Artículo de método

Establecimiento del modelo de ratón TK-NOG humanizado dual para la patogénesis hepática asociada al VIH

DOI:

10.3791/58645

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11 de septiembre de 2019

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1Department of Pharmacology and Experimental Neuroscience, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center

En este artículo

Resumen

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Este protocolo proporciona un método confiable para establecer ratones humanizados con el sistema inmunitario humano y las células hepáticas. Los ratones inmunodeficientes duales reconstituidos logrados mediante inyección intraesplénica de hepatocitos humanos y células madre CD34+ hematopoyéticas son susceptibles a la infección por el virus de inmunodeficiencia humana-1 y al daño hepático recapitulado observado en Pacientes infectados por el VIH.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A pesar del aumento de la esperanza de vida de los pacientes infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1), la enfermedad hepática ha surgido como una causa común de su morbilidad. La inmunopatología hepática causada por el VIH-1 sigue siendo esquiva. Los modelos animales de xenoinjerto pequeños con hepatocitos humanos y el sistema inmunitario humano pueden recapitular la biología humana de la patogénesis de la enfermedad. En este documento, se describe un protocolo para establecer un modelo de ratón humanizado dual a través de hepatocitos humanos y CD34+ trasplante de células madre/progenitoras hematopoyéticas (HSPC), para estudiar la inmunopatología hepática observada en pacientes infectados por el VIH. Para lograr la reconstitución dual, el TK-NOG masculino (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2/ShiJic) ratones se inyectan intraperitonealmente con dosis de ganciclovir (GCV) para eliminar las células hepáticas transgénicas del ratón, y con treosulfán para el acondicionamiento no mieloablativo, los cuales facilitar el injerto de hepatocitos humanos (HEP) y el desarrollo del sistema inmunológico humano (HIS). Los niveles de albúmina humana (ALB) se evalúan para el injerto hepático, y la presencia de células inmunitarias humanas en la sangre detectadas por citometría de flujo confirma el establecimiento del sistema inmunitario humano. El modelo desarrollado utilizando el protocolo descrito aquí se asemeja a múltiples componentes de daño hepático por infección por VIH-1. Su establecimiento podría resultar esencial para los estudios de la coinfección por el virus de la hepatitis y para la evaluación de medicamentos antivirales y antirretrovirales.

Introducción

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Desde el advenimiento de la terapia antirretroviral, se ha producido una disminución sustancial de las muertes relacionadas con la monoinfección del VIH-1. Sin embargo, la enfermedad hepática ha surgido como una causa común de morbilidad en pacientes infectados por el VIH1,2. Las coinfecciones de virus de la hepatitis con infección por VIH-1 son más frecuentes, y representan entre el 10% y el 30% de las personas infectadas por el VIH en los Estados Unidos3,4,5.

La especificidad del huésped de los virus del VIH-1 y la hepatitis limita la utilidad de los modelos de animales pequeños para estudiar enfermedades infecciosas específicas del ser humano o para investigar múltiples aspectos de la patogénesis hepática asociada al VIH-1. Los ratones inmunodeficientes que permiten el injerto de células y/o tejidos humanos (llamados modelos de ratón humanizados) son modelos animales aceptables para estudios preclínicos6,7,8. Desde la introducción de ratones humanizados a principios de la década de 2000, múltiples estudios preclínicos de toxicidad hepática humana colestásica, patógenos específicos del ser humano, incluidos el VIH-1 y trastornos neurocognitivos asociados al VIH, el virus de Epstein Barr, hepatitis y otros enfermedades infecciosas, se han investigado en estos ratones6,9,10,11. Múltiples modelos de ratón para CD34+ HSCCP y/o trasplante de hepatocitos humanos han sido desarrollados durante mucho tiempo y han mejorado con el tiempo para estudiar la enfermedad patogénesis del virus de la hepatitis B (VHB) enfermedad hepática asociada12, 13 , 14. Varios modelos para el trasplante de HSPC y hepatocitos humanos (HEP) se basan en cepas, conocidas como NOG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- c-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12, y fah-/- NOD rag1-/- il2r-null ratón16. Sin embargo, cada modelo tiene sus propias ventajas y limitaciones; por ejemplo, el fondo atravesado de dos ratones humanizados AFC8 para HEPs y células madre humanas (HSC) en un fondo Balb/C-Rag2-/- -/- permite el injerto exitoso de células inmunitarias y HSC, pero existe la ausencia de un fondo de células T y B específicos para antígenos respuesta en este modelo12. Las principales preocupaciones en la reconstitución de ratones humanizados dobles incluyen el injerto subóptimo, la falta de modelos adecuados para apoyar diferentes tejidos, condiciones no coincidentes, rechazo inmune, o enfermedad de injertofrentea huésped (GVHD), y técnicos dificultades, como manipulaciones de riesgo con recién nacidos y altas tasas de mortalidad debido a anomalías metabólicas13.

Aunque ratones humanizados se han utilizado para la investigación del VIH durante muchos años17,18,19, el uso de ratones humanizados para estudiar el daño hepático causado por el VIH-1 ha sido limitado20. Hemos informado previamente del establecimiento de un modelo de ratón TK-NOG humanizado dual y su aplicación en la enfermedad hepática asociada al VIH8. Este modelo muestra el injerto robusto de hígado y células inmunitarias y recapitula la patogénesis por infección por VIH. Esta discusión presenta un protocolo detallado, incluyendo los pasos más críticos en el trasplante de hepatocitos humanos. También se presenta una descripción de los HSCCP necesarios para un injerto exitoso de HEPs y el establecimiento de un sistema inmunitario funcional en ratones TK-NOG. Se detalla el uso de estos ratones para estudiar la inmunogénesis hepática asociada al VIH. Se utilizan ratones macho TK-NOG que llevan un transgén transgén transgén de virus del herpes simple tipo 1 específico del hígado. Las células hepáticas de ratón que expresan este transgén pueden ser fácilmente abladas después de una breve exposición a una dosis no tóxica de GCV. Las células hepáticas humanas trasplantadas se mantienen establemente dentro del hígado del ratón sin fármacos exógenos21. Los ratones también están preacondicionados con dosis no mieloablativas de treosulfano para crear un nicho en la médula ósea del ratón para las células humanas8. Los ratones inmunodeficientes TK-NOG se inyectan por vía intrasíptica con HEPs y HSPC multipotentes. A continuación, los ratones son monitoreados regularmente para la reconstitución de sangre y hígado mediante inmunofenotipado en sangre y mediciones de los niveles séricos de albúmina humana, respectivamente. Los ratones con una reconstitución exitosa de más del 15% tanto para las células inmunitarias humanas como para los HEP se inyectan por vía intraperitoneal con VIH-1. El efecto del VIH en el hígado se puede evaluar tan pronto como 4 - 5 semanas después de la infección. Es fundamental tener en cuenta que, debido a que se utiliza el VIH-1, se deben tomar todas las precauciones necesarias mientras se maneja el virus y se inyecta en ratones.

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Protocolo

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Este protocolo ha sido aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Centro Médico de la Universidad de Nebraska.

NOTA: Obtener la aprobación de la IACUC local antes de realizar experimentos con animales.

1. Procesamiento de la sangre del cordón umbilical y el aislamiento de los HSpC shumanos

  1. Realice todos los pasos del protocolo en condiciones estériles en armarios de flujo laminar.
  2. Tomar la sangre del cordón umbilical (CB) recogida en tubos heparinizados y hacer el volumen hasta 35 ml mediante la adición de solución salina tamponada de fosfato (PBS). Capa de la muestra en la parte superior del medio de separación de linfocitos (LSM) como se ilustra en la Figura 1 y centrifugar el LSM con el CB en capas a 400 x g durante 35 min a 4 oC sin frenos.
    NOTA: Diluir la sangre con cuidado y suavemente para evitar mezclar en la interfaz.
  3. Retire la capa superior de LSM y plasma con cuidado y transfiera la interfaz de la capa blanca buffy a un nuevo tubo usando una pipeta de transferencia.
  4. Resuspender la capa buffy en 30 - 40 mL de tampón de frío (PBS + 0.5% albúmina sérica bovina [BSA] + 2 mM ácido etilendiaminetetraacético [EDTA]). Usando una pipeta, combine 20 s de la suspensión celular con 20 sde nado azul y una pipeta de 10 ml de la mezcla en la abertura exterior de cualquiera de las dos cámaras de una corredera de recuento e inserte la diapositiva en un contador de células automatizado para contar las células.
    NOTA: Utilice el tampón de hielo frío en todos los pasos, ya que ayuda a mantener las células viables.
  5. Centrifugar las células a 300 x g durante 10 min a 4 oC y aspirar el sobrenadante con cuidado. A continuación, agregue 300 s de tampón helado.
  6. Añadir 100 l de reactivo de bloqueo de receptores Fc humanos y 100 l de microperlasdes conjugadas con anticuerpos CD34 de ratón monoclonal para hasta 1 x 108 células (ver la Tabla de Materiales). Incubar durante 30 min a 4 oC, añadir 10 ml de tampón helado para lavar las células, y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 oC.
    NOTA: Escale esto de acuerdo con el número de celda si hay más de 1 x 108 celdas presentes.
  7. Retire cuidadosamente el sobrenadante, resuspenda el pellet en 500 ml de tampón y continúe con el paso de separación magnética para enriquecer los HSPC.
  8. Coloque una columna LS de selección positiva (consulte la Tabla de materiales)en el campo de clasificación de celdas activadas magnéticamente y pásela con 3 ml de búfer.
  9. Cargue la muestra en la columna LS que puede atrapar microperlas enlazadas a CD34+ humano en muestras y permitir que fluya bajo la influencia de la gravedad en el tubo de recolección.
  10. Lavar la columna 3x con tampón y recoger el eluido en el mismo tubo de recolección del CD34- fracción de células.
  11. Sumerja la columna con 5 ml de tampón para eluir las células CD34+ en un nuevo tubo de colección. Repita el procedimiento para lograr una pureza de >90%.
  12. Cuente el CD34+ células eludados usando tinte azul trypan en un hemocítómetro. Después de contar, centrifugar las células CD34+ a 300 x g durante 5 min y desechar el sobrenadante.
  13. Resuspender el CD34+ células en 25 l de PBS para que una inyección se utilice inmediatamente en el trasplante o criopreservar las células a una concentración de 1-2 millones/ml en medio de congelación (medio del Instituto Memorial Roswell Park [medio RPMI 1640] + 50% fetal suero bovino (FBS) + 10% dimetilsulfóxido [DMSO]) para su uso posterior en trasplantes.
    NOTA: Siempre cuente las células viables antes de usarlas en el trasplante.
  14. Para comprobar la pureza del CD34+ elute, tomar 50 éL de la suspensión e incubarlo con 10 l de anticuerpo CD34 antihumano conjugado con PE durante 30 min a 4 oC. Después de la incubación de anticuerpos, lave las células manchadas con PBS, resuspenderlas en 100 s de PBS y, a continuación, proceder a realizar citometría de flujo. Agregue un tubo adicional de células sin anticuerpos para diseñar la compuerta en el citometro de flujo.
  15. Después de la adquisición, analice los datos seleccionando la región de interés en una gráfica de dispersión hacia delante (FSC) y dispersión lateral (SSC), seguida de un paso para celdas individuales en parcelas fsc-área y altura FSC. Puerta CD34-células positivas en células individuales en el canal PE y la gráfica de área SSC.

2. Preparación de hepatocitos humanos para trasplante

  1. Retire los hepatocitos crioconservados del nitrógeno líquido, sumerja rápidamente el vial en el baño de agua y descongele durante aproximadamente 90 - 120 s.
  2. Retire la tapa del vial y vierta los hepatocitos descongelaren en el tubo cónico de 50 ml del medio dedescongelación calentado.
  3. Suspenda las células meciendo el tubo de 50 ml a mano durante unos segundos.
    NOTA: No vórtice el tubo.
  4. Repelete las células a 100 x g durante 8 min a temperatura ambiente. Lave las células peletadas en PBS con 0.1% De BSA y aglas con HSCC frescos o descongelares (relación 10:1) en PBS en un volumen final de 80 l/ratón.

3. Manejo de animales, cribado, genotipado y tratamiento para el hSPC humano y el trasplante de hepatocitos

  1. Manejo de animales
    1. Como resultado de la inmunodeficiencia grave, criar, albergar y manejar ratones TK-NOG en condiciones asépticas.
    2. Use siempre una capa de laboratorio, guantes, fundas de zapatos y una mascarilla facial para prevenir infecciones con microorganismos potencialmente patógenos.
    3. Use guantes e instrumentos estériles para la cirugía y maneje a los animales asépticamente durante toda la cirugía.
  2. Selección de ratones TK-NOG para el experimento
    1. Mantener la colonia de cepas TK-NOG criando machos hembra TK-NOG con machos no TK-NOG y seleccionar crías transgénicas por genotipado.
      NOTA: Realizar genotipado (ver paso 3.3) para determinar la presencia o ausencia del transgén en ratones machos y hembras recién nacidos en el momento del destete.
    2. Seleccionar varones a las 6 -8 semanas de edad para el trasplante debido a su alta sensibilidad al agotamiento mediado por el GCV de hepatocitos transgéneos transgénicos de VHS-TK21.
    3. Etiqueta de los ratones en el momento del destete o cirugía para facilitar la identificación. Anote el peso y el estado de salud de los animales.
  3. Genotipado para la presencia del transgén HSV-TK utilizando una reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa en tiempo real
    1. Realizar genotipado en el momento del destete (generalmente a las 3 - 4 semanas de edad). Para el genotipado, corte un pedazo de la oreja del ratón en un gabinete de seguridad biológica de flujo laminar para mantener la esterilidad y extraer ADN genómico mediante el uso de un kit de aislamiento de ADN genómico.
    2. Amplificar el ADN genómico extraído de la pieza del oído en una mezcla de reacción de 20 l para detectar el transgén HSV-TK bajo el control del promotor de la albúmina humana mediante la adición de 1 l de imprimación directa 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 l de imprimación inversa 5'-TAAGTTGCAGGGCGTC-3', 0.5'L de imprimación inversa 5'-TAAGTTGGCAGCGTC-3', 0.5'L de imprimación inversa 5'-TAAGTTGGCAGGC-3', 0.5'L de imprimación inversa 5'-TAAGTTGGCAGCGTC-3', 0.5'L de imprimación inversa 5'-TAAGTTGGCAGCGTC-3', 0.5'L de imprimación inversa 5'-TAAGTTGGCAGCGTC-3', 0.5'L de la imprimación inversa 5'-TAAGTTGGCAGCGTC-3', 0.5'L de la imprimación invers Sonda FAM 5o-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3', y 10 l de mezcla maestra en un instrumento de reacción en cadena de polimerasa (PCR) en tiempo real22.
    3. Establezca los ajustes de PCR en tiempo real de la siguiente manera: 60 oC para 30 s (etapa de prelectura), 95 oC para 10 min (etapa de retención), 40 ciclos de 95 oC para 15 s y 60 oC para 1 min (etapa PCR) y 60 oC para 30 s (etapa posterior a la lectura).
      NOTA: Un ciclo de umbral (Ct) por debajo de 22 se considera positivo para el transgén HSV-TK.
  4. Tratamiento con ganciclovir y treosulfano
    1. Con una aguja de 27 G, inyectar a los ratones TK-NOG inyecciones de GCV intraperitoneales (6 mg/kg) 2 veces al día en el día 7 y en el día 5 de 100 oL de salina para agotar las células parenquimales transgénicas de los ratones (como se muestra en la estrategia experimental de la Figura 2)23 .
    2. En los días 3, 2 y 1 antes de la cirugía, preacondicionar ratones con dosis intraperitoneales no mimieloablativas de treosulfano (1,5 g/kg/día) en 100 ml de salina, utilizando una aguja de 27 G.
    3. Un día antes de la cirugía, extraiga de dos a tres gotas de sangre de la vena submandibular pinchándola con una lanceta de 5 mm, y aísle el suero centrifugando (1.500 x g durante 10 min a 4 oC) para el ensayo de alanina aminotransferasa (ALT) para evaluar el degrifuging (1.500 x g durante 10 min a 4 oC) para el ensayo de alanina aminotransferasa (ALT) para evaluar el degr ee de daño hepático.
  5. Preparación para la cirugía
    1. Utilice cortadoras para afeitar el pelaje del ratón que rodea el lugar de la incisión (a la izquierda de la pared peritoneal) antes de la cirugía.
    2. Ajuste el flujo de oxígeno a 1 L/min y el flujo de isoflurano a 3% - 5% en una cámara de inducción utilizando una máquina de anestesia de ratón. Coloque un ratón a la vez en la cámara de inducción para la anestesia.
    3. Fije el extremo de un tubo de extensión estéril (con una capacidad de retención de 550 ml de suspensión; véase la Tabla de materiales para las especificaciones) a una aguja de 30 G y el otro extremo a una jeringa de 1 ml.
    4. Llene la jeringa con la suspensión (80 l/ratón) de HEPs y HSP agrupados (ver sección 2), coloque la jeringa en la muesca de una pipeta dispensadora repetitiva y ajuste el dispensador para dispensar 10 ml en cada prensa.
    5. Una vez que los ratones son anestesiados (generalmente después de 3 - 4 min), cambie el flujo de isoflurano al cono de la nariz y reduzca el caudal de isoflurano a 2% - 3%.
  6. Trasplante intraesplénico de HSCCP humanos y hepatocitos en ratones
    1. Realice todos los pasos de la cirugía en un gabinete de flujo laminar en condiciones estériles.
    2. Coloque una cortina estéril limpia sobre la superficie de trabajo y frote el lado izquierdo del cuerpo de cada ratón con un 10 % de povidona-yodo seguido de un 70 % de alcohol isopropílico, antes de hacer una incisión.
    3. Hacer una pequeña incisión (de 1 a 1,5 cm de longitud y 5 mm de profundidad) en la piel, el músculo y el peritoneo a la izquierda de la pared peritoneal con las tijeras tipo Vanna para entrar en la cavidad peritoneal aproximadamente 5 mm por debajo del borde inferior de la caja torácica.
    4. Localice el bazo, tire de él ligeramente con fórceps a la zona de operación para facilitar el acceso e inserte la aguja de 30 G en el polo inferior del bazo.
    5. Desbloquee el émbolo de la pipeta dispensadora y dispensar 10 ml del volumen a la vez, con un límite de 60 - 80 s por bazo. Retraiga la aguja lentamente y recorte el bazo con clips de ligaduras utilizando un apetecel.
    6. Empuje el bazo de nuevo en la cavidad del cuerpo con aplicadores con punta de algodón humedecidos con PBS estéril.
    7. Cierre la capa muscular de la pared abdominal utilizando un patrón de sutura absorbible interrumpido (no continuo). Consiga el cierre de la piel con un patrón de sutura interrumpido utilizando suturas no absorbibles.
    8. Use almohadillas de circulación de agua tibia para proteger a los ratones de la hipotermia después de la cirugía.
    9. Retire las suturas no absorbibles 10-14 días después de la cirugía.
  7. Atención postoperatoria
    1. Cuando el animal trasplantado despierte, inyectar buprenorfina analgésica (0,1 mg/kg) por vía intraperitoneal, 2 veces al día durante 3 días consecutivos.
    2. Observe a los animales al menos 1 veces al día hasta que vuelvan a las condiciones físicas normales.
      NOTA: Revise el peso corporal de cada animal, ya que algunos ratones pueden perder peso después de la cirugía. Los ratones suelen recuperar su peso original en 1 a 2 semanas.

4. Validación del injerto del hígado humano por ELISA y el sistema inmune humano por citometría de flujo

NOTA: Evaluar la reconstitución del hígado humano y del sistema inmunitario mensualmente, comenzando 1 mes después del trasplante por ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y citometría de flujo, respectivamente.

  1. Recoger muestras de sangre de la vena submandibular utilizando lancetas en tubos EDTA, y centrifugar a 1.500 x g durante 10 min a 4oC. Aislar el suero para comprobar los niveles de albúmina humana para evaluar la eficiencia del injerto del hígado de ratón para los hepatocitos humanos trasplantados, utilizando un conjunto de cuantificación elISA de albúmina humana (ver la Tabla de Materiales)siguiendo la del fabricante Instrucciones.
    NOTA: No deseche el pellet y utilice las células peletizadas para un análisis de citometría de flujo para evaluar la reconstitución del sistema inmunitario humano.
  2. Resuspender el grántbol celular sin suero en 35 l de tampón FACS (PBS + 2% FBS) y teñido con 5 l de CD45 específico del ratón (concentración 0,5 mg/ml), 5 ml cada uno de anticuerpos específicos del ser CD45 (0,1 mg/ml), CD3 (0,2 mg/ml), CD8 (0,1 mg/ml) y CD19 (0,5 mg/ml) , y 20 l de CD4 (0,25 mg/ml) y CD14 (0,25 mg/ml) cada uno durante 30 minutos a 4 oC, para comprobar el desarrollo de un sistema inmunitario funcional a partir de CD34+ HSPC.
    NOTA: Considere la posibilidad de agregar un tubo adicional de células no manchadas para determinar el gating de las células manchadas.
  3. Después de la incubación, transfiera la suspensión teñida (-100 l) en un tubo de citometría de flujo de fondo redondo de poliestireno y utilice 2 ml de tampón de lisis 1x (ver la Tabla de Materiales)diluyendo 1 parte del tampón de lisis 10x con 9 partes de agua destilada e incubando 10 - 15 minutos para cargar los glóbulos rojos.
    NOTA: Observe la turbidez para evaluar la lisis de glóbulos rojos. Una vez que la muestra se vuelve clara, la lisis se completa.
  4. Después de la lisis, añadir 3 ml del tampón FACS en el tubo y centrifugar a 300 x g a 4 oC durante 5 minutos para obtener un pellet. Repita el lavado añadiendo 3 ml de tampón FACS al pellet y centrífuga a 300 x g a 4 oC durante 5 min.
  5. Fijar las células en 1% de paraformaldehído (PFA) recién hecho y adquirir células manchadas en el citómetro de flujo, analizado con software de flujo.
  6. Para el análisis, seleccione linfocitos que se gating en una gráfica FSC/SSC, seguido de un solo tipo de celda en el área FSC/altura FSC.
  7. Además, la puerta para cd45 específico del ser humano (hCD45) en la población de una sola célula e incluye CD45 específico del ratón (mCD45) para la exclusión de células de origen murino. Estratificar la gating de la población manchada en función de la gating de células no retenidas.
  8. Puerta hCD45+ celdas para determinar la frecuencia de las células CD3+ T y células CD19+ B. Celdas de puerta T para determinar subconjuntos CD4 y CD8. Para evaluar los monocitos, haga una puerta en hCD45 para determinar CD14+ monocitos.

5. Infección por VIH de los ratones TK-NOG y su efecto en el hígado humano y el sistema inmune

  1. Manipule el virus VIH-1 y todos los ratones infectados en una instalación designada de nivel 2 de bioseguridad.
    PRECAUCION: Autoclave y deseche todos los desechos infectados por el VIH en bolsas de doble riesgo biológico. Por razones de seguridad, use guantes resistentes a cortes mientras entrega ratones infectados por el VIH.
  2. Use equipo de protección personal (EPP), incluyendo un vestido de abrigo desechable, fundas de zapatos, una máscara facial y guantes dobles en todo momento mientras trabaja con el virus.
  3. Seleccionar ratones con una reconstitución de más del 15% de las células CD45+ humanas (probadas en el paso 4.7) y con presencia de albúmina humana en el suero para la infección por VIH-1 (probada en el paso 4.1).
  4. Inyectar los ratones con 1 x 103 a 1 x 104 dosis infecciosas de cultivo de tejido 50 (TCID50)VIH-1 ADA en un volumen de 100 - 200 l por ratón, intraperitonealmente.
  5. Eutanasia a los ratones infectados por el VIH 5 semanas después de la infección mediante el uso de isoflurano (con una concentración de vapor de isoflurano de >5%).
  6. Después de eutanasia de los ratones, recoger la sangre en los tubos EDTA por una punción cardíaca para el aislamiento del suero, para ver el efecto del VIH-1 en el hígado mediante la evaluación de los niveles de albúmina específicos del ser humano por ELISA (ver paso 4.1) y las células sanguíneas para comprobar si hay cambios en el sistema inmunitario humano células que utilizan citometría de flujo (ver pasos 4.2 - 4.8).
    NOTA: Evalúe la carga viral periférica 5 semanas después de la infección en un bioanalizador para confirmar si los ratones están infectados.
  7. Después de extraer sangre, exhala el hígado de los ratones eutanasiados.
  8. Para la escisión hepática, exponer la cavidad abdominal haciendo una incisión de 1,5 - 2 cm de largo y 0,5 cm de profundidad en la piel, los músculos y el peritoneo, desde el xifoidea. Haga un corte perpendicular a la columna vertebral entre el hígado y el diafragma. Levante el hígado y cortar cualquier membrana que lo adhiera al estómago y los intestinos.
  9. Recoger y fijar el hígado en 4% paraformaldehído durante la noche y seguir un protocolo inmunohistoquímico estándar para evaluar el efecto del VIH en CK18+ hepatocitos mediante el uso de anticuerpos CK18 específicos para humanos8.

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Resultados

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El establecimiento de un modelo de ratón humanizado dual con hígado humano y células inmunitarias se puede monitorear fácilmente en cada paso con ELISA y citometría de flujo muy simple, respectivamente. La citometría de flujo se realiza regularmente para evaluar el desarrollo de un sistema inmunitario funcional y para ver el efecto de la infección por VIH en las células inmunitarias. En ratones humanizados duales, el desarrollo de células inmunitarias funcionales puede variar del 15% al 9...

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Discusión

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El hígado está comprometido y dañado en pacientes infectados por el VIH24. Los modelos experimentales de animales pequeños para el estudio de las enfermedades hepáticas humanas en presencia del VIH-1 son extremadamente limitados, a pesar de la disponibilidad de algunos modelos animales cotrasplantes con CD34+ HSPC y hepatocitos7,12, 25. En experimentos in vitro, se ha demostrado que los hepato...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la beca R24OD018546 del Instituto Nacional de Salud (a L.Y.P. y S.G.). Los autores quieren agradecer a Weizhe Li, Ph.D., por la ayuda en procedimientos quirúrgicos, Amanda Branch Woods, B.S., Yan Cheng para inmunohistología, miembros del centro de investigación de citometría de flujo de la UNMC Phillip Hexley, Ph.D., Victoria B. Smith, B.S., y Samantha Wall, B.S., miembros avanzados de las instalaciones centrales de microscopía Janice A. Taylor, B.S., y James R. Talaska, B.S., para el apoyo técnico. Los autores reconocen a los Doctores Mamoru Ito y Hiroshi Suemizu de CIEA por proporcionar ratones TK-NOG y al Dr. Joachim Baumgart por proporcionar treosulfán. Los autores agradecen al Dr. Adrian Koesters, de la UNMC, su contribución editorial al manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Agujas de 27 G1/2"BD biosciences305109
30 agujas de G1/2"BD biosciences305106
5 mL de poliestireno  tubo de fondo redondo de 12 mm x 75 mm estiloCorning352054
BD 1 mL Jeringa de tuberculina sin agujaBD biosciences309659
BD FACS array bioanalyzer BD BiosciencesPara el control de pureza de células CD34+ eluidas 
Software de matrices BD FACSBD BiosciencesSoftware para el análisis adquirido de células CD34+ en matrices FACS
Solución de lisado BD FACSBD Biosciences349202Para lisar glóbulos rojos
BD LSR IIBD BiosciencesInstrumento para la adquisición de muestras de citometría de flujo
BD  Vacutainer Tubo de Extracción de Sangre de PlásticoBD biosciencesBD 367874Para recolectar Sangre de cordón umbilical
Bovino Albúmina sérica Sigma-aldrichA9576
BuprenorfinaSustancia controlada y analgésico
CD14-PEBD Biosciences 555398Específico para humanos
CD19-BV605BD Biosciences562653Específico para humanos
CD34 MicroBead Kit, humanosMiltenyi Biotec130-046-702Para el aislamiento de    CD34+ HSPC
CD34-PE, humanoMiltenyi Biotec130-081-002Anticuerpo utilizado para la comprobación de la pureza de células CD34+ eluidas 
CD3-AF700BD Biosciences557943Específico para humanos
CD45-PerCPCy5.5BD Biosciences564105Específico para humanos
CD4-APCBD Biosciences 555349Específico para humanos
CD8-BV421BD Biosciences562428Específico para humanos
Portaobjetos de recuento de célulasBio-rad1450015
ChargeSwitch gDNA Mini Tissue KitThermofisher CS11204 científicopara la extracción de ADN genómico del
auricular Cobas Amplicor system v1.5 de Roche Molecular Diagnosticspara medir la carga viral
Aplicadores con punta de algodón   McKesson24-106-2S
Citoqueratina-18 (CK18)DAKOM7010Específico para
DMSO humano (Dimetilsulfóxido)Sigma-aldrichD2650-5X5ML
Juego de extensión Microbore Abrazadera de corredera (s) Fijo Macho Luer Lock. L: 60 pulgadas L: 152 cm PV: 0,55 mL Ruta del fluido EstérilBD biosciences30914Acoplado al pipete dispensador y para cargar con HSPC y HEP suspesion
FACS Diva versión 6Biosciencessoftware de citómetro de flujo requerido para  adquisición de muestra
Suero fetal bovino (FBS)Gibco10438026
FLOWJO software de análisis
v10.2		FLOWJO, LLC software de análisis de citometría de flujo
GanciclovirAPP Pharmaceuticals, Inc.315110Medicamento de prescripción
Greiner MiniCollect Tubos de EDTAGreiner bio-one450475
Medio de descongelación de hepatocitos Laboratorios de investigación Triangle  MCHT50
Horizon Open Ligating Clip AppliersTeleflex537061Para sujetar los clips de ligadura
Hospira Sterile Water for InjectionACE surgical supply co. Inc.001-1187Para la dilución de buprenorfina (analgésico)
Albúmina humana ELISA Set de cuantificaciónBethyllaboratories E80-129Para la evaluación de los niveles de albúmina humana en suero de ratón
Hepatocito humanoTriangle Research Labs HUCP1  Hepatocitos humanos criopreservados, calificados para inducción 
Tijeras de iris, rectoTed Pella, Inc.13295
LancetMEDIpointGoldenrod 5 mm
LS columnas Miltenyi Biotec130-042-401Se utiliza para atrapar microperlas CD34+ (selección positiva)
Medio de separación de linfocitos (LSM)MP Biomedicals50494Para la aislamiento de    linfocitos de sangre periférica
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303contiene el separador Qudro MACS y las columnas LS
McPherson-Vannas Micro Tijeras de resorte de disecciónRoboz Surgical Instrument Co.RS-5605Se utiliza para hacer una incisión en la piel para exponer el bazo
Micro Pinzas de disecciónRoboz Surgical Instrument Co.RS-5157 para sostener y extraer el bazo de la cavidad peritoneal
ratón CD45-FITCBD Biosciences553080para ratón
PBS (solución salina tamponada con fosfato)HycloneSH30256.02
Qudro MACS separador Miltenyi Biotec130-090-976tiene cuatro columnas LS:
RPMI 1640 medianoGibco11875093
StepOne Plus Real Time PCR BiosystemsAplicado Instrumento utilizado  a  genotipo
Serie Stepper Pipeta dispensadora repetitiva 1mlDYMAX CORPT15469Utilizado para  dispensar  Suspensión de HSPC y HEP de forma controlada
Suturevet PGA sutura absorbale sintéticaHenry Schein Animal Health41178Sutura de piel y peritoneo
TaqMan Gene Expression Master MixContador de células automatizado Thermofisher scientific
TC20Bio-rad1450102
ratones TK-NOG Proporcionado por el Instituto Central de Animales de Experimentación (CIEA, Japón; Dres. Mamoru Ito e Hiroshi Suemizu)
TreosulfanMedac GmbHProporcionado por  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Vannas Bio-rad Bio-1450022Trypan
, rectas, 80mm LTed Pella, Inc.1346Se utiliza para hacer una incisión en la piel para exponer el bazo
Weck hemoclip clips de ligadura de titanio tradicionalesEsuturas523700Para ligar el bazo después de la inyección
Bioanalizador BD específico , 4369016 Micro tijeras tipo rad Blue

Referencias

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