modelo de un pequeño animal que CT. Sin embargo, el aire en el pulmón refleja la onda de sonido e impedido de observar los cambios intrapulmonares después de la instilación de nanopartículas. Por lo tanto, combinamos la exploración del CT del pecho y pulmón sonografía para investigar los cambios intrapulmonares y el líquido pleural.
Después de explorar los datos de imágenes, encontramos los resultados de la proyección de imagen notable. En primer lugar, nuestro modelo demuestra que el PA/NPSi, hecho inducida por la toxicidad inusual, que se manifestó como el pleural y derrame pericárdico en la fase temprana en el modelo de rata. En segundo lugar, este modelo reproduce con éxito la aparición y el desarrollo de los derrames de polyserous humana; mientras tanto, estos procesos fueron observados en nuestros pacientes, que presentaron con efusión pleural y pericárdica, fibrosis pulmonar y granuloma8,9. Por lo tanto, estos hechos implica que la membrana serosa como la membrana pleural o la membrana pericárdica fue uno de los objetivos de la lesión de PA/NPSi, similar en naturaleza a los causados por el asbesto. Además, la línea de tiempo de los derrames de polyserous fue significativo celebrado por nuestros resultados.
En cuanto al diseño de nuestro modelo, la instilación intratraqueal era el paso crítico. Este método garantiza que la toxicidad de nanopartículas entró en el cuerpo a través de la tráquea, que era diferente de la anterior de estudio13. Sin embargo, las desventajas de este método fueron las siguientes: el PA/NPSi fue inculcada en bronquio bilateral por el tubo fino, que requiere habilidades altamente experimentales para evitar el daño mecánico a la tráquea y la tos causada por la irritación. Así, el punto crítico era la profundidad apropiada de instilación intratraqueal. Mientras tanto, mantener adecuada anestesia fue fundamental para completar el paso anterior.
El uso de nanopartículas, las partículas finas para los propósitos de la investigación están recogiendo más y más atención. Cuanto menor sea el diámetro de las partículas finas, más difícil es para protegerlos. Por otra parte, el nano sílice con un diámetro de 20 ± 5 nm de hecho requiere un método de alta tecnología preparación para preparar este estudio, causada un aumento en la dificultad con la disminución de diámetro. Así, uno de los profesionales de nuestra técnica fue diámetro de nano-sílice, que era más pequeño que el anterior estudio13,14. Otra ventaja de este estudio fue que nos induce la nanopartícula vía traqueal en vez de piel o circulación13,15,16. Por ejemplo, la exposición intravenosa nos obstaculizada en la investigación sobre el órgano Diana, que era difícil de distinguir la lesión del órgano target por el daño primario o secundario. Por lo tanto, en nuestra opinión, la instilación intratraqueal será la mejor manera de investigar la toxicidad de nanopartículas de los pulmones en el futuro próximo. Además, la dosificación de nanopartículas fue menor que el anterior estudio13, que presenta una mayor relación costo-efectividad.
En cuanto a la pleural y la efusión pericardial inducida por PA/NPSi, la reacción de la inflamación y producción de sistema de oxígeno reactivo (ROS) sería la causa de. Nos explicó como sigue: en primer lugar, la Nanosílice aumenta las concentraciones de ROS, inducida por la producción inflamatoria, causa despolarización mitocondrial y reduce los niveles de glutatión tanto in vivo como in vitro5,6. En segundo lugar, la inflamación y la producción de ROS aumentan el líquido intersticial en el pulmón o la permeabilidad de los capilares pleurales, que promovió la formación de derrame pleural en el final. Además, el potencial deterioro del drenaje linfático pleural también podría estar involucrado en la acumulación de líquido pleural. Con más acumulación de líquido pleural, había aumentado la presión oncótica, que finalmente inducida por la deposición de PA/NPSi en cavidades pleurales. Este resultado es coherente con nuestras anteriores experiencias con animales y había reportado pacientes8,10.
De la efusión pleural sí mismo, era frecuente en la clínica. Sin embargo, muchas enfermedades respiratorias o sistémicas pueden causar derrame pleural. Por lo tanto, construir un modelo animal se beneficiaría el estudio etiológico de derrame pleural. El estudio previo reportó la toxicidad pulmonar de la Nanosílice13,17. Sin embargo, los modelos anteriores de la efusión pleural reportado se centraron principalmente en los factores biológicos en lugar de nanopartículas18,19. Por lo tanto, la dosificación de nanopartículas seguía siendo un tema abierto. Nuestro modelo demuestra que la efusión pleural se produjo el día 3 después de una concentración de PA/NPSi de 6,25 mg/kg∙mL se administra por instilación intratraqueal y alcanzó su punto máximo en los días 7-10. Además, con el aumento de las concentraciones de PA/NPSi, la efusión pleural producida más y más rápida. Por otra parte, en comparación con modelos biológicos18,19, nuestro modelo de derrame pleural fue bien controlable y efectiva. En definitiva, nuestro modelo sería beneficioso para los futuros estudios de enfermedades de la efusión pleural, así como para el estudio adicional de nanotoxicity en particular.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El presente estudio y la producción de este artículo fueron financiadas por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Grant 81773373, 81172614 y 81441089 de Grant). Agradecemos al Dr. Jin Yan y Dr. Pan Yujie, del Departamento de emergencia, Hospital de Chaoyang de Beijing y el Dr. Qu Peng del Departamento de ultrasonido medicina, Hospital de Chaoyang de Beijing para ayudar con la producción de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acuson S2000 Color Doppler ultrasound system | Siemens Medical Solutions, Mountain View ,CA | ||
| Polyacrylate/nanosilica | Fudan University,Shanghai, China | made by order with nanosilica(20±5)nm | |
| 10% chloral hydrate | Beijing Chemical Works | 302-17-0 | |
| Light speed 16 spiral computed tomography | GE Healthcare, US | ||
| Specific pathogen-free Wistar | Animal Center of Lianhelihua (Beijing, China) | Wistar rats |
References
- Stathopoulos, G. T., et al. Nuclear factor-kappaB affects tumor progression in a mouse model of malignant pleural effusion. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (2), 142-150 (2006).
- Shen, J., et al. The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis. Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).
- Nel, A., Xia, T., Mädler, L., Li, N. Toxic potential of materials at the nanolevel. Science. 311 (5761), 622-627 (2006).
- Maynard, A. D., et al.
- Duan, J., et al. Toxic effects of silica nanoparticles on zebrafish embryos and larvae. PLoS One. 8 (9), 74606 (2013).
- Skuland, T., Ovrevik, J., Låg, M., Schwarze, P., Refsnes, M. Silica nanoparticles induce cytokine responses in lung epithelial cells through activation of a p38/TACE/TGF-α/EGFR-pathway and NF-κΒ signaling. Toxicology and Applied Pharmacology. 279 (1), 76-86 (2014).
- Oberdörster, G., Oberdörster, E., Oberdörster, J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 823-839 (2005).
- Song, Y., Li, X., Du, X. Exposure to nanoparticles is related to pleural effusion, pulmonary fibrosis and granuloma. European Respiratory Journal. 34 (3), 559-567 (2009).
- Song, Y., et al. Nanomaterials in humans: identification, characteristics, and potential damage. Toxicologic Pathology. 39 (5), 841-849 (2011).
- Zhu, X., et al. Polyacrylate/nanosilica causes pleural and pericardial effusion, and pulmonary fibrosis and granuloma in rats similar to those observed in exposed workers. International Journal of Nanomedicine. 11, 1593-1605 (2016).
- Havelock, T., et al. Pleural procedures and thoracic ultrasound: British Thoracic Society Pleural Disease Guideline 2010. Thorax. 65, Suppl 2 61-76 (2010).
- Jha, A., Ullah, E., Gupta, P., Gupta, G., Saud, M. Sonography of multifocal hydatidosis involving lung and liver in a female child. Journal of Medical Ultrasound. 40 (4), 471-474 (2013).
- Hikaru, N., et al. Histological analysis of 70-nm silica particles-induced chronic toxicity in rats. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 626-629 (2009).
- Sun, L., et al. Cytotoxicity and mitochondrial damage caused by silica nanoparticles. Toxicology in Vitro. 25, 1619-1629 (2011).
- Hikaru, N., et al.
- Liu, T. I., et al. Single and repeated dose toxicity of mesoporous hollow silica nanoparticles in intravenously exposed mice. Biomaterials. 32, 1657-1668 (2011).
- Ding, M., et al. Diseases caused by silica: Mechanisms of injury and disease development. International Immunopharmacology. 2, 173-182 (2002).
- Shen, J., et al. The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis. Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).
- Ji, J. H., et al. Twenty-eight-day inhalation toxicity study of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats. Inhalation Toxicology. 19 (10), 857-871 (2007).
