Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att konstruera en pleurautgjutning modell hos råttor vid intratrakeal instillation av polyakrylat/nanosilica.
Abstract
Pleurautgjutning är ett utbrett kliniska på många lungsjukdomar. Att ha en användbar djur pleurautgjutning modell är mycket viktigt att studera dessa lungsjukdomar. Tidigare pleurautgjutning modeller betalade mer uppmärksamhet till biologiska faktorer i stället för nanopartiklar i miljön. Här, införa vi en modell för att göra pleuravätska hos råttor vid intratrakeal instillation av polyakrylat/nanosilica, och en metod för nanopartiklar isolering i pleurautgjutning. Vid intratrakeal instillation av polyakrylat/nanosilica med koncentrationer av 3.125, 6,25 och 12,5 mg/kg∙mL, pleurautgjutning råttor fram dag 3, nådde på 6,25 och 12,5 mg/kg∙mL grupper, 7-10 dagar sedan sakta minskade och försvann på dag 14. När koncentrationen av polyakrylat/nanosilica ökade, är pleurautgjutning producerade mer och snabbare. Denna pleura vätska upptäcktes av ultraljudsundersökning eller CT bröstkorg skanning och bekräftas av dissekering av råttor. Kiseldioxid nanopartiklar observerades i råttornas pleurautgjutning av transmissionselektronmikroskop. Dessa resultat visade att exponering för polyakrylat/nanosilica leder till induktion av pleuravätska, som överensstämde med vår tidigare rapport hos människor. Dessutom, är denna modell fördelaktigt för ytterligare studier av nanotoxikologi och pleurautgjutning sjukdomar.
Introduction
Pleurautgjutning är en mycket vanlig klinisk manifestation av lungsjukdomar med en mängd olika orsaker. Att ha en användbar djur pleurautgjutning modell är mycket viktigt att studera dessa lungsjukdomar, rollerna för de två pleura membran-lagrarna, pleurautgjutning mekanismer och dess behandling. Vissa rapporterade dock pleurautgjutning modeller främst fokusera på de maligna pleurautgjutning eller biologiska faktorer i stället för nanopartiklarna i miljö1,2. Här introducerar vi en ny modell av pleuravätska som är enkel, säker och effektiv.
Med utvecklingen av nanoteknik och omfattande användning av nanoprodukterna finns det en oro över de potentiella riskerna av nanomaterial för miljön och människors hälsa3,4. Nanomaterial införa riskfaktorer och leda potentiellt till nya risker på arbetsplatsen eller genom förorening av miljön. In vitro och in vivo studier visar att nanomaterial kan resultera i skador på flera organ till lungorna, hjärtat, levern, njurarna, nervsystemet, samt och reproduktiv hälsa och immunförsvars5,6. Dessutom, rapporterade vissa studier att den specifika toxiciteten av nanomaterial var på grund av deras unika fysikalisk-kemiska egenskaper3,4,7.
Vi har rapporterat att en grupp av arbetstagare med exponering för nanomaterial kliniskt presenteras med pleurautgjutning och perikardiell utgjutning, lungfibros och granulom8,9. Kiseldioxid nanopartiklar isolerades i dessa patienters pleurautgjutning9. För att återskapa och verifierar den pleurautgjutning orsakas av den inhalerade nanopartiklar i mänskliga, utfört vi experimentet genom att ingjuta den polyakrylat/nanosilica (PA/NPSi) via luftvägarna hos råttor, som härmade människors andning i en verklig miljö, och fann att intratrakeal instillation av PA/NPSi kan resultera i pleuravätska hos råttor. Här introducerar vi hur man gör pleuravätska hos råttor vid intratrakeal instillation av PA/NPSi, och hur man isolera nanopartiklar i pleurautgjutning. Denna modell kan vara användbar för ytterligare studier av nanotoxikologi och pleurautgjutning sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien följde riktlinjerna kapital Medical University (Beijing, PR China) för skötsel och användning av försöksdjur. Alla förfaranden godkändes av djur etiska kommittén för kapital medicinska universitet i Kina.
1. experimentella preparat
Obs: Acklimatiserar sig de kvinnliga specifikt patogenfria Wistar råttorna (vikt: 200 ± 10 g) till den experimentella miljön för en vecka före administrering (miljöförhållanden: ljus / mörker: 12h / 12h, temperatur 22 ± 2 ° C, luftfuktighet 50 ± 10%).
- Använda en färsk 10 mL av PA/NPSi suspensioner (nanosilica Ø:20 ± 5 nm av jordbaserad emulsionspolymerisation) utspätt i fysiologisk koksaltlösning vid koncentrationer av 3.125, 6,25 och 12,5 mg/mL, respektive10. Före administrering, Sonikera upphängningarna för 20-30 min och virvel för 10 min för att förhindra nanopartiklar aggregering.
- Lika dela totalt 20 råttor i fyra grupper: en grupp för varje koncentration av PA/NPSi (0, 3.125, 6,25 och 12,5 mg/mL).
- För att söva dem, placera råttorna i en sluten behållare med 1,5 mL eter (99,5%) eller några andra IACUC godkända protokoll. Efter 60-90 s av anestesi, kontrollera om bristen på svar att trampa reflex. Säkerställa att råttorna andas.
- Sätta den sövda råttan på brädan och fixa sina framtänder med en steriliserad linje av nylon på styrelsen för.
- Öppna sin mun och exponera dess spricka av glottisen med hjälp av en kirurgisk pincett och frontal lins.
- Ingjuta råttorna med 0,5 mL PA/NPSi suspension till varje råttans lunga för sammanlagt 1 mL med en fin tub med en steriliserad trubbig nål till den bilaterala luftrör.
- Placera råttorna en plast styrelsen i en liggande ställning och låt råttorna återhämta sig sakta i 5-10 min.
2. ultraljudsundersökning för pleurautgjutning
- Använda ett ultraljud system med en linjär array givare (frekvens: 8 MHz) att undersöka råttor på dag 1, 3, 7 och 1410.
- Ge anestesi (10% chloral hydrat, 0,35 mL/100 g, i.p.) till råttor och kontrollera om bristen på pedal reflexer.
- Ta bort håret från råttornas bröstet och övre buken med en rakapparat. Placera sedan råtta på en monteringsplattan i ryggläge.
- Täcka huden med belagda gelen och placera givaren på interkostalrummet och subcostal område att upptäcka pleura vätska.
Obs: För att upptäcka utgjutning korrekt, vänster och höger laterala positioner valdes för att utföra en ultraljudsundersökning. - Pålagt en plast styrelse i ryggläge råtta efter ultraljudsundersökning och låt råttorna återhämta sig långsamt i 10 min.
3. bröstet CT scanning för pleurautgjutning
- På dag 7 och 14 efter administrering, söva råttorna med 10% chloral hydrat (IP). Anser det tillräckligt djup anestesi när råttan inte reagerar trampa reflexer.
Obs: Dag 7 efter administrering är den lämpligaste tidpunkten att iaktta pleuravätska genom datortomografi. - Placera råtta på en plastfolie i en liggande ställning och skanna sedan dess bröstkorg för att undersöka pleurautgjutning använder en 64-kanals CT. Use följande inställningar: 64 x 0,625 mm detektor konfiguration, 120 kV (topp) och 350 mAs.
4. insamling av pleurautgjutning och isolering av nanopartiklar i pleurautgjutning
- Efter bröstet CT skanning av råttor och under anestesi av chloral hydrat, kontrollera pedal reflexen Rats, raka håret från buken till bröstet och sedan desinficera huden av jod.
- Ge råttorna det kirurgiska området.
- Under anestesi, snabbt klipp 1-1,5 cm av hud och magmusklerna till xiphoid längs mittlinjen med intakt membranen.
- Försiktigt öppna kistan och inspektera bilaterala pleura hålrum med hjälp av pincett, särskilt de bilaterala costal phrenic vinklarna. Samla upp 1-2 mL av den ljusgul pleurautgjutning med en 2 mL steril spruta.
- En gång gjort, offra råttor med IACUC godkända protokoll.
- Centrifugera pleurautgjutning i en 2 mL tub för 15 min vid 300 x g för att isolera nanopartiklarna.
- Använd en droppe av det övre lagret som är ljusa vätskan och observera under en transmission electron microscope(TEM,) vid en accelererande spänning på 60-80 kV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med en bröstkorg ultraljud, hittade vi inga pleural utgjutningar på dag 1 i alla grupper. Men på dag 3 visades pleurautgjutning i grupperna 6,25 och 12,5 mg/kg∙mL. Utgjutning var just costal phrenic vinkeln, medan den perikardiell utgjutning bara presenteras i 12,5 mg/kg∙mL grupp. Dessutom på dag 7 upptäcktes både pleurautgjutning (Video 1) och perikardiell utgjutning (Video 2) i 6,25 mg/kg∙mL gruppen (figur 1). Pleurautgjutning ökade långsamt i största utsträckning på 7-10 dagar och minskade därefter gradvist. Dag 14 hittades inga pleurautgjutning längre men med tecken av adhesionen av lungsäcken i alla grupper. 10
Dag 7 och 14, det fanns inga tecken på pleurautgjutning i 3.125 och 6,25 mg/kg∙mL grupper10. Men i gruppen 12.5 mg/kg∙mL var bröstet CT skanning onormal med trubbiga bakre costophrenic vinkeln, som antydde en liten mängd pleurautgjutning (figur 2a, b). Inga tecken på vätskenivån observerades, som förklarades på grund av en otillräcklig mängd vatten.
Vid dissektion av råttor observerat vi bärnsten eller färglös utgjutningar i 6,25 mg/kg∙mL och 12,5 mg/kg∙mL grupper på dag 3 och 7. Volymerna av pleurautgjutning varierar från 1-1,8 mL i varje pleural hålighet i 6,25 mg/kg∙mL och 12,5 mg/kg∙mL grupper. I gruppen av 3.125 mg/kg∙mL syntes ingen vätska i pleura hålrum i full experimentell process.
Med TEM bildade de NPSi nanopartiklar redovisas separat och kluster i den avrunna pleura vätskan. Den genomsnittliga diametern (Ø: 20 ± 5 nm) och morfologi i pleura vätska överensstämde med NPSi i den beredda suspensionen. Nanopartiklarna var mestadels sfäriska och väl spridda, och den genomsnittliga storleken på ett enskilt nanopartiklar var ~ 20 ± 5 nm (figur 3a, b).
Figur 1 : Representativa bilder av pleurautgjutning sonographic undersökningsresultaten på dag 7. (a, b) Sonographic bilder från en råtta i gruppen 3.125 mg/kg∙mL med ingen vätska i pleurautgjutning och perikardiell håligheter. (c, d) Sonographic bilder från en råtta i gruppen 6,25 mg/kg∙mL med uppenbara pleurautgjutning och perikardiell utgjutning. (e, f) Sonographic bilder från en råtta i gruppen 12.5 mg/kg∙mL med mycket mer vätska i pleurautgjutning och perikardiell håligheter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Representativa bilder av bröstkorg CT-bilder i råttor. CT-bild från en råtta i gruppen 3.125 mg/kg∙mL utan pleurautgjutning (en) och CT bild från en råtta i gruppen 12.5 mg/kg∙mL med en negativ slutsats av fri vätska men trubbiga bakre costophrenic vinkeln i pleural hålighet (b). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Kiseldioxid nanopartiklar i polyakrylat/nanosilica fjädring och pleurautgjutning på en råtta. (en) Silica nanopartiklar i polyakrylat/silica nano kompositfyllningar. (b) Silica nanopartiklar i en råttas pleurautgjutning med kluster eller enskilda form. Skalstapeln: 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Video 1. Pleurautgjutning i en råtta i gruppen 6,25 mg/kg∙mL. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Video 2. Den perikardiell utgjutning i råtta i gruppen 6,25 mg/kg∙mL. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ultraljud är det mest praktiska verktyget för att bestämma lungsjukdomar, på grund av dess utmärkta känslighet för den fri vätskan i Plura11. Det beror på att ultraljud kan omedelbart upptäcka kontrasten i akustiska impedansen av luft och vätska i lungan12. Dessutom är ultraljud mer flexibla i en liten djurets modell än CT. Dock luften i lungorna reflekteras ljudet våg och hindras från att observera intrapulmonell ändringarna efter nanopartiklar instillation. Därför kombinerade vi bröstet datortomografi och lung sonography att undersöka intrapulmonell ändringarna och pleura vätska.
Efter att ha utforskat imaging data, hittade vi imaging resultaten anmärkningsvärda. För det första, vår modell visat att den PA/NPSi, verkligen inducerad ovanliga toxicitet, vilket manifesterades den pleural och den perikardiell utgjutning i tidigt skede i råtta modellen. För det andra, denna modell framgångsrikt reproduceras förekomsten och utvecklingen av mänskliga polyserous utgjutningar; under tiden hos dessa processer våra patienter, som presenteras med pleurautgjutning och perikardiell utgjutning, lungfibros och granulom8,9. Dessa fakta innebar således att serösa membranet såsom pleura membran eller perikardiell membranet var en av de skada målen i PA/NPSi, som var liknande art som den som orsakas av asbest. Tidslinjen av polyserous utgjutningar var också meningsfull som ingåtts av våra fynd.
När det gäller utformningen av vår modell var den intratrakeal instillationen den kritiska steget. Denna metod säkerställs att toxiciteten av nanopartiklar kommit in i kroppen genom de luftrör, som skilde sig från den tidigare studie13. Nackdelarna med denna metod var dock följande: den PA/NPSi var ingjutit i bilaterala luftrör av fina röret, som krävde mycket experimentella färdigheter att förhindra den mekaniska skadan på luftstrupen och hostan orsakas på grund av dess irritation. Den kritiska punkten var således korrekt skärpedjup intratrakeal instillation. Samtidigt upprätthålla korrekt anestesi var kritisk till att slutföra de ovannämnda steget.
Användning av nanopartiklar, de fina partiklarna i forskningssyfte plockar upp mer och mer uppmärksamhet. Ju mindre diameter av fina partiklar, ju svårare det är att skydda dem. Däremot, krävs den nano-kisel med en diameter på 20 ± 5 nm faktiskt en högteknologisk förberedelse metod att förbereda för denna studie, orsakade en ökning i svårigheter med minskningen i diameter. Således, en av proffsen på vår teknik diametern på nano-kisel, vilket var mindre än den föregående studie13,14. En annan fördel med denna studie var att vi inducerad av nanopartiklar via luftrör snarare hud eller cirkulation13,15,16. Till exempel hindrat intravenös exponeringen oss utreda målorganet, som var svår att skilja skadan av målorganet utlöses av primär eller sekundär skada. Därför enligt vår mening skall den intratrakeal instillationen vara det bästa sättet att undersöka lungorna nanopartiklar toxicitet i den närmaste framtiden. Förutom, doseringen av nanopartiklar var lägre än den tidigare studie13, som presenterade en högre kostnadseffektivitet.
Vad beträffar den pleural och den perikardiell utgjutning som induceras av PA/NPSi, skulle de Inflammationreaktion och produktion av reaktivt syre system (ROS) vara orsaken till att. Vi förklarade det som följer: för det första, nanosilica ökade koncentrationen av ROS, inducerad inflammatoriska produktion, orsakade mitokondriell depolarisation och reducerad glutation nivåerna både in vivo och in vitro-5,6. För det andra, inflammation och produktion av ROS ökade interstitiell vätska i lungan eller permeabilitet i pleura kapillärerna, som främjade bildandet av pleuravätska i slutet. Dessutom kan potentiella nedskrivning av pleura lymfdränage också vara inblandade i ansamling av pleura vätska. Med mer ackumulering av pleura vätska ökat Kolloidosmotiskt tryck, som slutligen orsakade nedfall av PA/NPSi i pleura hålrum. Detta resultat var förenligt med våra tidigare djurförsök och rapporterade patienter8,10.
För pleurautgjutning själv var det utbredd i kliniken. Dock kan många luftvägs- eller systemiska sjukdomar orsaka pleurautgjutning. Därför skulle att bygga en djurmodell gynna etiologisk studiet av pleurautgjutning. Den föregående studien rapporterade lung toxiciteten av nanosilica13,17. Men tidigare rapporterade pleurautgjutning modeller främst inriktad på biologiska faktorer snarare än nanopartiklar18,19. Doseringen av nanopartiklar förblev därför, en öppen fråga. Vår modell visat att pleurautgjutning inträffade på dag 3 efter en PA/NPSi koncentration av 6,25 mg/kg∙mL var administreras vid intratrakeal instillation och nådde den 7-10 dagar. Dessutom med ökande koncentrationer av PA/NPSi, pleurautgjutning producerade mer och snabbare. Dessutom var jämfört med biologiska modeller18,19, vår modell av pleurautgjutning väl-kontrollerbar och effektiv. Sammanfattningsvis, skulle vår modell vara fördelaktigt för framtida studier av pleurautgjutning sjukdomar, såväl som för ytterligare studier av nanotoxicitet särskilt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Den aktuella studien och produktion till denna artikel har finansierats genom den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (Grant 81773373, 81172614 och Grant 81441089). Vi tackar Dr. Jin Yan och Dr Pan Yujie, av avdelningen för akut, Beijing Chaoyang sjukhus, och Dr Qu Peng av Institutionen för ultraljud medicin, Beijing Chaoyang sjukhus för att hjälpa med video produktionen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acuson S2000 Color Doppler ultrasound system | Siemens Medical Solutions, Mountain View ,CA | ||
| Polyacrylate/nanosilica | Fudan University,Shanghai, China | made by order with nanosilica(20±5)nm | |
| 10% chloral hydrate | Beijing Chemical Works | 302-17-0 | |
| Light speed 16 spiral computed tomography | GE Healthcare, US | ||
| Specific pathogen-free Wistar | Animal Center of Lianhelihua (Beijing, China) | Wistar rats |
References
- Stathopoulos, G. T., et al. Nuclear factor-kappaB affects tumor progression in a mouse model of malignant pleural effusion. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (2), 142-150 (2006).
- Shen, J., et al. The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis. Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).
- Nel, A., Xia, T., Mädler, L., Li, N. Toxic potential of materials at the nanolevel. Science. 311 (5761), 622-627 (2006).
- Maynard, A. D., et al.
- Duan, J., et al. Toxic effects of silica nanoparticles on zebrafish embryos and larvae. PLoS One. 8 (9), 74606 (2013).
- Skuland, T., Ovrevik, J., Låg, M., Schwarze, P., Refsnes, M. Silica nanoparticles induce cytokine responses in lung epithelial cells through activation of a p38/TACE/TGF-α/EGFR-pathway and NF-κΒ signaling. Toxicology and Applied Pharmacology. 279 (1), 76-86 (2014).
- Oberdörster, G., Oberdörster, E., Oberdörster, J. Nanotoxicology: an emerging discipline evolving from studies of ultrafine particles. Environmental Health Perspectives. 113 (7), 823-839 (2005).
- Song, Y., Li, X., Du, X. Exposure to nanoparticles is related to pleural effusion, pulmonary fibrosis and granuloma. European Respiratory Journal. 34 (3), 559-567 (2009).
- Song, Y., et al. Nanomaterials in humans: identification, characteristics, and potential damage. Toxicologic Pathology. 39 (5), 841-849 (2011).
- Zhu, X., et al. Polyacrylate/nanosilica causes pleural and pericardial effusion, and pulmonary fibrosis and granuloma in rats similar to those observed in exposed workers. International Journal of Nanomedicine. 11, 1593-1605 (2016).
- Havelock, T., et al. Pleural procedures and thoracic ultrasound: British Thoracic Society Pleural Disease Guideline 2010. Thorax. 65, Suppl 2 61-76 (2010).
- Jha, A., Ullah, E., Gupta, P., Gupta, G., Saud, M. Sonography of multifocal hydatidosis involving lung and liver in a female child. Journal of Medical Ultrasound. 40 (4), 471-474 (2013).
- Hikaru, N., et al. Histological analysis of 70-nm silica particles-induced chronic toxicity in rats. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72, 626-629 (2009).
- Sun, L., et al. Cytotoxicity and mitochondrial damage caused by silica nanoparticles. Toxicology in Vitro. 25, 1619-1629 (2011).
- Hikaru, N., et al.
- Liu, T. I., et al. Single and repeated dose toxicity of mesoporous hollow silica nanoparticles in intravenously exposed mice. Biomaterials. 32, 1657-1668 (2011).
- Ding, M., et al. Diseases caused by silica: Mechanisms of injury and disease development. International Immunopharmacology. 2, 173-182 (2002).
- Shen, J., et al. The dosage-toxicity-efficacy relationship of kansui and licorice in malignant pleural effusion rats based on factor analysis. Journal of Ethnopharmacology. 186, 251-256 (2016).
- Ji, J. H., et al. Twenty-eight-day inhalation toxicity study of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats. Inhalation Toxicology. 19 (10), 857-871 (2007).
