Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

בקנה מידה גדול פרוטאומיקס מלמעלה למטה באמצעות ספקטרומטר מסה של טנדם אלקטרופורזה של אזור נים

Published: October 24, 2018 doi: 10.3791/58644
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2,3, 1
1Department of Chemistry, Michigan State University, 2Department of BioHealth Informatics, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 3Center for Computational Biology and Bioinformatics, Indiana University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול מפורט מתואר את ההפרדה, זיהוי של אפיון proteoforms דגימות חלבון באמצעות נימי אזור אלקטרופורזה-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (CZE-ESI-MS/MS). הפרוטוקול יכול לשמש עבור אפיון ברזולוציה גבוהה proteoforms דגימות חלבון וזיהוי בקנה מידה גדול של proteoforms בדגימות פרוטאום מורכבים.

Abstract

אזור נימי אלקטרופורזה-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (CZE-ESI-MS/MS) הוכרה ככלי שימושי פרוטאומיקס מלמעלה שמטרתו לאפיין proteoforms ב proteomes מורכבים. עם זאת, היישום של CZE-MS/MS עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול לו היה מובן את קיבולת טעינה הדגימה נמוך וצר ההפרדה, חלון CZE. כאן, פרוטוקול מתואר באמצעות CZE-MS/MS עם נפח העמסה מדגם בקנה מידה microliter וחלון הפרדה 90-מין עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול. פלטפורמת CZE-MS/MS מתבסס על לינאריות לזיהוי (LPA)-נימי בתזרים electroosmotic נמוך ביותר, שיטה ריכוז מדגם דינאמיים המבוססות על pH-צומת באינטרנט עם יעילות גבוהה של חלבון בערימה, מצופה ההפרדה ממשק זרימה CE-MS נדן שאוב אלקטרו-kinetically עם רגישות גבוהה מאוד, ספקטרומטר מסה של מלכודת יונים עם גבוה המונית, רזולוציה, מהירות הסריקה. פלטפורמת יכול לשמש האפיון ברזולוציה גבוהה של חלבון שלם פשוט דוגמאות ואפיון בקנה מידה גדול של proteoforms ב proteomes מורכבים שונים. כדוגמה, הוא הפגין הפרדה יעילה במיוחד של תערובת חלבונים רגיל, של זיהוי רגישה מאוד זיהומים רבים באמצעות הפלטפורמה. כדוגמה נוספת, פלטפורמה זו יכול לייצר מעל 500 proteoform ולהפעיל ההזדהויות חלבון 190 מ פרוטאום Escherichia coli ב יחיד CZE-MS/MS.

Introduction

פרוטאומיקס מלמעלה למטה (TDP) שואפת אפיון proteoforms בתוך פרוטאום בקנה מידה גדול. TDP מסתמך על ההפרדה שלב נוזלי יעיל של חלבונים שלמים לפני ניתוח יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (ESI-MS/MS) ספקטרומטריית electrospray בשל המורכבות גבוהה של טווח דינמי ריכוז גדול של פרוטאום1,2 ,3,4,5. אזור נימי אלקטרופורזה (CZE) היא טכניקה חזקה עבור הפרדת מולקולות המבוססת על יחסי גודל לתשלום שלהם6. CZE היא יחסית פשוטה, הדורשים בלבד פתוח צינורי התמזגו סיליקה נימי, על רקע אלקטרוליט (BGE), ספק כוח. מדגם של חלבונים שלמים ניתן לטעון לתוך נימי באמצעות לחץ או מתח, ההפרדה הוא שיזם הטבעית בשני קצוות נימי ב BGE ויישום של מתח גבוה. CZE יכולים לגשת יעילות הפרדה גבוהה במיוחד (> לוחות תיאורטי מיליון) דוגל בהפרדה בין מולקולות7. CZE-MS יש רגישות גבוהה יותר באופן משמעותי מאשר בשימוש נרחב כרומטוגרפיה נוזלית הפוך-פאזי (RPLC)-MS לניתוח של חלבונים שלמים8. למרות CZE-MS יש פוטנציאל גדול עבור בקנה מידה גדול מלמעלה פרוטאומיקס, היישום שלה רחב ב פרוטאומיקס יש כבר מובן מספר בעיות, כולל מדגם נמוך-העמסה חלון צר ההפרדה. המדגם טיפוסי טעינת אמצעי אחסון ב- CZE הוא כ 1% מהנפח נימי הכולל, המתאים לרוב פחות מ- 100 nL9,10,11. החלון ההפרדה של CZE הוא בדרך כלל פחות מ 30 דקות בשל9,זרימה (EOF)10electroosmotic חזק. בעיות אלה מגבילות CZE-MS/MS לצורך זיהוי מספר רב של proteoforms ו- proteoforms שופע נמוך מ פרוטאום מורכבים.

הרבה מאמץ כדי לשפר את הדגימה טעינת אמצעי אחסון מהשיטות CZE באמצעות דגימת מקוון ריכוז (למשל, מוצק-שלב microextraction [SPME]12,13, דגימה משופרת שדה הערימה [פס]9 , 11 , 14, ו pH דינמי צומת15,16,17,18). פס ו pH דינמי צומת הם פשוט יותר מאשר SPME, רק לדרוש הבדל משמעותי בין המאגר מדגם BGE את מוליכות, pH. פס מעסיקה מאגר מדגם עם הרבה מוליכות נמוכה יותר מאשר BGE, שמוביל הערמה של analytes על גבול בין אזור הדגימה את אזור BGE נימי. צומת ה-pH דינמי מנצל פקק מדגם בסיסיים (למשל, 50 מ מ אמוניום ביקרבונט, pH 8), של BGE חומצי (למשל, חומצה אצטית 5% [וי/v], pH 2.4) משני הצדדים של התקע הדגימה. בעת יישום של מתח חיובי גבוה בסוף הזרקה נים, טיטור של התקע מדגם basic מתרחש, תוך התמקדות את analytes לתוך פקק חזק לפני שעברו פרידה CZE. לאחרונה, הקבוצה השמש באופן שיטתי לעומת פס ו- pH דינמי צומת על הערימה מקוון של חלבונים שלמים, הפגינו בצומת pH הדינמי הזה יכול להפיק ביצועים טובים הרבה יותר פס עבור ריכוז חלבונים שלמים באינטרנט כאשר האחסון הזרקה מדגם היה 25% הנפח נימי הכולל19.

יש כבר מועסקים ההפרדה נייטרליים מצופה נימים (למשל, לינאריות לזיהוי [LPA]) כדי להפחית EOF ב נימי, מאטים את ההפרדה CZE והרחבת ההפרדה חלון20,21. הקבוצה Dovichi פותח לאחרונה הליך פשוט להכנת ציפוי LPA יציב על הקיר הפנימי של נימים, ניצול קירור (APS) בתור יוזם ומפתח טמפרטורה (50 ° C) ייצור רדיקלים חופשיים, הפילמור22 . ממש לאחרונה, הקבוצה השמש מועסקים נימי ההפרדה מצופים LPA ושיטת צומת pH דינמי עבור CZE הפרדת חלבונים שלמים, להגיע מדגם בקנה מידה microliter טעינת החלון 90-מין הפרדה19ונפח. מערכת זו CZE פותח את הדלת בפני משתמש CZE-MS/MS פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול.

CZE-MS דורש ממשק רגיש ועמיד מאוד לזוג CZE ל MS. שלושה ממשקים CE-MS כבר מפותחת היטב ממוסחר בהיסטוריה של CE-MS, והם נדן-זרימה co-צירית ממשק23, הממשק sheathless באמצעות טיפ נקבובי כמו פולט ESI24, ו אלקטרו-kinetically נדן שאוב לזרום ממשק25,26. אלקטרו-kinetically שאוב נדן-ממשק-מבוססות זרימה CZE-MS/MS הגיעה למגבלה9זיהוי פפטיד zeptomole נמוך, ההזדהויות פפטיד מעל 10,000 (IDs) של הלה התא פרוטאום יחיד להפעיל14, אפיון מהר של חלבונים שלמים11ולאחר ניתוחים לשחזור ויציבה מאוד של מולקולות26. לאחרונה, את נימי ההפרדה מצופים LPA השיטה צומת pH דינמי, הממשק זרימה נדן אלקטרו-kinetically שאוב שימשו פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול של פרוטאום Escherichia coli (e. coli)19 ,27. פלטפורמת CZE-MS/MS התקרב יותר מ-500 חתימות proteoform יחיד להפעיל19 ו כמעט 6,000 proteoform מזהים באמצעות מצמד עם גודל-הדרה כרומטוגרפיה (שניות)-RPLC fractionation27. התוצאות מראות בבירור את היכולת של CZE-MS/MS עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול.

במסמך זה, מתואר הליך מפורט של שימוש CZE-MS/MS עבור פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול. מערכת CZE-MS/MS מעסיקה את נימי מצופים LPA להפחית EOF בנימי, שיטת צומת pH דינמי עבור ריכוז חלבונים, הממשק זרימה נדן אלקטרו-kinetically שאוב עבור צימוד CZE ל MS, orbitrap מקוון המוני ספקטרומטר עבור האוסף של MS ו- MS/MS ספקטרום של חלבונים ו תוכנת TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform זיהוי ואפיון) עבור מזהה proteoform באמצעות חיפוש במסד הנתונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת ציפוי LPA על הקיר הפנימי של נים ההפרדה

  1. רעלני של נימי
    1. ריקון של נימי fused סיליקה (120 ס מ אורך, 50 מיקרומטר בקוטר הפנימי [תעודת זהות], 360 מיקרומטר קוטרו החיצוני [יתר]) במרוכז עם 500 µL של 1 מ' נתרן הידרוקסידי, מים יונים, חומצה הידרוכלורית 1 מ', מים יונים ו LC-MS כיתה מתנול באמצעות מזרק משאבה.
    2. יבש את נימי עם גז חנקן (10 psi, ≥ 12 שעות) ולמלא את נימי עם 50% (v/v) 3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate ב מתנול באמצעות מזרק משאבה. חותם בשני קצוות נים עם גומי סיליקה, דגירה זה בטמפרטורת החדר במשך לפחות 24 שעות.
      הערה: במהלך שלב זה, הדופן הפנימית של נים זה functionalized עם C = ג ארוכים תוצאות הדגירה בציפוי קפילרי טוב יותר עקב תגובה מפורט יותר.
    3. לחתוך חלק קטן (~ 5 מ מ) של נימי משני הכיוונים עם אבן שהפריד. יש לשטוף את נימי עם מתנול (500 µL) באמצעות מזרק משאבה לנקות את ריאגנטים unreacted. יבש את נימי עם גז חנקן (10 psi, ≥12 h).
  2. הכנת הציפוי LPA
    הערה: הליך זה מבוסס על ג ' ו. et al. 22 עם שינויים מזעריים.
    1. להכין אקרילאמיד פתרון (40 מ"ג של אקרילאמיד ב 1 מ"ל של מים) והפתרון persulfate (APS) אמוניום (5% [w/v] במים).
    2. להוסיף 2-3 µL של הפתרון APS µL 500 של הפתרון אקרילאמיד, מערבולת, את התערובת, דגה זה עם גז חנקן עבור 5 דקות כדי להסיר את החמצן בפתרון.
    3. לטעון את התערובת לתוך נימי pretreated באמצעות ואקום, חותם בשני קצוות נים עם גומי סיליקה, דגירה אותו באמבט מים ב 50 מעלות צלזיוס למשך 40 דקות.
    4. הסר חלק קטן (~ 5 מ מ) של נים שני הקצוות עם אבן שהפריד. לדחוף את הפתרון unreacted החוצה נימי עם מים (200 µL), באמצעות המשאבה מזרק.
      הערה: ודא הפולימר דחפתי את נימי עקביות דמוי ג'ל agarose. שלב הדגירה ארוך יותר (עד ~ 45-50 דקות) יכול לגרום ציפוי קפילרי טוב יותר. עם תקופות ארוכות יותר של התגובה, נים עשויים להיחסם, בלחץ גבוה נדרש כדי לדחוף החוצה הפולימר עם מים. משאבת HPLC יכול לשמש למטרה זו.

2. תחריט של נימי עם חומצה הידרופלואורית

התראה: שימוש נהלי הבטיחות המתאים לטיפול פתרונות חומצה הידרופלואורית (HF). כל פעולות הקשורות ל- HF צריך להיעשות בשכונה כימי. לפני כל פעולה הקשורה HF, ודא כי 2.5% סידן gluconate ג'ל זמין לשימוש במקרה של חשיפה. כפפות כפול נדרשים, הכפפות nitrile טיפוסי בתוך, אטומה כבד של כפפות בחוץ. ללבוש חלוק מעבדה ומשקפת בטיחות כימית. לאחר הניתוחים HF, להפריד פסולת מסוכנת נוזלי ומוצק. הפסולת HF נוזלי חייב שבודד מיד עם גבוהה-ריכוז נתרן הידרוקסידי פתרון אחסון זמני לפני איסוף פסולת. פסולת מוצקה HF צריך להיות מאוחסנים באופן זמני במיכל פלסטיק היא רצופה שני עבה גלון אחד ולאטום שקיות פלסטיק, מכסה. גם את הפסולת הנוזלית חייבים להיות מסומנים כראוי.

  1. לצרוב על חלק נימי באמצעות להבה עדינה (למשלכיס קל יותר) כדי להסיר את פוליאימיד-הציפוי החיצוני (1 ס מ אורך) בסביבות 4 ס מ מן קצה אחד של נימי. לנקות בעדינות את החלק השרוף של נים שתמחקי כדי להסיר את פוליאימיד ציפוי לחלוטין.
    הערה: המשיכי בזהירות, כמו החלק של נים ללא הציפוי פוליאימיד יהיה קצת מעורערת.
  2. לקדוח חור קטן בקצה של צינור 200-µL סביב באותו גודל הקוטר החיצוני נימי להחזיק מספיק את נימי במקום, ברגע זה הוא השחיל דרך החור. שרשור סוף נימי שקרוב החלק השרוף דרך החור עד החלק השרוף בצינור.
    הערה: מומלץ לבדוק גודל החור עם סוף נימי מן החלק השרוף כדי להבטיח בגודל הנכון, כמו החלק השרוף של נימי הוא שביר.
  3. להוסיף ~ 150 µL של HF (48-51% פתרון במים) הצינור 200-µL כך הפתרון HF נמצא בערך במחצית את החלק השרוף-נימי. דגירה של נימי בפתרון HF בטמפרטורת החדר למשך 90-100 דקות.
    הערה: מומלץ כי נוצר עוד חור במכסה של הצינור, חפץ קטן (למשל, טיפ קטן פיפטה) משמש להחזיק את הצינור בזמן הדגירה לוקח את המקום. הטיפ פיפטה יכול לשמש כדי לנקב קצף או כמה אחרים פלטפורמה מוצקה שממנו תא התגובה יתלה, יצירת סביבה בטוחה. במקום מגבות נייר מתחת הצינור המכיל HF, בצע את ההליכים נכונה במקרה של דליפה.
  4. הסר את נימי מהצינור ולשטוף החיצוני עם מים יונים כדי להסיר כל HF שיורית.
    הערה: ודא הקוטר החיצוני של נימי-החלק הצר של החלק השרוף עכשיו קטן מ- 100 מיקרומטר, כמו שצריך להיות.
  5. חותכים את חלק חרוט נימי במרכז החלק הצר באמצעות אבן שהפריד כדי לייצר את נימי ההפרדה עם פחות מ-100 מיקרומטר ב יתר בקצה אחד. חותכים נחרטו ללא סוף נימי להשיג הפרדה 1-m נימי.
    הערה: השלך פסולת HF לפי הפרוטוקול כמוסד שנקבעו.

3. הכנת הדגימות

  1. הכנת תערובת חלבונים סטנדרטי
    1. להכין תערובת חלבונים סטנדרטית המכילה ציטוכרום c (Cyto.c, 12 kDa, 0.1 מ"ג/מ"ל) ליזוזים (14.3 kDa, 0.1 מ"ג/מ"ל), β-קזאין (24 kDa, 0.4 מ"ג/מ"ל), מיוגלובין (16.9 kDa, 0.1 מ"ג/מ"ל), קרבוניק אנהידראז (CA, 29 kDa, 0.5 מ"ג/מ"ל), אלבומין שור (BSA, 66.5 kDa 1.0 מ"ג/מ"ל) ב- LC-MS כיתה מים כפתרון מניות.
      הערה: הפתרון מניות ניתן aliquoted מאוחסנת ב- 80 ° C לשימוש.
    2. לדלל את הפתרון מניות לפי פקטור של 10 עם פתרון אמוניום ביקרבונט 50 מ מ (pH 8.0) במים כיתה LC-MS לניתוח CZE-MS.
      הערה: לסנן את הפתרון אמוניום ביקרבונט לפני השימוש עם מסנן ממברנה (למשל, 0.2 µm של קרום תאית חנקתי ו-50 מ"מ קוטר).
  2. הכנת דוגמה e. coli
    1. התרבות התאים e. coli (K-12 MG1655) LB בינוני ב 37 מעלות צלזיוס תוך טלטול-225 סל ד עד הערך OD600 מתקרב 0.7. E. coli תאים באמצעותצנטריפוגה (3,283 x g, 10 דקות) לאסוף ולשטוף אותם מספר פעמים בתמיסת באגירה פוספט (PBS) כדי להסיר את המדיום.
    2. להשעות את התאים e. coli במאגר פירוק המכילה אוריאה 8 מ', מעכבי פרוטאז ו 100 מ מ אמוניום ביקרבונט (pH 8.0), ultrasonicate על קרח למשך 15 דקות באמצעות מפצל תא קולי עם קרן גביע עבור פירוק התא מלא.
      1. להגדיר את מחזור (%) 50 ולהגדיר את הפלט שליטה 7 עבור מפצל התא קולי.
    3. Centrifuge lysate ב 18,000 x g עבור 10 דקות לאסוף את תגובת שיקוע וזורקים בגדר. השתמש aliquot קטן של תגובת שיקוע למדידה ריכוז חלבון עם bicinchoninic חומצה (BCA) וזמינותו.
      הערה: את הצרכים lysate אלקליניים לפחות פי שלושה כדי להפחית את הריכוז אוריאה נמוך מ- 3 מ' על מנת להיות תואם וזמינותו BCA. וזמינותו BCA מבוצעת בהתבסס על ההליך של היצרן.
    4. לערבב 1 מ ג של e. coli חלבונים עם אצטון קר עם יחס נפח של 1:4 ולשמור התערובת ב-20 מעלות צלזיוס למשך הלילה, כדי לזרז את החלבונים.
      הערה: לבצע כל ניסויים באמצעות אצטון בשכונה כימי.
    5. ספין למטה זירז חלבונים (12,000 x g, 5 דקות) ולהסיר את תגובת שיקוע. רוחצים את גלולה עם אצטון קר שוב (באותו אמצעי אחסון כמו קודם) את ספין למטה שוב.
    6. הסר את תגובת שיקוע ולאפשר בגדר להתייבש בשכונה כימי לכמה דקות.
      הערה: לא overdry בגדר חלבון.
    7. להמיס את precipitated e. coli חלבונים (מ ג 1) ב- µL 200 של 8 מ' אוריאה ב- 100 מ מ אמוניום ביקרבונט (pH 8.0).
    8. Denature, להפחית ו- alkylate לדוגמה.
      1. דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות denature את החלבונים.
      2. להפחית עם dithiothreitol (DTT) על ידי הוספת 2 µL של 1 מ' DTT פתרון (100 מ מ אמוניום ביקרבונט) לתוך הדגימה המקננת המדגם ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      3. Alkylate את החלבונים עם iodoacetamide (רשות העתיקות) על-ידי הוספת µL 6 של 1 מ' רשות העתיקות פתרון (100 מ מ אמוניום ביקרבונט) לדגימת, דגירה המדגם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      4. להרוות את רשות העתיקות עודף עם DTT על-ידי הוספת 2 µL של 1 מ' DTT פתרון, תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. Acidify הדגימה עם חומצה פורמית (FA) להגיע לריכוז פא סופית של 1% (v/v).
        הערה: הפחתת ו אלקילציה מבוצעות לסייע על התגלגלות של חלבונים על פיצול במורד הזרם. צעדים אלה יאבדו את המידע של איגרות חוב דיסולפידי. אם המטרה היא ללמוד על אגרות החוב דיסולפידי על החלבונים, להימנע הצעדים הללו. זכור כדי להתמודד עם כל הפתרונות חומצה מרוכזת בשכונה כימי.
    9. Desalt הדגימה באמצעות עמודה מלכודת C4 (למשל, 4 מ מ תעודות זיהוי, 10 מ מ אורך, ארוז עם חלקיקים 3-מיקרומטר שיש 300-נקבוביות) עם מערכת HPLC. להשתמש גלאי UV באורך-גל של 254 ננומטר לצורך זיהוי.
      1. הגדר קצב הזרימה ניידים שלב 1 מ"ל לדקה Activate העמודה על ידי שטיפה זה עם 80% (v/v) acetonitrile (לחצן מצוקה), 0.1% פא במים למשך 10 דקות, ו- equilibrate על ידי שטיפה זה עם 2% (v/v) לחצן מצוקה, 0.1% פא במים למשך 10 דקות.
      2. לטעון 500-µg חלבונים אל העמודה ואת desalt על ידי שטיפה אותם עם 2% (v/v) לחצן מצוקה, 0.1% פא במים למשך 10 דקות בקצב זרימה 1 mL/min.
      3. Elute את החלבונים עם 80% (v/v) לחצן מצוקה, 0.1% פא במים למשך 3 דקות בספיקה 1 mL/min. לאסוף את eluate, lyophilize זה עם רכז ואקום.
        הערה: העמודה מלכודת C4 יכול לשמש כדי desalt כמויות גדולות של חלבונים אבל לא נמוך מיקרוגרם של חלבונים בשל אובדן אפשרי מדגם. עבור חומרים חלבונים מוגבל, שקול להשתמש פיפטה טיפים עם C4 מדיה עבור חלבון desalting. יש להיזהר לא overdry את החלבונים, כאשר lyophilizing את הדגימה.
    10. להמיס את µg 500 של חלבונים (בהנחה ללא אובדן מדגם במהלך הכנת המדגם) 250 µL של 50 מ מ אמוניום ביקרבונט (pH 8.0) לניסויים CZE-MS.

4. הגדרת המערכת CZE-MS/MS, ניתוח של הדגימות

  1. הקמה של מערכת CZE
    1. הכן של BGE המכילה 5% או 10% (v/v) חומצה אצטית (pH ~2.4 או ~ 2.2) ב- LC-MS כיתה מים. מכניסים מ ~1.5 ל BGE בקבוקון BGE שתואם עם המגש מאגר של תעשיה CZE.
      הערה: להפוך BGE טריים בכל שבוע שינוי הפתרון BGE בבקבוקון כל יום כדי למנוע כל זיהום.
    2. להוסיף פתרון מדגם (5-200 µL) שפופרת הוספה, להכניס את הצינור הוספה thatmatches המבחנה מדגם עם המגש מדגם של תעשיה CZE.
    3. טען את הדגימה את BGE, ההפרדה נימי תעשיה CZE.
      הערה: השפה המשמשת בדייקנות מפליאה פרוטוקול זה משקף את השימוש מזהמי מזון מסוים אחד (ראה טבלה של חומרים), אך ניתן ליישם את העקרונות autosamplers אחרים.
      1. בחר מדגם לטעון הדף שליטה ידנית של תעשיה CZE. לטעון את המבחנה BGE במגש מאגר של תעשיה, וציין את מעמדה במגש מאגר. לטעון את המבחנה מדגם במגש מדגם של תעשיה, וציין את מעמדה במגש הדגימה.
        הערה: המכשיר יכול להיות מופעל בשליטה ידנית על-ידי לחיצה על התמונה של המכשיר עבור צג המכשיר בדף הכלי העיקרי ולאחר מכן בחירה ידנית תחת שליטה ישירה.
      2. טען את נימי ההפרדה תעשיה CZE, באמצעות נחרטו ללא סוף נימי. לשים את מזהמי מזון למיקום יישור באמצעות שליטה ידנית. שרשור נחרטו ללא סוף נימי לתוך חור המשמש לשמור על ההפרדה נימי עד זה לא יכול להיות משורשרות פיזית נוסף.
        הערה: במקרה זה, בסוף נימי כמעט באותו גובה כמו הסוף של האלקטרודה, µL לפחות 50 המדגם הוא נדרש בבקבוקון מדגם כדי לוודא שבסוף נימי הוא שקוע המדגם במהלך ההזרקה. אם אמצעי האחסון מדגם נמוך (כלומר, 5 µL), הגובה של הזרקת סוף הצרכים נימי יותאם כפי שמתואר בשלב 4.1.3.2.1.
        1. להתאים את הגובה של הזרקת סוף נימי אם אמצעי האחסון מדגם הוא נמוך יותר מאשר 50 µL (כלומר, 5 µL). לעבור את מזהמי מזון המתנה בעזרת שליטה ידנית. הקלד את מיקום הדגימה במערכת והזז את נימי המדגם. דחוף בסוף נימי עוד יותר למטה כדי להגיע לתחתית המבחנה דוגמת הזרקת.
          הערה: במקרה זה, הזרקה מדגם ניתן לבצע עם מדגם של µL רק 5 בבקבוקון.
      3. המשך השימוש של שליטה ידנית, לשטוף את נימי עם BGE למשך 20 דקות, תוך שימוש בלחץ של 20 psi.
  2. הקמה של הממשק CZE-MS
    1. השתלבי זכוכית בורוסיליקט נימי (1 מ מ ביתר, 0.75 מ מ ז, 10 ס מ) שני הפולטים ספקטרומטריית electrospray עם דרך פתח בגוף של 20-40 µm ביתר
      הערה: לשמור על אורך פולט ספקטרומטריית electrospray כ 4-5 ס מ וחותכים אותו עם אבן שהפריד במידת הצורך. להיפטר זכוכית כל הפסולת במיכל החדים. ההגדרות כדי לקבל עצות 20 - 40 µm הם כדלקמן. הגדר את החום כדי 498, המשיכה 5, את מהירות עד 10, העיכוב 150, ואת הלחץ ל-200. בדוק את גודל הפולטים עם מיקרוסקופ לפני השימוש. כוונן את הפרמטרים מעט במידת הצורך.
    2. הר זרם נדן אלקטרו-kinetically שאוב מסחרי ממשק (ראה טבלה של חומרים) בחזית ספקטרומטר מסה. מילוי המאגר מאגר מעטפת עם מאגר המכיל 10% (v/v) מתנול ו- 0.2% (v/v) פא במים כיתה LC-MS.
    3. לשטוף את T בממשק עם מעטפת המאגר באמצעות הפעלת לחץ באופן ידני בעזרת מזרק. החוט בקצה 1-מ מיתר של פולט ספקטרומטריית electrospray דרך צינורות שרוול וחבר פולט עם יציאה אחת של Tבאמצעות התאמה. פשוט לשטוף ה- T ידנית שוב עם מזרק מילוי פולט עם המאגר נדן.
    4. להתאים את המרחק בין הכניסה ספקטרומטר המסה ~ 2 מ"מ עם העזרה של המצלמה שהגיע עם הממשק של דיזה של פולט. החל מתח 2 - 2.2 kV-המבחנה מאגר נדן עבור ספקטרומטריית electrospray. התאם את המתח ספריי כדי להגיע ספקטרומטריית electrospray יציב.
      הערה: אם אין ספקטרומטריית electrospray או לא יציבה ספקטרומטריית electrospray נצפית, בדוק את הממשק כדי לוודא שאין אין בועות גדולות בפולט, ה- T, וכן את הצנרור להשתמש בהם כדי לחבר את המבחנה מאגר נדן, ה- T. המרחק בין הכניסה ספקטרומטר מסה כגדולים של פולט יכול להיות מוערך בערך על-ידי השוואתה עם 1 מ מ הקרוע של פולט. המתח ספריי תלויה בגודל של פולט. עבור 20 - 40 µm פולטי, 2-2.2 kV הוא מספיק טוב. זכור תמיד להיזהר בעת שימוש מתח גבוה.
    5. כבה את המתח ספריי ושרשר בעדינות סוף ההפרדה נימי דרך ה- T לתוך פולט חרוט עד שזה לא יכול להיות דחף נוספת. החל בלחץ נמוך (כלומר, 5 psi) בסוף הזרקת נימי בתהליך זה כדי לוודא שישנם אין בועות נים.
      הערה: נימי מחובר אליו T דרך צנור שרוול ומתאים. להתאים את העמדה של סוף נימי חרוט פולט עם העזרה של המצלמה בתוך 500 מיקרומטר. המרחק יכול להיות מוערך בערך על-ידי השוואתה עם 1 מ מ הקרוע של פולט.
    6. לעצור את הלחץ נמוך בסוף הזרקה נים. לשטוף את פולט קצת עם המאגר נדן. שוב, להחיל kV 2-2.2 ספריי מתח כדי לבדוק את הספריי.
  3. הסידור של שיטה CZE דוגמת הזרקת ההפרדה, שטיפה נימי, מפעילה של ספקטרומטר מסה עבור רכישת נתונים
    1. בחר שיטה חדשה תחת התפריט הנפתח קובץ במסך מכשיר עיקרי ליזום שיטה חדשה.
    2. בחר כניסת SV/EV, מגש כדוגמה, לחץ כמו 5 psi, KV 0, וכן משך כ 95 s עבור זריקת דוגמה.
      הערה: המדגם מוזרק לתוך נימי באמצעות הפעלת לחץ. אמצעי האחסון הזרקה מדגם יכול להיות מחושב בהתבסס על הזמן הלחץ, הזרקת באמצעות החוק של Poiseuille. לדוגמה, 5 psi עבור זריקת דוגמה 95-s מקביל בערך 500 nL נפח העמסה לדוגמה עבור הפרדה באורך 1 מ' צינור קפילר (50-µm זהות).
    3. בחר פרמטרים עבור ההפרדה CZE ולהגדיר פרמטרים עבור מפעילה את חדרי קירור והקפאה.
      1. הגדר כניסת KV לחץ כמו 0 psi, מגש כמו מאגר, InV 30, וכן משך כ 4,200 s לצורך הקמת מכשול ההפרדה של המדגם תערובת חלבונים סטנדרטי. הגדר כניסת InV מגש כמו מאגר, לחץ כמו 0 psi, KV 20, וכן משך כ- 6,600 s לצורך הקמת מכשול ההפרדה של המדגם פרוטאום e. coli .
        הערה: המתח הוחל על ההפרדה ניתן להתאים בהתאם למורכבות הדגימה. לדוגמאות חלבון, 30 kV יכול להיות מיושם כדי להאיץ את הניתוח. לקבלת דוגמאות מורכבות, 20 kV מוחל להאט את ההפרדה ולרכוש עוד ספקטרה MS/MS עבור proteoform חתימות.
      2. כוונן את הפרמטרים עבור מפעילה רכישת נתונים תחת אירועי מתוזמן. להגדיר זמן (s) וגם 0.0 סוג 1 ממסר עבור הפעלה בשלב 1; להגדיר זמן (s) 1.0 סוג 1 ממסר עבור Deactivate בשלב 2.
    4. בחר כניסת KV לחץ כמו 10 psi, מגש כמו מאגר, InV 30, וכן משך כ 600 s עבור שטיפה נימי.
    5. שמור את הקבצים שיטה עבור CZE-MS ו- MS/MS ניסויים.
  4. הקמה של MS ו- MS/MS
    1. הגדר את פרמטרי MS ו- MS/MS לניתוח חלבון שלם באמצעות ספקטרומטר מסה מלכודת פאול-יון (ראה טבלה של חומרים).
      הערה: השלבים יון חיובי ומצב גבוה יותר אנרגיה collisional דיסוציאציה (HCD) עבור פיצול מועסקים.
      1. התאם את הגדרות הקובץ המנגינה: הפעלת חלבון שלם מצב ולהשתמש בלחץ השמנה של 0.2. הגדר העברת יון נימי טמפרטורה עד 320 ° C ואת רמת RF s-עדשה 55.
      2. לבנות את הקובץ שיטת MS ו- MS/MS.
        1. עבור MS מלא, הגדר את המספר של microscans 3, את הרזולוציה כדי 240,000 (ב מ/z 200), שליטה (קובי) הגברה אוטומטית ערך היעד כדי 1E6 את הזמן המרבי הזרקת 50 מילישניות, טווח סריקה ל- 600-2000 מ/z.
      3. עבור MS/MS, השתמש נתונים תלויי רכישה (DDA) עבור היונים האינטנסיבי ביותר שמונה ב- MS ספקטרום. הגדר את החלון בידוד 4 מ/z והאנרגיה collisional מנורמל (פליטות) ל-20%. הגדר את המספר של microscans ל- 1, את הרזולוציה ל- 120,000 (ב מ/z 200) את ערך היעד AGC 1E5, הזמן המרבי הזרקת 200 ms.
      4. הגדר את הסף העוצמה עבור מפעילה פיצול כדי 1E5 ולהגדיר היונים עם מדינה תשלום גבוה יותר מאשר 5 להיות מבודדים שאין בהם פיצול. להפעיל את היוצאים אל תכלול איזוטופים והגדר החרגה דינמי 30 s.
        הערה: ניתן להגדיל את מספר microscans עבור MS/MS 3. במקרה זה, ניתן להשתמש בשיטה Top3 DDA במטרה לצמצם את זמן המחזור.
    2. הגדר חיבור קווי בין תעשיה לסה נ את ספקטרומטר מסה עבור הפעלה אוטומטית של רכישת נתונים. חבר קצה אחד של חוט ממסר קשר 1 A ממסר קשר 1 B בגב תעשיה לסה נ. חבר את הקצה השני של הכבל כדי להתחיל בו להתחיל ב + בצד ספקטרומטר מסה.
  5. CZE-MS/MS ניסוי וניתוח של הדגימות
    1. להחיל 30 kV באמצעות שליטה ידנית את CE הגעתי לסוף הזרקה מדגם, 2-2.2 kV-המבחנה מאגר נדן באמצעות אספקת כוח חיצוני כדי לבדוק את ההפרדה נימי ומסת ספקטרומטריית electrospray.
      הערה: ההפרדה הנוכחית, במקרה זה, היא סביב 8-9 µA אם חומצה אצטית 5% (v/v) משמש את BGE.
    2. להגדיר את רצף רכישת נתונים במחשב ספקטרומטר מסה על-ידי בחירת רצף חדש.
      1. בחר סוג הדגימה לא ידוע וציין שם קובץ ונתיב. מצביעים על השיטה MS כדי לשמש עבור כל דגימה לפעול תחת כלי השיטה.
        הערה: מכיוון שאין במחשב נפרד לשליטה על תעשיה לסה נ, מיקום הדגימה לא צריך לפרט כאן.
    3. להגדיר רצף ההפרדה CZE במחשב לסה נ כדי לציין את מיקום מאגר, מיקום הדגימה ושיטת CZE. כדי להתחיל רצף חדש, בחרו ברצף תחת התפריט הנפתח ניתוח בעמוד הכלי העיקרי.
    4. הפעל שיטת רכישת נתונים במחשב ספקטרומטר מסה תחילה על-ידי בחירת להפעיל רצף (או להפעיל מדגם יחיד פועל). . אז, להתחיל את הרצף CE במחשב תעשיה לסה נ.
      הערה: כאשר המתח ההפרדה מופעל לאחר הזריקה לדוגמה, אות נשלחת מ תעשיה לסה נ ספקטרומטר מסה על מפעילה את חדרי קירור והקפאה. ההפרדה הנוכחית יקטן בתחילת במהלך ההפרדה עקב הערימה של מדגם צומת pH דינמי. לאחר מכן, הזרם מתאושש בהדרגה.

5. מאגר חיפוש הקבצים גלם שנאספו בתוכנת ה-TopPIC

  1. העברת הקבצים .raw, כולל הנתונים MS ו- MS/MS, מהמחשב ספקטרומטר מסה על מחשב ייעודי לחיפוש מסד הנתונים.
    הערה: קבצים .raw אלה עשויים להיות גדולים, דורשת מחשב חזק כדי להגיע חיפוש מהיר במסד הנתונים.
  2. הורדה חבילת ProteoWizard ו- TopPIC במחשב ייעודי לחיפוש מסד הנתונים.
    הערה: סוויטת ProteoWizard ו- TopPIC הן תוכנות קוד פתוח וניתן למצוא באינטרנט (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net; סוויטת TopPIC: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). UniProt מסדי נתונים משמשים עבור חיפושים במסדי נתונים, ניתן למצוא באתר האינטרנט של UniProt.
  3. להמיר את קבצי .raw .mzML קבצים עם msconvert, כלי המרה בתבנית של קובץ MS ProteoWizard28. ב- GUI של msconvert (MSConvertGUI.exe), לחץ על לחצן עיון ובחר את הקובץ .raw יומרו. בחר mzML תבנית הפלט ולשמור כל האפשרויות האחרות-ערכי ברירת המחדל שלהן. לחץ על הלחצן התחל בפינה הימנית התחתונה של GUI.
  4. להמיר את קבצי .mzML .msalign קבצים בעזרת הכלי TopFD TopPIC סוויטה29.
    1. GUI של TopFD (topfd_gui.exe), לחץ על לחצן הקובץ ובחר את הקובץ .mzML שנוצר בשלב הקודם. לשמור את ערכי ברירת המחדל של הפרמטרים ולאחר מכן, לחץ על לחצן התחל בפינה הימנית התחתונה של GUI.
      הערה: TopFD ממיר אשכולות איזוטרופי קודמן, פרגמנט monoisotopic ההמונים ומזהה תכונות אפשריות proteoform MS1 נתונים על ידי שילוב קודמן איזוטרופי אשכולות עם ההמונים monoisotopic דומה ושעות ההעברה קרוב. שלושה קבצים ייווצר מן TopFD, כולל קובץ ms1.msalign, קובץ ms2.msalign קובץ .feature. קבצי ה-ms1.msalign וה ms2.msalign מכילים deconvoluted monoisotopic המוני ספקטרה MS1 ו- MS/MS, בהתאמה. קובץ ה-.feature מכיל תכונות proteoform אפשרי.
  5. לבצע חיפוש במסד הנתונים עם TopPIC (גירסה 1.1.3) ב- TopPIC suite30.
    1. GUI TopPIC (toppic_gui.exe), לחץ על קובץ מסד הנתונים ובחר מאגר מידע מתאים לחיפוש.
    2. לחץ על הקובץ ספקטרום ובחר את הקובץ ms2.msalign שנוצר בשלב 5.4.1 כקלט. בחר את הקובץ התכונה MS1 ובחר את הקובץ .feature שנוצר בשלב 5.4.1.
    3. הגדר ציסטאין carbamidomethylation (C57) שינוי קבוע עקב טיפול רשות העתיקות.
      הערה: קובץ טקסט ניתן גם ליצור למגוון שינויים קבועים על ידי עורך טקסט. לאחר מכן, ניתן לבחור את קובץ הטקסט באמצעות לחצן הקובץ לצד שינויים קבועים ב- TopPIC GUI.
    4. בחר בתכונה דמה מסד נתונים , תחת הגדרות החיתוך, בחר רוזוולט (שיעור גילוי שווא) בתפריט הנפתח לצד רמת ספקטרום. הגדר פד 0.01 ברמת ספקטרום, 0.05 ברמת proteoform.
      הערה: TopPIC מספק מספר אפשרויות לסינון התוצאות: ספקטרום ברמת רוזוולט, proteoform מרמה רוזוולט, או את שניהם. פד מחושבת בהתבסס על הגישה המטרה-דמה31.
    5. יוצאים Generating פונקציה מסומנת ומוגדרת לשגיאות (ppm) 15.
    6. תחת פרמטרים מתקדם, בחר 2 עבור המספר המרבי של משמרות המוני בתפריט הנפתח. הגדר את המיסה מקסימום משמרת (Da) של שינויים לא ידוע 500 המחוזי להשאיר את הפרמטרים האחרים ערכי ברירת המחדל שלהן, לחץ על לחצן התחל בפינה הימנית התחתונה של GUI.
      הערה: התוכנה TopPIC יוצר שני קבצי טקסט שנוצר. הקובץ עם הסיומת. OUTPUT_TABLE מכיל את רשימת התאמות ספקטרום proteoform מזוהה (PrSMs), ואת האחד עם סיומת. FORM_OUTPUT_TABLE מכיל את רשימת proteoforms מזוהה. עבור כל PrSM, התוכנה מספקת מידע כללי על המשחק, תבנית פיצול שנצפו, פרגמנט מתאימים יונים, מסה שזוהו משמרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג תרשים של דינאמיות המבוססות על pH-צומת CZE-ESI-MS מערכת המשמשים את הניסוי. פקק ארוך של המדגם במאגר הבסיסי מוזרק מצופים LPA ההפרדה נימי מלא של BGE חומצי. לאחר החלת מתח גבוה I ו- II, analytes באזור הדגימה תהיה מרוכזת באמצעות השיטה צומת pH דינמי. כדי להעריך את הביצועים של המערכת CZE-MS, תערובת חלבונים סטנדרטי (ציטוכרום c, ליזוזים, β-קזאין, מיוגלובין, CA ו- BSA) בדרך כלל ניתוח. Electropherogram נציג לקבלת תערובת חלבונים תקן מוצג באיור 2א. התערובת חלבון סטנדרטית מנוהל בדרך כלל לפחות על כפילויות כדי להעריך את יעילות ההפרדה את הפארמצבטית של המערכת. ניתן להעריך את יעילות ההפרדה עם מספר לוחות תיאורטי של חלבונים מסוימים, כפי שמוצג באיור 2B. ניתן להעריך את הפארמצבטית מאת סטיות תקן יחסית של זמן בעוצמה והעברה חלבון. איור 3 א מראה תצוגה שהתצוגה בשל electropherogram המדגם חלבון e. coli נותחו על ידי דינאמיים המבוססות על pH-צומת CZE-MS/MS. עוצמת חלבון ברמת מנורמל (NL) צריכה להיות בהיקף של 108 אם µg 1 של e. coli חלבונים נטענים לניתוח עם מלכודת פאול ספקטרומטר מסה. תקריב-אין תצוגה של electropherogram יכול לשמש כדי להעריך את החלון ההפרדה של המערכת. במקרה זה, החלון ההפרדה הוא 80-90 דקות איור 3ב מראה דוגמה PrSM, לרבות מידע כללי proteoform המתאימים, חלבון רצף, תבנית פיצול שנצפו, שינויים. הערך-E נמוך מאוד (2.11E-48) ולהציע ביטחון גבוהה של מזהה proteoform ספקטרלי רוזוולט (0) המספר הגבוה של פרגמנט מתאימים יונים (60) נוסף מצביע על ביטחון גבוהה של מזהה תבנית פיצול שנצפה מראה כי חלוקת proteoform הגובהה המכסים את טרמיני (termini) ואת החלק האמצעי של proteoform. המחשוף N-מסוף של שלוש חומצות אמינו (MTM) נקבע באמצעות חיפוש במסד הנתונים.

Figure 1
איור 1 : דיאגרמה של מערכת CZE-ESI-MS דינאמיים המבוססות על pH-צומת. המדגם הוא מומס 50 מ מ אמוניום ביקרבונט, pH 8. BGE הוא 5% או 10% (v/v) חומצה אצטית, pH ~2.4 או ~ 2.2. נימי מצופים LPA 1-m משמשת להפרדה. ממשק זרימה נדן אלקטרו-kinetically שאוב משמש כמה CZE ל MS. מלכודת פאול ספקטרומטר מסה משמש. במתח אני (HV אני) הינו מסופק על ידי אספקת כוח משולב של תעשיה CE לפרידה. מתח גבוה II (HV II) הינו מסופק על ידי ספק כוח נפרד ספקטרומטריית electrospray. ספקטרומטר מסה הקרקע. המרחק בין הכניסה של ספקטרומטר מסה כגדולים של פולט הוא ~ 2 מ מ. המרחק בין סוף נימי חרוט ב פולט כגדולים של פולט הוא פחות מ-500 מיקרומטר. הגודל של כגדולים של פולט ספקטרומטריית electrospray הוא 20-40 µm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : נתונים של תערובת חלבונים סטנדרטי נותחו על ידי דינאמיים המבוססות על pH-צומת CZE. גברת (א) לוח זה מראה של electropherogram שיא הבסיס. (B) לוח זה מראה את מספר הצלחות תיאורטי (N) של שלושה חלבונים. אמצעי האחסון הזרקה מדגם היה 500 nL. HV 30 kV להפרדה, HV השני היה 2.2 kV עבור ספקטרומטריית electrospray. BGE היה חומצה אצטית 5% (v/v), pH 2.4. המדגם היה 50 מ מ אמוניום ביקרבונט (pH 8) ומכיל ציטוכרום c (0.01 מ"ג/מ"ל) ליזוזים (0.01 מ"ג/מ"ל), β-קזאין (0.04 מ"ג/מ"ל), מיוגלובין (0.01 מ"ג/מ"ל), קרבוניק אנהידראז (CA, 0.05 מ"ג/מ"ל), אלבומין שור (BSA, 0.1 מ"ג/מ"ל). ספקטרה MS/MS לא נרכשו עבור המדגם תערובת חלבונים סטנדרטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : הנתונים של e. coli proteomeanalyzed על ידי דינאמיים המבוססות על pH-צומת CZE MS/גברת (א) זו השקפת מופעים תקריב-פאנל electropherogram המבוססת על שיא של e. coli חלבון לדוגמה. (B) לוח זה מציג דוגמה ש-prsm מזוהה באמצעות חיפוש במסד הנתונים TopPIC הספקטרום MS/MS הנרכש. המידע הכללי proteoform המתאימים, חלבון רצף, ציין תבנית פיצול, שינויים מוצגים. ניתן גם להציג היונים פרגמנט בהתאמה מ בודדים PrSM במידת הצורך. HV 20 kV להפרדה, HV השני היה 2.2 kV עבור ספקטרומטריית electrospray. BGE היה 10% (v/v) חומצת חומץ, pH ~ 2.2. המדגם היה 50 מ מ אמוניום ביקרבונט (pH 8) והיה ריכוז חלבון 2 מ"ג/מ"ל. אמצעי האחסון הזרקה מדגם היה 500 nL. שיטה DDA top8 שימש כדי לרכוש את הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי להשתמש CZE-MS/MS עבור אפיון proteoforms דגימות חלבון ברזולוציה גבוהה, זיהוי בקנה מידה גדול proteoforms בדגימות פרוטאום מורכבים. דיאגרמה של מערכת CZE-ESI-MS/MS מוצג באיור1. ישנם ארבעה שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, הכנת ציפוי LPA באיכות גבוהה על הקיר הפנימי של נימי ההפרדה חשובה ביותר. ההפרדה מצופים LPA נימי יכול להפחית EOF ב נימי, להרחיב את החלון ההפרדה של CZE ולהפחית את החלבון ספיחה על הקיר הפנימי שלה19. התגובה הפילמור להכנת הציפוי LPA הוא ביצע באמצעות מילוי נימי עם תערובת של אקרילאמיד (מונומר) קירור (היוזם הפילמור), ואחריו חימום את נימי באמבט מים כדי לעורר תגובה22. התזמון באמבט מים היא קריטית. קצר מדי זמן תגובה יוביל, התגובה לא שלם ו ציפוי המסכן. בדרך כלל אנו מאפשרים התגובה הקבוצתית 50 דקות, המאפשר את התגובה להמשיך לתקופה ארוכה יותר לציפוי טוב יותר. עם תקופות ארוכות יותר של התגובה, נים עשויים להיחסם, משאבת HPLC אולי צריך לשמש כדי לדחוף את הפולימר בתוך נימי עם מים. נימי מצופים LPA אחד יכול ברציפות לשמש במשך כשבוע, בהתבסס על הנתונים בספרות שלנו ניסיון22.

השלב הקריטי השני הוא צימוד CZE ל MS עם הזרם נדן אלקטרו-kinetically שאוב CE-MS ממשק25,26. המרחק בין סוף ההפרדה נימי ב פולט ESI כגדולים פולט משפיע על הרגישות של CZE-MS באופן משמעותי, ומייצרת מרחק קצר יותר של רגישות גבוהה יותר25. הסוף של נימי ההפרדה צריכה להיות חרוט עם תדר גבוה, כדי להפחית את הקוטר החיצוני שלה מ מיקרומטר 360 פחות מ-100 מיקרומטר, המאפשר בסוף נימי דחף אותי קרוב כגדולים פולט. המרחק בין הכניסה ספקטרומטר מסה פולט דיזה מוטבה כדי להגיע את הרגישות ביותר ואת יציבות טובה26. אנחנו בדרך כלל לשמור על המרחק בערך 2 מ מ.

השלב הקריטי השלישי הוא MS/MS ניתוח עם הערימה הדגימה מקוון המבוססות על pH-צומת דינמי19וקביעת CZE-MS. ה-pH של המאגר לדוגמה, את BGE צריך להיות שונה באופן משמעותי על מנת להבטיח מדגם יעיל בערימה. ריכוז החלבון המדגם צריך להיות מתאים. אם ריכוז חלבון גבוה מדי, יכול זירז את החלבונים ב נימי במהלך מדגם בערימה. ריכוז החלבון הדגימות שימשו דמויות 2 ו- 3 יכול להיחשב דוגמאות טיפוסיות. השלב הקריטי האחרון הוא חפש את מסד הנתונים עם TopPIC proteoform מזהים30. מספר השלבים הנדרשים עבור המרות קבצים לפני שניתן לבצע את החיפוש של מסד נתונים עם TopPIC. מסנן רוזוולט הנכונה יש צורך להבטיח את איכות proteoforms מזוהה. אנחנו בדרך כלל משתמשים של % 1 ספקטרום ברמת רוזוולט כדי לסנן את תוצאות החיפוש של מסד הנתונים. נציין כי היוזמה פרוטאומיקס מלמעלה למטה הוא משאב טוב מאוד עבור נתוני ניתוח תוכנה32,33ושיטות פרוטאומיקס מלמעלה למטה.

נשים לב כי חלקים מסוימים של הפרוטוקול אולי צריך להיות שונה במקצת, פתרון בעיות כלשהו, ייתכן שיהיו דרושים. הזמן של פלמור באמבט מים עבור הכנת הציפוי LPA עשויים להשתנות במעבדות שונות. הזמן HF איכול ההפרדה נימי ייתכן שתצטרך להיות שונה במקצת עקב חום שונים במעבדות שונות. בעת הגדרת הממשק CE-MS, ודא שספקטרומטריית electrospray יציב לפני להשחיל את נימי ההפרדה לתוך פולט ספקטרומטריית electrospray. אם אין ספקטרומטריית electrospray או לא יציבה ספקטרומטריית electrospray נצפית, בדוק את הממשק כדי לוודא שלא יהיו בועות לא פולט, בה- T, או בכל הצנרת להשתמש בהם כדי לחבר את המבחנה מאגר נדן, ה- T. בנוסף, המרחק בין הכניסה ספקטרומטר מסה כגדולים של פולט יכול להשפיע על היציבות ספקטרומטריית electrospray והוא בדרך כלל כ- 2 מ מ. המתח ספקטרומטריית electrospray יכול גם להשפיע על היציבות ספריי. עבור 20 - 40 µm פולטי, 2-2.2 kV בדרך כלל מספיק טוב. כפי שמתואר בפיסקה הקודמת, ריכוז חלבון המדגם צריך להיות מתאים. אם ריכוז חלבון גבוה מדי, יכול זירז את החלבונים ב נימי במהלך מדגם בערימה. שים לב הפרופיל הנוכחי במחשב תעשיה לסה נ. אם הזרם הוא אפס בתחילת מאוד של הפעלה CZE, פירוש כי פקק של אוויר מוזרק לתוך נימי במהלך השלב הזרקה מדגם. ודא שאמצעי האחסון של המדגם בבקבוקון גדול מספיק. אם הזרם תקין בתחילת פתאום הופך להיות אפס במהלך הריצה, זה בדר כ אומר כי ריכוז חלבון גבוה מדי.

CZE-MS/MS בהתבסס על פרוטוקול זה מאפשר האפיון ברזולוציה גבוהה של חלבון דגימות של פרוטאומיקס מלמעלה בקנה מידה גדול של proteomes מורכבים. לדוגמה, ניגש CZE-MS אפיון תערובת חלבון סטנדרטית המכילה חלבונים 619ברזולוציה גבוהה. כפי שמוצג באיור2, CZE-MS בבירור יש להפריד את 6 החלבונים יעילות הפרדה גבוהה חשף שלוש צורות של β-קזאין, זיהומים רבים שאותרו. כדוגמה נוספת, קליע בודד CZE-MS/MS reproducibly הניבו proteoform מעל 500 חתימות ומזהים חלבון 190 פרוטאום e. coli , באמצעות µg רק 1 של e. coli חלבונים עם פד ספקטרום ברמת191%. CZE-MS/MS שיפור מספר proteoform חתימות פרוטאום מורכבים על ידי לפחות שלוש פעמים, בהשוואה עם מחקרים קודמים של CZE-MS/MS קליע בודד. כפי שמוצג באיור 3א, CZE-MS/MS הגיעו בו זמנית נפח העמסה מדגם 500-nL וחלון הפרדה 90-מין לניתוח של e. coli פרוטאום19. התוכנה TopPIC יכול לספק מידע מקיף לגבי proteoforms מזוהה (איור 3ב). המערכת CZE-MS/MS מספקת הקהילה פרוטאומיקס עם כלי שימושי עבור בקנה מידה גדול וברזולוציה פרוטאומיקס מלמעלה למטה.

CZE-MS/MS עדיין יש כמה מגבלות עבור פרוטאומיקס עמוק מלמעלה-למטה. למרות להדגים כי CZE-MS/MS יכול להגיע מעל 500proteoform חתימות e. coli פרוטאום בריצה יחיד, מספר proteoform חתימות קליע בודד CZE-MS/MS הוא רק בערך 50% מזה של המדינה-of-the-art RPLC-MS/MS34, 35. ב פרוטוקול זה, רק HCD משמש עבור פיצול חלבון, המוביל אל פיצול מוגבל הכיסויים של proteoforms מזוהה. מספר שיפורים יכולים להתבצע בפרוטוקול CZE-MS/MS כדי לשפר את המספר ואת האיכות של proteoform תעודות הזהות של קליע בודד CZE-MS/MS. ראשית, הגדלת אורך נימי ההפרדה צריך לספק חלון הפרדה רחבה יותר, שמוביל יותר proteoform חתימות. שנית, באמצעות ספקטרומטר מסה עם כוח פתרון הרבה יותר גבוה, סריקה מהירה יותר קצב ושיטות מרובים פיצול (למשל, HCD,36 אלקטרונים העברה דיסוציאציה [משוערת.],37 , אולטרה סגול פוטוליזה [UVPD]38 ) בהחלט תשפר את מספר proteoform תעודות זהות והן את הכיסויים פיצול של proteoforms מזוהה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מודים הקבוצתית של Heedeok הונג-במחלקה לכימיה, אוניברסיטת מישיגן, על בחביבות לספק את התאים Escherichia coli הניסויים. המחברים תודה את התמיכה הלאומית המכון כללי רפואי למדעים, במכון הלאומי של בריאות (NIH) דרך גרנט R01GM118470 (ל X. Liu), R01GM125991 גרנט (כדי ל' א' ו- X. Liu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fused silica capillary Polymicro Technologies 1068150017 50 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pellets Macron Fine Chemicals 7708-10 Corrosive
LC-MS grade water Fisher Scientific W6-1
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA48-1 Corrosive
Methanol Fisher Scientific A456-4 Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich M6514 Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acid Acros Organics 423805000 Highy toxic
Acrylamide Acros Organics 164855000 Toxic, health hazard
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678 Health hazard, Oxidizer
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Cytochrome C Sigma-Aldrich C7752
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
ß-casein Sgma-Aldrich C6905
Carbonic anhydrase Sigma-Aldrich C3934
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153
Urea Alfa Aesar 36428-36
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632 Health Hazard
Iodoacetamide Fisher Scientific AC122270250 Health Hazard
Formic Acid Fisher Scientific A117-50 Corrosive, Health Hazard
C4 trap column Sepax Technologies 110043-4001C 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
Acetonitrile Fisher Scientific A998SK-4 Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 1066-33-7
Nalgene rapid-flow filters Thermo Scientific 126-0020 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cells K-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich D8537
BCA assay Thermo Scientific 23250
Acetone Fisher Scientific A11-1
HPLC system for protein desalting Agilient 1260 Infinity II
Acetic Acid Fisher Scientific A38-212
CE autosampler CMP Scientific ECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interface CMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette puller Sutter Instruments P-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysis Branson 101063196 Model S-250A
Vaccum concentrator Thermo Fisher Scientific SPD131DDA-115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
  2. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
  3. Catherman, A. D., et al. Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence. Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).
  4. Cai, W., et al. Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy. Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).
  5. Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).
  6. Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. Capillary Zone Electrophoresis. Science. 222 (4621), 266-272 (1983).
  7. Keithley, R. B. Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism. Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).
  8. Han, X., et al. In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).
  9. Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests. Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).
  10. Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).
  11. Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).
  12. Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).
  13. Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes. Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).
  14. Sun, L., et al. Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).
  15. Aebersold, R., Morrison, H. D. Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).
  16. Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction. Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).
  17. Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).
  18. Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).
  19. Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms. Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).
  20. Busnel, J. M. High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis. Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).
  21. Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).
  22. Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry. Talanta. 146, 839-843 (2016).
  23. Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).
  24. Moini, M. Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip. Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).
  25. Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).
  26. Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
  27. McCool, E. N., et al. Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome. Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).
  28. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  29. TopPIC Suite. , Available from: http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/topfd/ (2017).
  30. Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).
  31. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  32. Methods - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: http://www.topdownproteomics.org/resources/methods/ (2018).
  33. Software - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: http://www.topdownproteomics.org/resources/software/ (2018).
  34. Ansong, C., et al. Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).
  35. Shen, Y., et al. High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics. Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).
  36. Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).
  37. Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).
  38. Shaw, J. B., et al. Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).

Tags

כימיה בעיה 140 מלמעלה למטה פרוטאומיקס אזור נימי אלקטרופורזה יינון ספקטרומטריית electrospray ספקטרומטר מסה טנדם proteoform Escherichia coli
בקנה מידה גדול פרוטאומיקס מלמעלה למטה באמצעות ספקטרומטר מסה של טנדם אלקטרופורזה של אזור נים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCool, E. N., Lubeckyj, R., Shen,… More

McCool, E. N., Lubeckyj, R., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (140), e58644, doi:10.3791/58644 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter