Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Storskaliga Top-down proteomik med kapillära zonen elektrofores Tandem Mass Spectrometry

Published: October 24, 2018 doi: 10.3791/58644
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2,3, 1
1Department of Chemistry, Michigan State University, 2Department of BioHealth Informatics, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 3Center for Computational Biology and Bioinformatics, Indiana University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Ett detaljerat protokoll beskrivs för separation, identifiering och karakterisering av proteoforms i protein prover med kapillära zonen elektrofores-elektrospray jonisering-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS). Protokollet kan användas för högupplösta karakterisering av proteoforms i enkla protein prover och storskalig kartläggning av proteoforms i komplexa proteomet prover.

Abstract

Kapillära zonen elektrofores-elektrospray jonisering-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) har erkänts som ett användbart verktyg för uppifrån proteomik som syftar till att karakterisera proteoforms i komplexa proteom. Dock tillämpningen av CZE-MS/MS för storskaliga uppifrån proteomik har hindrats av den låga prov-lastkapaciteten och smala avskiljande fönster för CZE. Här beskrivs ett protokoll med CZE-MS/MS med en mikroliter-skala prov-lastning volym och en 90-minuters avskiljande fönster för storskaliga uppifrån proteomik. CZE-MS/MS plattformen bygger på en linjär polyakrylamid (LPA)-belagda separation kapillär med extremt låga elektroosmotiska flödet, en dynamisk pH-junction-baserade online prov koncentration metod med en hög verkningsgrad för protein stapling, en Electro-kinetiskt pumpade slida flöde CE-MS gränssnitt med extremt hög känslighet och en ion trap masspektrometer med hög massa upplösning och scanningshastighet. Plattformen kan användas för högupplösta karakterisering av enkla intakt protein prover och storskaliga karakterisering av proteoforms i olika komplexa proteom. Som ett exempel demonstreras en mycket effektiv separering av en standard protein blandning och en mycket känslig detektion av många föroreningar med hjälp av plattformen. Ett annat exempel är denna plattform kan producera över 500 proteoform och 190 protein identifieringar från en Escherichia coli proteomet i en enda CZE-MS/MS kör.

Introduction

Top-down proteomik (TDP) syftar för storskaliga karakterisering av proteoforms inom en proteomet. TDP är beroende av effektiva vätska-fas separation av intakta proteiner före elektrospray jonisering-tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) analysen på grund av hög komplexitet och stor koncentration dynamiskt omfång av proteomet1,2 ,3,4,5. Kapillära zonen elektrofores (CZE) är en kraftfull teknik för separering av biomolekyler baserat på deras storlek-till-avgift nyckeltal6. CZE är relativt enkel, kräver endast en öppen tubulär-smält kiseldioxid kapillär, en bakgrund elektrolyt (BGE) och en strömförsörjning. Ett urval av intakta proteiner kan läsas in i kapillären med tryck eller spänning och separation initieras genom att doppa båda ändarna av kapillären i BGE och tillämpa en hög spänning. CZE kan närma sig extremt hög avskiljningsgrad (> en miljon teoretiska nivåer) för separation av biomolekyler7. CZE-MS har en drastiskt högre känslighet än allmänt använda omvänd fas vätskekromatografi (Byt)-MS för analys av intakta proteiner8. Även om CZE-MS har en stor potential för storskaliga uppifrån proteomik, har dess bred tillämpning i proteomik hindrats av flera frågor, inklusive en låg prov-lastkapacitet och smala avskiljande fönster. Typiska provet laddar volym i CZE är ca 1% av den totala kapillär, som vanligtvis motsvarar mindre än 100 nL9,10,11. Fönstret separation av CZE är vanligtvis mindre än 30 min på grund av den starka elektroosmotiska flöde (EOF)9,10. Dessa frågor begränsa CZE-MS/MS för identifiering av ett stort antal proteoforms och låg rikliga proteoforms från en komplex proteomet.

Mycket arbete har gjorts för att förbättra provet laddar volym av CZE via online prov koncentration metoder (t.ex., fasta fasen microextraction [SPME]12,13, fältet utökad prov stapling [FESS]9 , 11 , 14och dynamiska pH junction15,16,17,18). FESS och dynamiska pH junction är enklare än SPME, som endast kräver en betydande skillnad mellan prov bufferten och BGE i ledningsförmåga och pH. FESS sysselsätter en prov-buffert med mycket lägre ledningsförmåga än det BGE, leder till en stapling av analyter på gränsen mellan zonen prov och zonen BGE i kapillären. Dynamiska pH junction använder en grundläggande prov-plugg (t.ex., 50 mM hjorthornssalt, pH 8) och en sura BGE (t.ex., 5% [v/v] ättiksyra, pH 2,4) på båda sidor av provet kontakten. Efter ansökan av en hög positiv spänning i slutet injektion av kapillären uppstår titrering av grundläggande prov kontakten, med fokus på analyter till en tät kontakt innan de genomgick en CZE separation. Nyligen, gruppen Sun systematiskt jämfört FESS och dynamiska pH junction för online stapling av intakta proteiner, visar att dynamiska pH junction kunde producera mycket bättre prestanda än FESS för online koncentrationen av intakta proteiner när provvolymen injektion var 25% av totala kapillär volym19.

Neutralt belagda separation kapillärer (t.ex., linjär polyakrylamid [LPA]) har använts för att minska EOF i kapillären, sakta ner CZE separation och bredda den avskiljande fönster20,21. Nyligen, den Dovichi gruppen utvecklat ett enkelt förfarande för beredning av stabil LPA beläggning på den inre väggen av kapillärerna, utnyttja ammonium persulfatoxidation (APS) som initiativtagare och temperatur (50 ° C) för produktion av fria radikaler och polymerisation22 . Helt nyligen, gruppen sön anställd LPA-belagd avskiljandet kapillär och dynamiska pH junction metoden för CZE separation av intakta proteiner, når ett mikroliter-skala prov laddar volym och en 90-minuters avskiljande fönster19. Detta CZE-system öppnar dörren till använda CZE-MS/MS för storskaliga uppifrån proteomik.

CZE-MS kräver en mycket robust och känsliga gränssnitt till par CZE till MS. Tre CE-MS gränssnitt har varit väl utvecklade och kommersialiseras i CE-MS historia, och de är co-axial slida-flöde gränssnittet23, sheathless gränssnittet använder en porös spets som ESI emitter24, och electro-kinetiskt pumpade slida flöde gränssnitt25,26. De electro-kinetiskt pumpade slida-flöde-gränssnitt-baserade CZE-MS/MS har nått en låg zeptomole peptid upptäckt gräns9, över 10.000 peptid identifieringar (IDs) från HeLa cell proteomet i en enda kör14, en snabb karakterisering intakta proteiner11och mycket stabila och reproducerbara analyser av biomolekyler26. Nyligen, LPA-belagd separation kapillären, metoden dynamiska pH junction och electro-kinetiskt pumpade slida flöde gränssnittet användes för storskaliga uppifrån proteomik av en Escherichia coli (E. coli) proteomet19 ,27. CZE-MS/MS plattformen närmade sig över 500 proteoform IDs i en enda köra19 och nästan 6.000 proteoform IDs via koppling med storlek-utslagning kromatografi (SEK)-Byt fraktionering27. Resultaten visar tydligt CZE-MS/MS förmåga för storskaliga uppifrån proteomik.

Häri, beskrivs ett detaljerat förfarande för att använda CZE-MS/MS för storskaliga uppifrån proteomik. CZE-MS/MS systemet använder LPA-belagd kapillären att minska EOF i kapillären, dynamisk pH junction metoden för online koncentrationen av proteiner, electro-kinetiskt pumpade slida flöde gränssnittet för koppling CZE till MS, en orbitrap massa spektrometer för insamling av MS och MS/MS-spektra av proteiner och en TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform identifiering och karakterisering) programvara för proteoform-ID via databas sökning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av LPA beläggning på den inre väggen av Separation kapillären

  1. Förbehandling av kapillären
    1. Spola en smält kiseldioxid kapillär (120 cm i längd, 50 µm i innerdiameter [ID], 360 µm i ytterdiameter [o.d.]) successivt med 500 µL av 1 M natriumhydroxid, avjoniserat vatten, 1 M saltsyra, avjoniserat vatten och LC-MS grade metanol med en sprutpump.
    2. Torka kapillären med kvävgas (10 psi, ≥ 12 h) och fyll kapillären med 50% (v/v) 3-(Trimetoxysilyl) propyl form i metanol med en sprutpump. Försegla båda ändarna av kapillären med kisel gummi och odla det i rumstemperatur under minst 24 h.
      Obs: Detta steg, den inre väggen av kapillären är functionalized med C = C. längre inkubation resulterar i bättre kapillär beläggning på grund av en mer komplett reaktion.
    3. Skär en liten portion (~ 5 mm) av kapillären från båda ändarna med en köttyxa sten. Skölj kapillären med metanol (500 µL) med en sprutpump för att städa upp oreagerad reagensen. Torka kapillären med kvävgas (10 psi, ≥12 h).
  2. Beredning av LPA beläggning
    Obs: Detta tillvägagångssätt baseras på Zhu et al. 22 med smärre ändringar.
    1. Förbereda en akrylamid lösning (40 mg av akrylamid i 1 mL vatten) och ammonium persulfatoxidation (APS) lösning (5% [volymvikt] i vatten).
    2. Tillsätt 2-3 µL APS lösningen i 500 µL av akrylamid lösningen, vortex blandningen, och lufta det med kvävgas för 5 min att avlägsna syre i lösningen.
    3. Fyll blandningen i förbehandlade kapillären med en dammsugare, försegla båda ändarna av kapillären med kisel gummi och inkubera det i ett vattenbad vid 50 ° C i 40 min.
    4. Ta bort en liten del (~ 5 mm) av kapillären från båda ändarna med en köttyxa sten. Tryck den oreagerade lösning ur kapillären med vatten (200 µL), använder sprutpumpen.
      Anmärkning: Se till att polymeren sköt ur kapillären är en agaros gel-konsistens. En längre INKUBERINGSSTEGET (upp till ~ 45-50 min) kan resultera i en bättre kapillär beläggning. Med längre reaktion, kapillären kan bli blockerade och högt tryck krävs för att driva ut polymeren med vatten. En HPLC-pumpen kan användas för detta ändamål.

2. etsning av kapillären med fluorvätesyra

Varning: Använd lämpliga säkerhetsrutiner vid hantering av fluorvätesyra (HF) lösningar. Alla HF-relaterade åtgärder måste göras i en kemisk huva. Innan en HF-relaterad åtgärd, kontrollera att 2,5% kalcium gluconate gel är tillgängliga för användning vid exponering. Dubbla handskar krävs, en typisk nitrilhandske inuti och en tung neopren handske utanför. Bära en labbrock och kemiska skyddsglasögon. Efter HF operationer, hålla flytande och fasta farligt avfall separat. Det flytande HF-avfallet måste neutraliseras omedelbart med en högkoncentrerad natriumhydroxidlösning för tillfällig lagring före avfall upphämtning. Solid HF avfallet behöver lagras tillfälligt i en plastbehållare som är fodrad med två tjocka plast en-gallon Ziploc påsar och ett lock. Både i fast och flytande avfall måste märkas ordentligt.

  1. Bränna en del av kapillären använder en skonsam låga (t.ex.pocket lättare) att ta bort polyimid yttre-beläggning (1 cm i längd) ca 4 cm från ena änden av kapillären. Försiktigt rengöra brända portion av kapillären genom att torka för att ta bort den polyimid beläggning helt.
    Obs: Fortsätt med försiktighet, som delen av kapillären utan polyimid beläggningen kommer att vara lite ömtåliga.
  2. Borra ett litet hål i slutet av en 200-µL röret runt samma storlek som kapillär ytterdiametern att hålla tillräckligt kapillären på plats när det är gängade genom detta hål. Tråd i slutet av kapillären som ligger nära den brända delen genom hålet tills brända portion är i röret.
    Obs: Det rekommenderas att testa storleken på hålet med slutet av kapillären från den brända delen för att säkerställa rätt storlek, som brända portion av kapillären är bräcklig.
  3. Tillsätt ~ 150 µL av HF (48-51% lösning i vatten) till 200-µL röret så att HF lösningen är om halvvägs upp den brända delen i kapillären. Inkubera kapillären i HF lösningen vid rumstemperatur för 90-100 min.
    Obs: Det rekommenderas att ett annat hål skapas i locket på röret och några små objekt (t.ex., en liten pipettspetsen) används för att hålla upp röret medan inkubering sker. Pipettspetsen kan användas för att punktera skum eller någon annan fast plattform från vilken reaktionskammaren kan hänga från, att skapa en trygg miljö. Placera pappershanddukar under röret som innehåller HF och följ korrekta förfaranden vid spill.
  4. Ta bort kapillären från röret och tvätta utsidan med avjoniserat vatten för att avlägsna eventuella kvarvarande HF.
    Anmärkning: Se till att den yttre diametern av kapillären på den smalaste delen av den brända delen är nu mindre än 100 µm, som sig bör.
  5. Skär den etsade del av kapillären i mitten av den smalaste delen med en köttyxa sten som producerar en separation kapillär med mindre än 100 µm i OD i ena änden. Skär i icke-etsade slutet av kapillären till få en 1-m separation kapillär.
    Obs: Kassera HF avfall enligt protokollet institutionellt föreskrivna.

3. beredning av proverna

  1. Beredning av en standard protein blandning
    1. Förbereda en standard protein blandning som innehåller cytokrom c (Cyto.c, 12 kDa, 0,1 mg/mL), lysozym (14,3 kDa, 0,1 mg/mL), β-kasein (24 kDa, 0,4 mg/mL), myoglobin (16,9 kDa, 0,1 mg/mL), karbanhydras (CA, 29 kDa, 0,5 mg/mL) och bovint serumalbumin (BSA, 66,5 kDa 1,0 mg/mL) i LC-MS grade vatten som en stamlösning.
      Obs: Stamlösning kan vara aliquoted och lagras vid-80 ° C för användning.
    2. Späd stamlösningen med en faktor på 10 med en 50 mM ammoniumbikarbonatlösning (pH 8,0) i LC-MS grade vatten för CZE-MS analys.
      Obs: Filtrera hjorthornssalt lösningen före användning med ett membranfilter (t.ex., 0,2 µm cellulosanitrat membran och 50 mm i diameter).
  2. Beredningen av en E. coli -prov
    1. Kultur E. coli (k-12 MG1655) celler i LB medium vid 37 ° C under omskakning vid 225 rpm tills värdet OD600 närmar sig 0,7. Samla E. coli celler viacentrifugering (3 283 x g, 10 min) och tvätta dem flera gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) ta bort medlet.
    2. Avbryta E. coli celler i den lyseringsbuffert innehållande 8 M urea, proteashämmare och 100 mM ammoniumbikarbonat (pH 8,0) och ultrasonicate på is för 15 min med en ultraljud cell disruptor med en kopp horn för komplett cellys.
      1. Inställt 50 Intermittens (%) och Ställ in Output Control på 7 för ultraljud cell disruptor.
    3. Centrifugera det lysate vid 18.000 x g i 10 min. samla supernatanten och kassera pelleten. Använd en liten delmängd av supernatanten för protein koncentrationsmätning med bicinchoninic syra (BCA) analys.
      Obs: Lysate behov spädas minst med en faktor tre att minska urea koncentrationen lägre än 3 M för att bli kompatibel med BCA-analys. BCA analysen utförs utifrån tillverkarens förfarande.
    4. Blanda 1 mg av E. coli proteiner med kall aceton med en volym-förhållande av 1:4 och hålla blandningen vid-20 ° C över natten för att fälla ut proteiner.
      Obs: Utför alla experiment med aceton i en kemisk huva.
    5. Snurra ner utfällda proteiner (12 000 x g, 5 min) och avlägsna supernatanten. Tvätta pelleten med kall aceton igen (samma volym som tidigare) och snurra ner igen.
    6. Avlägsna supernatanten och låt pelleten lufttorka i kemisk huva för ett par minuter.
      Obs: Inte overdry protein pelleten.
    7. Upplösa den utfällda E. coli -proteiner (1 mg) i 200 µL av 8 M urea i 100 mM ammoniumbikarbonat (pH 8,0).
    8. Denaturering, minska och Alkylatbensin provet.
      1. Inkubera provet vid 37 ° C i 30 min att denaturera proteiner.
      2. Minska med Ditiotreitol (DTT) genom att lägga 2 µL 1 M DTT lösning (i 100 mM ammoniumbikarbonat) i provet och ruvning provet vid 37 ° C i 30 min.
      3. Alkylatbensin proteinerna med iodoacetamide (IAA) genom att lägga till 6 µL 1 M IAA lösning (i 100 mM ammoniumbikarbonat) till provet och inkubera provet för 20 min i rumstemperatur i mörkret.
      4. Släcka den överskjutande IAA med DTT genom att lägga till 2 µL 1 M DTT lösning och inkubera i 5 min i rumstemperatur. Gör filtratet surt provet med myrsyra (FA) att få FA koncentration på 1% (v/v).
        Obs: Minskning och alkylering utförs stöd unfoldingen av proteiner för nedströms fragmentering. Dessa steg kommer att förlora information om disulfide obligationer. Om målet är att studera de disulfide obligationerna på proteiner, undvika dessa steg. Kom ihåg att hantera alla koncentrerade sura lösningar i en kemisk huva.
    9. Avsalta provet med en C4 fälla kolumn (t.ex., 4 mm av i.d., 10 mm i längd, packad med 3 µm partiklar att ha 300-Å porer) med en HPLC-system. Använda en UV-detektor vid en våglängd på 254 nm för upptäckt.
      1. Ange det mobila fas flödet till 1 mL/min. Aktivera kolumnen genom att spola det med 80% (v/v) acetonitril (ACN), 0,1% FA i vatten i 10 minuter och låt jämvikta genom att spola den med 2% (v/v) ACN, 0,1% FA i vatten i ca 10 min.
      2. Ladda 500-µg proteiner på kolumnen och avsalta genom att spola dem med 2% (v/v) ACN, 0,1% FA i vatten i ca 10 min flödeshastighet 1 mL/min.
      3. Eluera proteinerna med 80% (v/v) ACN, 0,1% FA i vatten för 3 min flödeshastighet 1 mL/min. Samla eluatet och lyophilize det med en vakuum koncentrator.
        Obs: Kolumnen C4 fällan kan användas för att avsalta stora mängder proteiner men inte låg mikrogram av proteiner på grund av möjliga prov förlust. För begränsad protein material, överväga att använda pipettspetsar med C4 media för protein avsaltning. Var noga med att inte overdry proteinerna när frystorkning provet.
    10. Lös de 500 µg av proteiner (förutsatt att inga prov förlust under provpreparering) i 250 µL av 50 mM ammoniumbikarbonat (pH 8,0) för CZE-MS experiment.

4. uppställning av CZE-MS/MS-systemet och analys av proverna

  1. Uppbyggnaden av systemet CZE
    1. Förbereda en BGE som innehåller 5% eller 10% (v/v) ättiksyra (pH ~2.4 eller ~ 2.2) i LC-MS grade vatten. Sätta ~1.5 mL BGE i BGE injektionsflaska som matchar med buffertbrickan av den CZE autosampler.
      Notera: Se färska BGE varje vecka och ändra BGE lösningen i injektionsflaskan varje dag att undvika.
    2. Tillsätt en provlösning (5-200 µL) till en Infoga röret och sätta in röret i ett prov injektionsflaska thatmatches med prov facket av den CZE autosampler.
    3. Läsa in provet, BGE och separation kapillär i den CZE autosampler.
      Obs: Språket som används i detta protokoll mest korrekt återspeglar användningen av en viss autosampler (se Tabell för material), men principerna kan tillämpas på andra autosamplers.
      1. Välj prov Ladda manuell kontroll sidan i den CZE autosampler. Läsa in BGE injektionsflaskan i buffertbrickan av den autosampler, att notera sin position i buffertbrickan. Ladda urval injektionsflaskan i provet facket på den autosampler, att notera sin position i provet facket.
        Obs: Instrumentet kan drivas i manuell kontroll genom att klicka på bilden av instrumentet för Enhetens bildskärm på sidan huvudinstrument och sedan välja manuell under Direktkontroll.
      2. Läsa in separation kapillären i den CZE autosampler, använda icke-etsade slutet av kapillären. Sätta autosampler för justering position med hjälp av manuell kontroll. Tråd i icke-etsade slutet av kapillären i ett hål som används för att hålla avskiljandet kapillär tills det inte kan vara fysiskt gängade ytterligare.
        Obs: I detta fall slutet av kapillären är nästan i samma höjd som i slutet av elektroden och minst 50 µL av provet krävs i injektionsflaskan med prov för att kontrollera slutet av kapillären är nedsänkt i provet under injektionen. Om provvolymen är låg (dvs, 5 µL), höjden av injektion slutet av kapillär behöver justeras enligt beskrivningen i steg 4.1.3.2.1.
        1. Justera höjden på injektion slutet av kapillären om provvolymen är lägre än 50 µL (dvs, 5 µL). Växla till autosampler till Standby med manuell kontroll. Skriva provet positionen i systemet och flytta kapillären till provet. Tryck i injektion slutet av kapillären vidare ner till nå botten av injektionsflaskan med provet.
          Obs: I det här fallet prov injektion kan utföras med ett urval av endast 5 µL i injektionsflaskan.
      3. Fortsätter att använda den manuella kontrollen, spola kapillären med den BGE för 20 min, med ett tryck på 20 psi.
  2. Uppställning av gränssnittet CZE-MS
    1. Dra en kapillär borosilikatglas (1 mm i ytterdiameter, 0,75 mm i.d., 10 cm lång) i elektrospray utsläppsländer med en öppning av 20-40 µm i OD
      Obs: Hålla elektrospray utsändaren som 4-5 cm längd och skär den med en köttyxa sten om det behövs. Kassera alla glas avfall i en behållare. Inställningarna för att få 20 till 40-µm tips är följande. Ställ in värmen till 498, dra till 5, hastigheten till 10, förseningen till 150, och trycket till 200. Kontrollera storleken på sändarna med Mikroskop före användning. Justera parametrarna något vid behov.
    2. Montera en kommersiell electro-kinetiskt pumpade slida flöde gränssnitt (se Tabell för material) på framsidan av masspektrometer. Fyll slida buffert behållaren med en buffert innehållande 10% (v/v) metanol och 0,2% (v/v) FA i LC-MS grade vatten.
    3. Spola av T i gränssnittet med den slida buffer via påtryckningsmedel manuellt med en spruta. Gänga 1-mm-OD slutet av en elektrospray utsändare genom en ärm slangen och Anslut sändaren med en port av de Tvia en passande. Helt enkelt spola T manuellt igen med en spruta för att fylla emitter med slida bufferten.
    4. Justera avståndet mellan öppningen av sändaren och ingången till masspektrometer till ~ 2 mm med hjälp av kameran som kom med gränssnittet. Applicera en 2 - till 2.2-kV spänning på injektionsflaskan slida buffert för elektrospray. Justera spray spänningen för att nå en stabil elektrospray.
      Obs: Om ingen elektrospray eller en instabil elektrospray observeras, kontrollera gränssnittet för att se till att det finns inga stora bubblor i sändaren, i Toch i slangen som används för att ansluta slida buffert injektionsflaskan och T. Avståndet mellan öppningen av sändaren och masspektrometer ingången kan grovt uppskattas genom att jämföra det med de 1 mm ytterdiameter av sändaren. Spray spänningen beror på storleken på sändaren. Efter 20 till 40-µm sändare är 2-2.2 kV tillräckligt bra. Kom ihåg att alltid vara försiktig när du använder höga spänningar.
    5. Stäng av spray spänningen och försiktigt tråd etsade slutet av separation kapillär genom T in sändaren tills det inte går att trycka ytterligare. Applicera ett lågt tryck (dvs, 5 psi) i slutet av kapillären injektion under denna process så att det finns inga bubblor i kapillären.
      Obs: Kapillären är ansluten till den T via en ärm slangar och en passande. Justera positionen av etsade slutet av kapillären i sändaren med hjälp av kameran inom 500 µm. Avståndet kan grovt uppskattas genom att jämföra det med de 1 mm ytterdiameter av sändaren.
    6. Stoppa det låga trycket i slutet injektion av kapillären. Spola emitter lite med slida bufferten. Igen, applicera 2-2.2 kV spray spänning för att testa spray.
  3. Uppbyggnaden av en CZE metod för prov injektion, separation, kapillär spolning och utlösning av masspektrometer för datainsamling
    1. Välj ny metod under fil nedrullningsbara menyn på skärmen huvudinstrument att inleda en ny metod.
    2. Välj inlopp som SV/EV, facket som prov, trycket som 5 psi, KV som 0 och varaktighet som 95 s för prov injektion.
      Obs: Provet injiceras i den kapillära via påtryckningsmedel. Provvolymen injektion kan beräknas baserat på trycket och injektion tiden med hjälp av Poiseuilles lag. Till exempel 5 psi för 95-s prov injektion motsvarar ca 500 nL av prov-lastning volymen för en 1 m lång separation kapillär (50 µm i.d.).
    3. Välj parametrar för CZE separation och ställa in parametrar för att utlösa dataförvärvet.
      1. Ange inlopp som InV, facket som buffert, trycket som 0 psi, KV som 30 och varaktighet som 4.200 s för separation av standard protein blandning provet. Ange inlopp som InV, facket som buffert, trycket som 0 psi, KV som 20 och varaktighet som 6 600 s för separation av E. coli proteomet provet.
        Obs: Den spänning som tillämpas för separation kan justeras baserat på prov komplexitet. För enkla protein prover, 30 kV kan användas för att påskynda analys. För komplexa prover, 20 kV används för att bromsa separation och förvärva mer MS/MS spectra för proteoform IDs.
      2. Ställa in parametrar för att utlösa dataförvärvet under Timed Events. Ställ in tid (s) som 0,0 och typ som relä 1 för Aktivera i steg 1. Ställ in tid (s) som 1.0 och typ som relä 1 för deaktivering i steg 2.
    4. Välj inlopp som InV, facket som buffert, trycket som 10 psi, KV som 30 och varaktighet som 600 s för kapillär spolning.
    5. Spara filerna metod för CZE-MS och MS/MS experiment.
  4. Installation av MS och MS/MS
    1. Ställ in parametrarna MS och MS/MS för intakt proteinanalys med hjälp av en quadrupole-ion trap masspektrometer (se Tabell för material).
      Obs: Den positiva jonen läge och högre energi lett dissociation (HCD) för fragmentering är anställda.
      1. Justera tune filen inställningar: aktivera intakt protein-läge och använda ett svällning tryck på 0,2. Ange ion överföringen kapillär temperatur till 320 ° C och s-objektiv RF nivå 55.
      2. Bygga filen MS och MS/MS metod.
        1. För full MS, ange antalet microscans till 3, fastheten till 240 000 (på m/z 200), Automatisk gain control (AGC) målvärde 1E6, maximal injektion tiden till 50 ms och scan intervallet till 600-2000 m/z.
      3. För MS/MS, använda data-beroende förvärv (DDA) för de åtta mest intensiva jonerna i ett fullspektrum MS. Ställ fönstret isolering till 4 m/z och normaliserade lett energi (NCE) till 20%. Ange antalet microscans 1, fastheten till 120.000 (på m/z 200), AGC målvärdet för 1E5 och maximal injektion tid att 200 ms.
      4. Ange intensitet tröskeln för att utlösa fragmentering till 1E5 och ange jonerna med en kostnad stat högre än 5 ska isoleras för fragmentering. Aktivera den utesluta isotoper och ange dynamiska uteslutande till 30 s.
        Anmärkning: Antalet microscans för MS/MS kan ökas till 3. I det här fallet kan en Top3 DDA metod användas för att minska cykeltiden.
    2. Ställa in en trådbunden anslutning mellan den CE autosampler och masspektrometer för automatisk utlösning av dataförvärvet. Anslut ena änden av en tråd till 1 reläkontakt A och relä 1 kontakt B på baksidan av den CE autosampler. Anslut den andra änden av kabeln till Starta i - och starta i + på sidan av masspektrometer.
  5. CZE-MS/MS experiment och analys av proverna
    1. Applicera 30 kV använda CE manuell kontroll i prov injektion slutet och 2-2.2 kV på skidan buffert injektionsflaskan med den externa strömförsörjningen för att testa separation kapillär och elektrospray.
      Obs: Separationen nuvarande, i det här fallet är runt 8-9 µA om 5% (v/v) ättiksyra används som BGE.
    2. Ställa in en data förvärv sekvens på masspektrometer datorn genom att välja en ny sekvens.
      1. Välj okänd som provtypen och ange ett filnamn och sökväg. Ange den MS metoden som ska användas för varje prov som körs under Instrument metod.
        Obs: Eftersom det finns en separat dator för att styra den CE autosampler, provposition behöver inte anges här.
    3. Ställa in en CZE separation sekvens på CE datorn att ange positionen buffert, provposition och metoden CZE. Starta en ny sekvens, välja sekvens under analys nedrullningsbara menyn på sidan huvudinstrument.
    4. Starta data förvärvsmetoden på masspektrometer datorn först genom att välja Kör sekvens (eller köra prov för enstaka körningar). Starta sedan sekvensen CE på CE autosampler datorn.
      Obs: När separation spänningen är på efter prov injektion, en signal skickas från den CE autosampler till masspektrometer för att utlösa dataförvärvet. Avskiljandet nuvarande kommer att minska i början under separationen på grund av den dynamiska pH junction prov stapling. Sedan nuvarande återhämtar sig gradvis.

5. databas sökning av insamlade Raw-filer med programvaran TopPIC

  1. Överföra .raw filer, inklusive MS och MS/MS data, från masspektrometer datorn till en dator tillägnad databas sökning.
    Obs: Dessa .raw filer kan vara stor och kräver en kraftfull dator för att nå en snabb databas sökning.
  2. Ladda ner ProteoWizard och TopPIC suite på datorn tillägnad databas sökning.
    Obs: ProteoWizard och TopPIC suite är öppen källkod och kan hittas online (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net; TopPIC suite: http://proteomics.informatics.iupui.e.,u/software/toppic/). UniProt databaser används för databassökningar och kan hittas på webbplatsen UniProt.
  3. Konvertera .raw filer till .mzML filer med msconvert, en MS fil format konverteringsverktyg i ProteoWizard28. I GUI av msconvert (MSConvertGUI.exe), klicka på knappen Bläddra och välj den .raw-fil som ska konverteras. Välj mzML som utdataformat och hålla alla andra alternativ på sina standardvärden. Klicka på Start längst ner till höger i gränssnittet.
  4. Konvertera de .mzML till .msalign filer med verktyget TopFD i TopPIC suite29.
    1. I den GUI av TopFD (topfd_gui.exe), klicka på filen och välj den .mzML-fil som skapas i föregående steg. Hålla standardvärdena för parametrarna och klicka sedan på knappen Starta längst ned till höger i gränssnittet.
      Obs: TopFD konverterar föregångare och fragment isotopiska kluster till monoisotopic massorna och identifierar möjliga proteoform funktioner i MS1 data genom att kombinera föregångare isotopiska kluster med liknande monoisotopic massa och nära migreringstiden. Tre filer kommer att genereras från TopFD, inklusive en ms1.msalign-fil, en ms2.msalign-fil och en .feature-fil. Filerna ms1.msalign och ms2.msalign innehåller deconvoluted monoisotopic massa MS1 och MS/MS-spektra, respektive. Filen .feature innehåller möjliga proteoform funktioner.
  5. Utför en sökning med TopPIC (version 1.1.3) i TopPIC suite30.
    1. Klicka på databasfilen i TopPIC GUI (toppic_gui.exe), och välj en lämplig databas för sökning.
    2. Klicka på Spectrum file och välj filen ms2.msalign som genereras i steg 5.4.1 som indata. Välj MS1 funktionen fil och välj filen .feature som genereras i steg 5.4.1.
    3. Ange cystein carbamidomethylation (C57) som en fast ändring på grund av IAA behandling.
      Obs: En textfil kan också skapas med olika fasta ändringar av en textredigerare. Textfilen kan sedan väljas med hjälp av fil -knappen bredvid fast ändringar i TopPIC GUI.
    4. Välj funktionen Decoy databas och under cutoff inställningar, markerar FDR (false discovery rate) i den nedrullningsbara menyn bredvid spektrum nivå. Ange FDR till 0,01 på nivån spektrum och 0,05 på proteoform nivå.
      Obs: TopPIC erbjuder flera alternativ för att filtrera resultaten: spektrum-nivå FDR, proteoform-nivå FDR eller båda. FDR utvärderas baserat på target-decoy strategi31.
    5. Lämna generera funktion omarkerad och ange feltolerans (ppm) till 15.
    6. Välj 2 för antalet tillåtna massa förskjutningar i den nedrullningsbara menyn under Avancerade parametrar. Ange den maximala massa Skift (Da) okänd modifieringar av 500 Da. lämna alla andra parametrar på standardvärdena och klicka på knappen Starta längst höger GUI.
      Obs: TopPIC programvaran genererar två textfilerna. Filen med suffixet. OUTPUT_TABLE innehåller listan över identifierade proteoform-spektrum matcher (PrSMs), och en med ett suffix. FORM_OUTPUT_TABLE innehåller listan över identifierade proteoforms. För varje PrSM, programvaran ger allmän information om matchen, observerade fragmentering mönster, matchade fragment joner och upptäckta massa skiftar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 visar ett diagram över det dynamiska-pH-junction-baserade CZE-ESI-MS system som används i experimentet. En lång propp av provet i en grundläggande buffert injiceras i en LPA-belagd separation kapillär fylld med en syrlig BGE. Efter applicering höga spänningar kommer att I och II, analyter i zonen prov vara koncentrerad via dynamiska pH junction metoden. För att utvärdera systemets CZE-MS, analyseras en standard protein blandning (cytokrom c, lysozym, β-kasein, myoglobin, CA och BSA) vanligtvis. Den representativa elektroferogram för standard protein blandningen visas i figur 2A. Standard protein blandningen körs vanligtvis minst i dubblett att utvärdera avskiljningsgrad och reproducerbarhet av systemet. Separation effektivitet kan utvärderas med antalet teoretiska nivåer av vissa proteiner, som visas i figur 2B. Reproducerbarheten kan utvärderas av de relativa standardavvikelserna protein intensitet och migration tid. Figur 3 A visar en inzoomad bild av ett elektroferogram av E. coli protein provet analyseras av den dynamiska pH-junction-baserade CZE-MS/MS. Normaliserad nivå (NL) protein intensiteten bör vara på skalan av 108 om 1 µg av E. coli proteiner är laddade för analys med en quadrupole ion trap masspektrometer. En inzoomad vy av elektroferogram kan användas för att bedöma fönstret separation av systemet. I detta fall är fönstret separation 80-90 min. figur 3B visar ett exempel PrSM, inklusive allmän motsvarande proteoform information, proteinsekvens, observerade fragmentering mönster och ändringar. Mycket låg E-värdet (2.11E-48) och spektrala FDR (0) föreslår det högt förtroendet av proteoform-ID. Det höga antalet matchade fragment joner (60) ytterligare indikerar höga förtroende i ID. Observerade fragmentering mönstret visar att splittringen av proteoform är mycket effektiv som täcker termini och mellersta delen av proteoform. Den N-terminala klyvningen av tre aminosyror (MTM) bestäms genom databas sökning.

Figure 1
Figur 1 : Diagram av dynamiska pH-junction-baserade CZE-ESI-MS systemet. Provet löses i 50 mM hjorthornssalt, pH 8. På BGE är 5% eller 10% (v/v) ättiksyra, pH ~2.4 eller ~ 2.2. En 1-m LPA-belagd kapillär används för separation. Ett electro-kinetiskt pumpade slida flöde gränssnitt används för att par CZE till MS. En quadrupole ion trap masspektrometer används. Den höga spänningen jag (HV jag) tillhandahålls av strömförsörjningen integreras i de CE autosampler för separation. Högspänning II (HV II) tillhandahålls av en separat strömförsörjning för elektrospray. Masspektrometer är jordad. Avståndet mellan öppningen av sändaren och ingången till masspektrometer är ~ 2 mm. Avståndet mellan slutet av etsade kapillären i sändaren och öppningen av sändaren är mindre än 500 µm. Storleken på öppningen av elektrospray sändaren är 20-40 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Data av en standard protein blandning analyseras av den dynamiska pH-junction-baserade CZE-MS. (A) denna panel visar en bas peak elektroferogram. (B), här panelen visar antalet teoretiska nivåer (N) av tre proteiner. Provvolymen injektion var 500 nL. HV jag var 30 kV för separation och HV II var 2,2 kV för elektrospray. På BGE var 5% (v/v) ättiksyra, pH 2,4. Provet var i 50 mM ammoniumbikarbonat (pH 8) och innehåller cytokrom c (0,01 mg/mL), lysozym (0,01 mg/mL), β-kasein (0,04 mg/mL), myoglobin (0,01 mg/mL), karbanhydras (CA, 0,05 mg/mL) och bovint serumalbumin (BSA, 0,1 mg/mL). Ingen MS/MS-spektra förvärvades för standard protein blandning provet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Data av det e. coli proteomeanalyzed av den dynamiska pH-junction-baserade CZE-MS/MS. (A) denna panel visar en inzoomad vy av den baserade peak elektroferogram av den E. coli protein provet. (B) i denna panel visas ett exempel PrSM identifieras genom TopPIC databas sökandet av de förvärvade MS/MS-spektra. Den allmänna motsvarande proteoform informationen, proteinsekvens, observerade fragmentering mönster och ändringar presenteras. De matchade fragment jonerna från enskilda PrSM kan också ses om det behövs. HV var jag 20 kV för separation och HV II var 2,2 kV för elektrospray. På BGE var 10% (v/v) ättiksyra, pH ~ 2.2. Provet var i 50 mM ammoniumbikarbonat (pH 8) och protein koncentrationen var 2 mg/mL. Provvolymen injektion var 500 nL. En top8 DDA metod användes för att förvärva data. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att använda CZE-MS/MS för högupplösta karakterisering av proteoforms i enkla protein prover och storskaliga identifiering av proteoforms i komplexa proteomet prover. Ett diagram över det CZE-ESI-MS/MS-systemet visas i figur 1. Det finns fyra kritiska steg i protokollet. Först, utarbetandet av högkvalitativa LPA beläggning på den inre väggen av separation kapillär är oerhört viktigt. En kapillär LPA-belagd separation kan minska EOF i kapillären, bredda fönstret separation av CZE och minska protein adsorption på dess inre väggen19. Polymerisation reaktionen för LPA beläggningen är utförs via fyllning kapillären med en blandning av akrylamid (monomer) och ammonium persulfatoxidation (polymerisation initieraren), följt av värme kapillären i vattenbad att utlösa den reaktion22. Tidpunkten i vattenbad är kritisk. Alltför kort reaktion tid kommer att leda till ofullständig reaktion och dålig beläggning. Vi tillåter vanligtvis reaktionen till gruppinterna till 50 minuter, så att reaktionen att fortsätta under en längre period för en bättre beläggning. Med längre reaktion, kapillären kan bli blockerade och en HPLC-pump kan behöva användas för att driva ut polymeren inne i kapillären med vatten. En LPA-belagd kapillär användas kontinuerligt för ca en vecka, baserat på litteraturdata och vår erfarenhet22.

Den andra kritiska steget är koppling CZE till MS med electro-kinetiskt pumpade slida flödet CE-MS interface25,26. Avståndet mellan slutet av avskiljandet kapillär i ESI-sändaren och emitter öppningen påverkar känsligheten i CZE-MS betydligt, och en kortare sträcka ger en högre känslighet25. I slutet av separation kapillär behöver etsas med HF, att minska dess yttre diameter från 360 µm till högst 100 µm, så att i slutet av kapillären att skjutas nära emitter öppningen. Avståndet mellan sändare öppning och masspektrometer ingången har optimerats för att nå bästa känslighet och bra stabilitet26. Vanligtvis håller vi avståndet runt 2 mm.

Den tredje kritiska steget är CZE-MS och MS/MS-analys med dynamisk pH-junction-baserade online prov stapling19. PH-värdet i provet bufferten och BGE behöver vara väsentligt annorlunda för att säkerställa effektiv prov stapling. Koncentrationen av protein i provet måste vara lämpliga. Om protein koncentrationen är för hög, kan proteinerna utlösas i kapillären under provet stapling. Protein koncentrationerna av de prover som används för figurerna 2 och 3 kan anses vara typiska exempel. Det sista kritiska steget är databas sökningen med TopPIC för proteoform ID30. Flera steg som krävs för filkonverteringar innan databas sökningen med TopPIC kan utföras. En ordentlig FDR-filtret är nödvändiga för att säkerställa kvaliteten på de identifierade proteoforms. Vi använder vanligtvis en 1% spektrum-nivå FDR att filtrera sökresultaten databas. Vi noterar att initiativet uppifrån proteomik är en mycket bra resurs för uppifrån proteomikmetoder och data analys programvara32,33.

Vi måste notera att vissa delar av protokollet kan behöva modifieras något och lite felsökning kan krävas. Tidpunkten för polymerisation i vattenbad för beredning av LPA beläggningen kan variera på olika labb. Tiden för HF etsning av separation kapillär behöva ändras något på grund av annan temperatur i olika övningar. När du konfigurerar gränssnittet CE-MS, kontrollera elektrospray är stabil innan gängning separation kapillären till elektrospray utsändaren. Om ingen elektrospray eller en instabil elektrospray observeras, kontrollera gränssnittet för att se till att det finns inga stora bubblor i sändaren, i Teller i slangen som används för att ansluta slida buffert injektionsflaskan och T. Dessutom, avståndet mellan öppningen av sändaren och masspektrometer ingången kan påverka elektrospray stabilitet och är vanligtvis ca 2 mm. Elektrospray spänningen kan också påverka spray stabiliteten. Efter 20 till 40-µm sändare är 2-2.2 kV oftast tillräckligt bra. Som beskrivits i föregående punkt, måste protein koncentrationen i provet vara lämpliga. Om protein koncentrationen är för hög, kan proteinerna utlösas i kapillären under provet stapling. Uppmärksamma den aktuella profilen på CE autosampler datorn. Om strömmen är noll vid början av CZE körningen, betyder det att en propp av luft sprutas in i kapillären under prov injektion steg. Kontrollera att volymen av provet i injektionsflaskan är tillräckligt stor. Om strömmen är normal i början och plötsligt blir noll under körning, betyder det oftast att protein koncentrationen är för hög.

CZE-MS/MS baserat på detta protokoll möjliggör högupplöst karakterisering av enkla protein prover och de storskaliga uppifrån proteomik av komplexa proteom. Som ett exempel närmade CZE-MS högupplösta karakterisering av en standard protein blandning som innehåller sex proteiner19. Som visas i figur 2, CZE-MS tydligt separerade de sex proteinerna med en hög avskiljningsgrad, avslöjade tre former av β-kasein och upptäckt många föroreningar. Ett annat exempel gav single shot CZE-MS/MS reproducibly över 500 proteoform IDs och 190 protein-ID från det E. coli proteomet, med endast 1 µg av E. coli -proteiner med en 1% spektrum-nivå FDR19. CZE-MS/MS förbättrade antalet proteoform-ID från en komplex proteomet av minst tre gånger, jämfört med tidigare single shot CZE-MS/MS studier. Som visas i figur 3A, nådde den CZE-MS/MS samtidigt en 500-nL prov-lastning volym och ett 90-min separation fönster för analys av E. coli proteomet19. TopPIC programvaran kan ge omfattande information om de identifierade proteoforms (figur 3B). CZE-MS/MS systemet ger gemenskapens proteomik med ett användbart verktyg för storskaliga och högupplösta uppifrån proteomik.

CZE-MS/MS fortfarande har vissa begränsningar för djupt uppifrån proteomik. Även om vi visat att CZE-MS/MS kan nå över 500proteoform-ID från det E. coli proteomet i en enda körning, är antalet proteoform-ID från single shot CZE-MS/MS bara ungefär 50% av som från state-of-the-art Byt-MS/MS34, 35. I detta protokoll används endast HCD för protein fragmentering, vilket leder till begränsad fragmentering omfattningar av identifierade proteoforms. Flera förbättringar kan göras i CZE-MS/MS-protokollet att förbättra både antalet och kvaliteten på proteoform-ID från single shot CZE-MS/MS. Först, öka längden på separation kapillär bör ge ett bredare avskiljande fönster, leder till mer proteoform IDs. För det andra, med en masspektrometer med en mycket högre upplösningsförmåga, snabbare Skanna hastighet och flera fragmentering metoder (t.ex., HCD,36 elektron överföring dissociation [ETD],37 och ultraviolett vattenmolekylens [UVPD]38 ) säkerligen kommer att förbättra både antalet proteoform IDs och fragmentering grupperingen av identifierade proteoforms.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Författarna tackar Heedeok Hongs grupp vid Institutionen för kemi, Michigan State University, för vänligt att ge Escherichia coli celler för experiment. Författarna vill tacka stöd från National Institute of General Medical Sciences, National Institutes of Health (NIH) genom Grant R01GM118470 (till X. Liu) och Grant R01GM125991 (till L. Sun och X. Liu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fused silica capillary Polymicro Technologies 1068150017 50 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pellets Macron Fine Chemicals 7708-10 Corrosive
LC-MS grade water Fisher Scientific W6-1
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA48-1 Corrosive
Methanol Fisher Scientific A456-4 Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich M6514 Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acid Acros Organics 423805000 Highy toxic
Acrylamide Acros Organics 164855000 Toxic, health hazard
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678 Health hazard, Oxidizer
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Cytochrome C Sigma-Aldrich C7752
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
ß-casein Sgma-Aldrich C6905
Carbonic anhydrase Sigma-Aldrich C3934
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153
Urea Alfa Aesar 36428-36
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632 Health Hazard
Iodoacetamide Fisher Scientific AC122270250 Health Hazard
Formic Acid Fisher Scientific A117-50 Corrosive, Health Hazard
C4 trap column Sepax Technologies 110043-4001C 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
Acetonitrile Fisher Scientific A998SK-4 Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 1066-33-7
Nalgene rapid-flow filters Thermo Scientific 126-0020 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cells K-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich D8537
BCA assay Thermo Scientific 23250
Acetone Fisher Scientific A11-1
HPLC system for protein desalting Agilient 1260 Infinity II
Acetic Acid Fisher Scientific A38-212
CE autosampler CMP Scientific ECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interface CMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette puller Sutter Instruments P-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysis Branson 101063196 Model S-250A
Vaccum concentrator Thermo Fisher Scientific SPD131DDA-115

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aebersold, R., et al. How many proteoforms are there. Nature Chemical Biology. 14 (3), 206-214 (2018).
  2. Tran, J. C., et al. Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics. Nature. 480 (7376), 254-258 (2011).
  3. Catherman, A. D., et al. Large-scale Top-down Proteomics of the Human Proteome: Membrane Proteins, Mitochondria, and Senescence. Molecular and Cellular Proteomics. 12 (12), 3465-3473 (2013).
  4. Cai, W., et al. Top-Down Proteomics of Large Proteins up to 223 kDa Enabled by Serial Size Exclusion Chromatography Strategy. Analytical Chemistry. 89 (10), 5467-5475 (2017).
  5. Toby, T. K., Fornelli, L., Kelleher, N. L. Progress in Top-Down Proteomics and the Analysis of Proteoforms. Annual Review of Analytical Chemistry. 9 (1), 499-519 (2016).
  6. Jorgenson, J. W., Lukacs, K. D. Capillary Zone Electrophoresis. Science. 222 (4621), 266-272 (1983).
  7. Keithley, R. B. Capillary electrophoresis with three-color fluorescence detection for the analysis of glycosphingolipid metabolism. Analyst. 138 (1), 164-170 (2013).
  8. Han, X., et al. In-Line Separation by Capillary Electrophoresis Prior to Analysis by Top-Down Mass Spectrometry Enables Sensitive Characterization of Protein Complexes. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6078-6086 (2014).
  9. Sun, L., Zhu, G., Zhao, Y., Yan, X., Mou, S., Dovichi, N. J. Ultrasensitive and Fast Bottom-up Analysis of Femtogram Amounts of Complex Proteome Digests. Angewandte Chemie International Edition. 52 (51), 13661-13664 (2013).
  10. Choi, S. B., Lombard-Banek, C., Muñoz-LLancao, P., Manzini, M. C., Nemes, P. Enhanced Peptide Detection Toward Single-Neuron Proteomics by Reversed-Phase Fractionation Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 29 (5), 913-922 (2018).
  11. Sun, L., Knierman, M. D., Zhu, G., Dovichi, N. J. Fast Top-Down Intact Protein Characterization with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (12), 5989-5995 (2013).
  12. Wang, Y., Fonslow, B. R., Wong, C. C., Nakorchevsky, A., Yates, J. R. Improving the comprehensiveness and sensitivity of sheathless capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry for proteomic analysis. Analytical Chemistry. 84 (20), 8505-8513 (2012).
  13. Zhang, Z., Yan, X., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Detachable strong cation exchange monolith, integrated with capillary zone electrophoresis and coupled with pH gradient elution, produces improved sensitivity and numbers of peptide identifications during bottom-up analysis of complex proteomes. Analytical Chemistry. 87 (8), 4572-4577 (2015).
  14. Sun, L., et al. Over 10,000 peptide identifications from the HeLa proteome by using single-shot capillary zone electrophoresis combined with tandem mass spectrometry. Angewandte Chemie International Edition in English. 53 (50), 13931-13933 (2014).
  15. Aebersold, R., Morrison, H. D. Analysis of dilute peptide samples by capillary zone electrophoresis. Journal of Chromatography. 516 (1), 79-88 (1990).
  16. Britz-McKibbin, P., Chen, D. D. Y. Selective Focusing of Catecholamines and Weakly Acidic Compounds by Capillary Electrophoresis Using a Dynamic pH Junction. Analytical Chemistry. 72 (6), 1242-1252 (2000).
  17. Zhao, Y., Sun, L., Zhu, G., Dovichi, N. J. Coupling Capillary Zone Electrophoresis to a Q Exactive HF Mass Spectrometer for Top-down Proteomics: 580 Proteoform Identifications from Yeast. Journal of Proteome Research. 15 (10), 3679-3685 (2016).
  18. Zhu, G., Sun, L., Yan, X., Dovichi, N. J. Bottom-Up Proteomics of Escherichia coli. Using Dynamic pH Junction Preconcentration and Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 86 (13), 6331-6336 (2014).
  19. Lubeckyj, R. A., McCool, E. N., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Single-Shot Top-Down Proteomics with Capillary Zone Electrophoresis-Electrospray Ionization-Tandem Mass Spectrometry for Identification of Nearly 600 Escherichia coli Proteoforms. Analytical Chemistry. 89 (22), 12059-12067 (2017).
  20. Busnel, J. M. High capacity capillary electrophoresis-electrospray ionization mass spectrometry: coupling a porous sheathless interface with transient-isotachophoresis. Analytical Chemistry. 82 (22), 9476-9483 (2010).
  21. Zhang, Z., Peuchen, E. H., Dovichi, N. J. Surface-Confined Aqueous Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer (SCARAFT) Polymerization Method for Preparation of Coated Capillary Leads to over 10 000 Peptides Identified from 25 ng HeLa Digest by Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 89 (12), 6774-6780 (2017).
  22. Zhu, G., Sun, L., Dovichi, N. J. Thermally-initiated free radical polymerization for reproducible production of stable linear polyacrylamide coated capillaries, and their application to proteomic analysis using capillary zone electrophoresis-mass spectrometry. Talanta. 146, 839-843 (2016).
  23. Smith, R. D., Barinaga, C. J., Udseth, H. R. Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 60 (16), 1948-1952 (1988).
  24. Moini, M. Simplifying CE-MS Operation. 2. Interfacing Low-Flow Separation Techniques to Mass Spectrometry Using a Porous Tip. Analytical Chemistry. 79 (11), 4241-4246 (2007).
  25. Wojcik, R., Dada, O. O., Sadilek, M., Dovichi, N. J. Simplified capillary electrophoresis nanospray sheath-flow interface for high efficiency and sensitive peptide analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 24 (17), 2554-2560 (2010).
  26. Sun, L., Zhu, G., Zhang, Z., Mou, S., Dovichi, N. J. Third-Generation Electrokinetically Pumped Sheath-Flow Nanospray Interface with Improved Stability and Sensitivity for Automated Capillary Zone Electrophoresis-Mass Spectrometry Analysis of Complex Proteome Digests. Journal of Proteome Research. 14 (5), 2312-2321 (2015).
  27. McCool, E. N., et al. Deep Top-Down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis-Tandem Mass Spectrometry: Identification of 5700 Proteoforms from the Eschericia coli Proteome. Analytical Chemistry. 90 (9), 5529-5533 (2018).
  28. Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D., Mallick, P. ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics. 24 (21), 2534-2536 (2008).
  29. TopPIC Suite. , Available from: http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/topfd/ (2017).
  30. Kou, Q., Xun, L., Liu, X. TopPIC : a software tool for top-down mass spectrometry-based proteoform identification and characterization. Bioinformatics. 32 (22), 3495-3497 (2016).
  31. Elias, J. E., Gygi, S. P. Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry. Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).
  32. Methods - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: http://www.topdownproteomics.org/resources/methods/ (2018).
  33. Software - Consortium for Top Down Proteomics. , Available from: http://www.topdownproteomics.org/resources/software/ (2018).
  34. Ansong, C., et al. Top-down proteomics reveals a unique protein S-thiolation switch in Salmonella Typhimurium in response to infection-like conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10153-10158 (2013).
  35. Shen, Y., et al. High-resolution ultrahigh-pressure long column reversed-phase liquid chromatography for top-down proteomics. Journal of Chromatography A. 1498, 99-110 (2017).
  36. Olsen, J. V., Macek, B., Lange, O., Makarov, A., Horning, S., Mann, M. Higher-energy C-trap dissociation for peptide modification analysis. Nature Methods. 4 (9), 709-712 (2007).
  37. Syka, J. E., Coon, J. J., Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Hunt, D. F. Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (26), 9528-9533 (2004).
  38. Shaw, J. B., et al. Complete Protein Characterization Using Top-Down Mass Spectrometry and Ultraviolet Photodissociation. Journal of the American Chemical Society. 135 (34), 12646-12651 (2013).

Tags

Kemi fråga 140 Top-down proteomik kapillära zonen elektrofores elektrospray jonisering tandem mass spectrometry proteoform Escherichia coli
Storskaliga Top-down proteomik med kapillära zonen elektrofores Tandem Mass Spectrometry
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

McCool, E. N., Lubeckyj, R., Shen,… More

McCool, E. N., Lubeckyj, R., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (140), e58644, doi:10.3791/58644 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter