Ensayo de microfluidos para la evaluación de la adherencia del leucocito a células endoteliales derivado de célula de vástago de Pluripotent inducidas humanas (hiPSC-ECs)

La inflamación juega un papel fundamental en muchas condiciones patológicas, incluyendo cardiovasculares y enfermedades neurodegenerativas, sepsis y respuestas adversas (ADRs). Las células endoteliales (ECs) juegan un papel esencial en la regulación de las respuestas inflamatorias a través de la inducción de receptores Pro-adhesivos, como la molécula 1 de adhesión E-selectina, intercelular (ICAM-1) y vasculares de la célula molécula 1 de adhesión (VCAM-1) en su superficie ^{1 , 2}. ECs microvascular en diferentes tejidos se sabe que presentan heterogeneidad en las respuestas inflamatorias^3,4. Además, antecedentes genéticos o ciertas condiciones genéticas podrían dar lugar a las diferencias en las respuestas inflamatorias entre individuos; por lo tanto es importante tener acceso a ECs de diferentes individuos. Más recientemente, humanas pluripotentes inducidas células (hiPSCs)⁵, que se pueden derivar de cualquier individuo, fueron demostrados para servir como una fuente confiable y renovable de ECs^{6,7,8, 9}. por lo tanto, la evaluación de las respuestas inflamatorias y reclutamiento leucocitario en hiPSC-ECs es valiosa, no sólo para el modelado de ciertos trastornos genéticos, sino también para proporcionar indicios de variabilidad interindividual y utilizar como una herramienta para medicina personalizada en el futuro.

Análisis de flujo proporcionan una herramienta útil para estudiar la interacción leucocito endotelial. Los avances en dispositivos microfluídicos permiten la reproducción de las condiciones de flujo de fluidos fisiológicos con un control preciso de los niveles de tensión de esquileo de específicos de la cama vascular. En proyección de imagen permite el control de la cascada de eventos de captura del leucocito, rodar, gatear, adhesión y transmigración. Se han desarrollado varios ensayos de flujo al estudio de la interacción de leucocitos endoteliales, sin embargo, todos ellos utilizan primaria ECs^10,11,12,13. Aquí describiremos en detalle el análisis para la evaluación de la adherencia del leucocito humano a hiPSC-ECs bajo flujo fisiológico. En este procedimiento, se describen condiciones optimizadas de estimulación CE hiPSC con estímulos proinflamatorios, como el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), disociación, siembra en un chip de microfluidos con ocho canales paralelos. Describir un protocolo paso a paso para la perfusión de ECs hiPSC con la suspensión de leucocitos fluorescencia etiquetadas en chips de microfluídica, vivimos la proyección de imagen de la célula y automatizado de recuento de leucocitos adherentes.

Este protocolo es útil para la evaluación de las respuestas inflamatorias en hiPSC-ECs en detección de drogas, modelos de enfermedad y medicina regenerativa personalizada.

1. preparación de soluciones y reactivos

1. Preparar el medio completo endotelial humana-SFM (CE-SFM completo) agregando suero de derivados de plasma pobre en plaquetas (1%), factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF, 20 ng/mL) y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, 50 ng/mL) a humanos endotelial-SFM (véase tabla de Materiales). Filtrar el medio a través de un filtro de poro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C hasta por 2 semanas.
2. Preparar el Medio RPMI completo mediante la adición de suero fetal bovino (10%), 2-Mercaptoetanol (0.05 nM), L-glutamina (1%), penicilina-estreptomicina (25 U/mL) en Medio RPMI (véase Tabla de materiales). Almacenar a 4 ° C hasta por 3 semanas.

2. capa de microfluidos Chips

1. Lugar un biochip estéril en una placa de Petri estéril de 10 cm.
2. Preparar solución de trabajo de fibronectina por reconstituir la solución stock en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca^{2 +}/Mg^{2 +} a una concentración final de 50 μg/mL. Estimar 80 μl de solución de trabajo por el biochip.
3. Inyecte 10 μl de solución de trabajo de fibronectina en cada canal de los biochips. Utilice una pipeta con pequeñas puntas de μl 10 y asegúrese de que formar un contacto apretado entre la entrada del canal y la punta de la pipeta (figura 1, izquierda).
4. Cierre la tapa de la caja de Petri que contiene el biochip y colocarlo en una cámara humidificada (figura 2B). Guarde la cámara a 4 º C durante la noche. Para humidificar la cámara, ponga un papel limpio de tejido en la parte inferior de la cámara humidificada y añadir 5 mL de estéril de H₂O.
5. Al día siguiente, antes del ensayo, precaliente el biochip a 37 ° C en la incubadora.

3. preparación de hiPSC-ECs

Nota: En el protocolo descrito aquí, hiPSC-ECs fueron distinguidos, purificadas, congelados y descongelados como se describió anteriormente⁸.

1. Deshielo y placa hiPSC-ECs en completa CE-SFM en un 0.1% gelatina cubierto T75 matraz tres o cuatro días antes del ensayo.
2. La noche antes del ensayo, estimular hiPSC-ECs con TNFα mediante la adición de CE-SFM completo suplementado con TNFα de 10 ng/mL e incubar durante la noche (~ 12 h) a 37 ° C, como se describió anteriormente ⁷.

4. hiPSC-ECs disociación y siembra en Chip de microfluidos

1. En el día de la prueba, tome el frasco de hiPSC ECs de la incubadora y examina las células bajo el microscopio. Asegúrese de que hiPSC ECs son confluentes de 80 – 100% y tienen una morfología típica de EC-como.
2. Transferir el matraz en la campana de la cultura de célula.
3. Aspire el medio del frasco de hiPSC-ECs.
4. Lavar brevemente el cultivo celular mediante la adición de 10 mL de PBS sin Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. Aspire el PBS.
5. Añadir 4 mL cada frasco de enzima de la disociación de 1 x. Incubar por 5 min a temperatura ambiente (RT) (figura 1B).
6. Detener la reacción de disociación añadir 8 mL de medio humano endotelial-SFM por frasco. Con cuidado separar y recoger la suspensión hiPSC ECs en un tubo cónico de 15 mL con una pipeta de 5 mL.
7. Contar el número total de células en la suspensión.
8. Centrifugar las células a 300 x g durante 3 min a TA.
9. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en CE-SFM a una concentración final de 1,5 x 10⁷ células/mL.
10. Sacar la placa de Petri con el biochip de la incubadora y transferirlo a la campana de la cultura de célula.
11. Aspirar la solución de la fibronectina de todos los canales del chip de microfluidos.
12. Inyecte 6 μl de la suspensión celular en cada canal con una pipeta con una punta pequeña 10 μl (figura 1, medio). Asegúrese de que la suspensión de células se mezcla bien antes de la inyección y evitar la precipitación de la célula.
13. Examinar el biochip bajo el microscopio y asegurarse de que las células se distribuyen uniformemente, y la densidad celular es alta (figura 2).
14. Incubar el biochip por 15 min a 37 ° C.
15. Agregar 40 μl de SFM CE completo en los embalses medianos de ambos lados de cada canal.
16. Incubar el biochip por 1 h a 37 ° C (figura 1, derecha).
17. Añadir otro 50 μl de SFM CE completo en los depósitos de ambos lados de cada canal.

5. preparación de leucocitos humanos

Nota: En el protocolo descrito aquí, se utilizó una línea de células monocytic comercialmente disponibles (THP-1). Como alternativa, pueden utilizar las células mononucleares de sangre periférica o neutrófilos. Aislamiento de neutrófilos y monocitos de sangre periférica se puede realizar mediante el procedimiento estándar de¹¹. Realizar todos los pasos descritos en este párrafo en una campana de cultivo celular.

1. Recoger los leucocitos en un tubo cónico de 50 mL.
2. Lave los leucocitos con 10 mL de PBS sin Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. Centrifugar las células a 300 x g durante 3 min a temperatura ambiente (figura 1).
3. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en 1 mL de PBS con tinte DiOC6 (λ_ex = 485 nm, λ_em = 501 nm) (1:5, 000). Incubar las células en la oscuridad durante 10 min a TA.
4. Lave los leucocitos con 10 mL de PBS sin Ca^{2 +}/Mg^{2 +}. Centrifugar las células a 300 x g durante 3 min a RT. repetir el paso de lavado una vez más.
5. Contar el número total de células en la suspensión.
6. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en Medio RPMI completo a una concentración final de 2.5 x 10⁶ células/mL.

6. preparación de la bomba de la microfluídica

1. Montar la bomba de microfluidos con el múltiple de 8 canales.
2. Conecte la bomba a un PC con el software operativo instalado.
3. Inicie el software de microfluidos y el protocolo de carga haciendo clic en el Protocolo abierto y navegar en el PC para seleccionar el protocolo de microfluidos.
4. Conecte la bomba y el software seleccionando la carpeta de instalación y haga clic en Ejecutar Análisis de paso.
5. Definir la geometría de los canales para el control de la tasa de flujo correcto: seleccione Actualización de geometría en la carpeta de Configuración de la geometría y haga clic en Ejecutar Análisis de paso.
   Nota: Asegúrese de que los datos de la geometría coincide con la jeringa y canales que se utilizarán (geometría ID = 1, número de canales = 8, ancho de canal = 800.0 μm, profundidad de canal = 120.0 μm, volumen de la jeringa = 250 μL) y la viscosidad de la muestra (líquido viscosidad = 1.0).
6. Lave la bomba colocando el cable de entrada (naranja) en el tubo cónico de 50 mL con etanol al 80%. Coloque el cable de salida (verde) en el tubo vacío cónico de 50 mL (contenedor de residuos).
7. Seleccione la carpeta de Lavado bomba de lavado y haga clic en Ejecutar paso de análisis (volumen de lavado = 2000 μl, paso de volumen de lavado = 250 μl, dirección de lavado = salida). Repita el paso de lavado una vez más.
8. Repita la bomba lavado pasos (pasos 6.6-6.7) y agua de grado cultivo celular, medio de cultivo endotelial humana-SFM.
9. Continúe con el paso del lavado de los colectores.
10. Abrir manualmente la válvula entre la jeringa y el colector poniendo el adaptador de 3 vías en la posición correcta (indicador apagado se gira a la izquierda).
11. Seleccione Canal actual o abrir paso en la carpeta de Colector de lavado lavado y haga clic en Ejecutar análisis paso para abrir todas las válvulas del colector.
12. Lavar el colector manualmente presionando 5 mL de etanol al 80% de la jeringa, seguida por 5 mL de agua de grado cultivo celular.
13. Lavar el colector presionando 5 mL de medio de cultivo endotelial humana-SFM de la jeringa.
14. Eliminar todas las burbujas de aire que están atrapadas en el colector. Para ello, coloque el adaptador del pin 8-bien en los 10 cm placa de Petri con el medio y realizar empujando/tirando con la jeringa hasta que hayan desaparecido todas las burbujas grandes de aire (burbujas pequeñas no son un problema).
15. Seleccione paso Cerca de canal actual en la carpeta de Colector de lavado lavado y haga clic en Ejecutar Análisis de paso para cerrar todas las válvulas del colector.
16. Conecte el cable verde de salida de la bomba al adaptador múltiple.
17. Cambiar la válvula de 3 vías a la posición OFF para cerrar la jeringa.
18. Seleccione Cable lavado lavado carpeta y haga clic en Ejecutar análisis paso para lavar cada puerto con Medio RPMI individualmente, asegurando que todas las burbujas se quitan de cada cable (volumen de descarga = 100 μL).
    Nota: Cada válvula del colector abierto uno por uno, 1 a 8 y 100 μL del medio se distribuye a través de cada canal individual mientras que los otros canales de mantener cerraron. Asegúrese de que el líquido entra de cada pin. Si no hay ningún líquido que sale, es una indicación de una burbuja de aire o un estorbo.

7. preparación del Chip de microfluidos para vivir imágenes

1. Asegurar que las configuraciones de microfluídica están listas y la sala de proyección de imagen vivo es previamente equilibrada a 37 ° C y el nivel de CO₂ alcanza el 5% (Figura 3A, B).
2. Tomar el biochip de la incubadora y coloque en el soporte del chip de microscopio. Monte el soporte del chip en el microscopio de fase (figura 3).
3. Para conectar el biochip para la bomba a través de los colectores, coloque el adaptador de 8 pines cerca de los embalses de la salida de la viruta y profundizar todos los pines en el medio (pero no conecte completamente).
4. Seleccione el derrubio de | Conectar con Chip carpeta y haga clic en Ejecutar análisis paso a dispensar Medio RPMI antes de conectar el chip (volumen de descarga = 30 mL). Una vez que el medio se dispensa, inserte el adaptador de 8 pines en la salida de los biochips.
   Nota: Durante este paso, todos los canales se establecen en (abierta) y 30 μL del medio se distribuye a través de cada canal y a continuación se establecen los canales en Off (cerrado). Esto no asegura que ningún aire burbujas se introducirá en los canales del chip de microfluidos.
5. Manualmente aspirar el medio de todos los depósitos de entrada de los biochips con una pipeta.
6. Seleccione el derrubio de | Derrubio de la viruta carpeta y haga clic en Ejecutar análisis paso a perfusión 40 mL de medio completo de CE-OFS a través de cada uno de los canales uno por uno para eliminar las células muertos/restos del canal (volumen de lavado = 40 μl, esquileo de lavado máximo = 40 dinas/cm²).

8. flujo de ensayo de adherencia y la adquisición de la imagen

1. Manualmente aspirar el medio de la reserva de la entrada del canal de interés con una pipeta.
2. Añada 100 μl de los leucocitos de paso 5.6 para el depósito de entrada del canal de interés.
   Nota: Mezclar suavemente las células para hacer una suspensión unicelular.
3. En el ensayo de células de | Paso descripción carpeta, seleccione Descripción corriente de canal/paso y, en la lista de canales, seleccione sólo el canal actual de interés y establece on (abierto) y otros siete canales en Off (cerrado).
4. Seleccionar el ensayo de células de | Paso descripción carpeta y haga clic en Ejecutar Análisis de paso.
   Nota: Asegúrese de que Variable flujo tasa de dosificación se aplica presión negativa constante a la suspensión de leucocitos de la reserva de entrada a través del canal durante 5 minutos (conjunto del esquileo = constante, esfuerzo cortante =-0,50 Dina/cm², duración = 00:05:00, SCAN delay = 00:00:00). El valor negativo de la tensión de esquileo asegura la dirección correcta del flujo.
5. Aspire los leucocitos restantes del depósito de entrada.
6. Añada 100 μl de Medio RPMI completo en el depósito de entrada. Seleccione carpeta de Descripción de la célula ensayo/paso y haga clic en Ejecutar análisis paso para inundar el canal durante 5 minutos con Medio RPMI para lavar todos los leucocitos no adherente (conjunto del esquileo = constante, esfuerzo cortante =-0,50 Dina/cm², duración = 00: 05:00, análisis demora = 00:00:00).
7. Adquirir imágenes de al menos tres o cuatro posiciones del canal a la imagen los leucocitos adheridos (para asegurar que las zonas representativas son capturadas).
8. Repita los pasos 8.1 – 8.7 para valoración funcional del resto de los canales.
   Nota: Es posible ejecutar varios canales a la vez. Para ello, Abra todos los canales de interés durante el paso 8.3. y realizar los mencionados pasos 8.4 –8.7 para múltiples canales de interés.

9. completar el análisis y limpieza de la bomba de la microfluídica

1. Después de completar el experimento, exportar y guardar todas las imágenes en formato RAW.
2. Al guardar los resultados, ejecute la bomba microfluídicos y el colector protocolo de limpieza.
3. Para la bomba de microfluidos, ejecute primero la carpeta de la Bomba de lavado lavado por perfundiendo 4 mL de agua de grado cultivo celular, seguido por 4 mL de 80% etanol como se describe en pasos de 6.6 – 6.7 seco la bomba funcionando aire durante varios minutos.
4. Para limpiar el colector, ejecute paso de Colector de lavado lavado con la jeringa. Siga los pasos para abrir la jeringa y el colector de válvulas como se describe en pasos 6.10-6.11 lavado primero con etanol al 80% y el próximo con agua de grado cultivo celular. Seque el colector por empujar el aire a través de la jeringa. Cierre la válvula de la jeringa y las válvulas múltiple como se describe en pasos 6.10 y 6.15.

10. recuento de leucocitos adherentes

1. Descargar e instalar el software¹⁴ de http://cellprofiler.org de procesamiento de imágenes.
   Nota: Procesamiento de imágenes en este estudio se realizan utilizando el software versión 2.1.1. Si utiliza una versión más reciente, la tubería podría requerir menor adaptación.
2. Descargar la tubería Count_leukocytes.cpipe. Haga clic en archivo de | Importación | Tubería desde el archivo y navegar en el PC para seleccionar la tubería Count_leukocytes.cpipe.
3. Arrastrar y soltar una carpeta de imágenes adquiridas de los leucocitos adherentes a la ventana de lista de archivo en los módulos de entrada | Imágenes sección para el análisis.
4. Especificar el tamaño típico de los leucocitos mediante módulos de análisis | IdentifyPrimaryObjects. Especificar el diámetro mínimo y máximo de los leucocitos adherentes en píxeles.
5. Seleccione los criterios de filtrado mediante módulos de análisis | FilterObjects. Especificar el área mínima aceptado de objetos en píxeles.
6. Iniciar el análisis pulsando el botón de analizar imágenes .
   Nota: Se procesarán todas las imágenes RAW, y los resultados se guardarán en una carpeta de salida predeterminada. El archivo Image.txt contiene los números de leucocitos adherentes en cada imagen procesada (cada número corresponde a una imagen, es decir, cada campo visual adquirida).

En primer lugar, la respuesta de ECs hiPSC a la estimulación con agente proinflamatoria TNFα debe ser examinado, como se ha descrito7. Tratamiento de TNFα por 12 h activa la regulación al alza de E-selectina con el pico a las 6 h después de comenzar el tratamiento. Además, ICAM-1 es upregulated 6-12 h tras el tratamiento. Aunque no observamos la regulación al alza esperada de VCAM-1, se observa típicamente en las células endoteliales de vena umbilical humana primaria (HUVECs). Se encontraron durante la noche (12 h) TNFα del tratamiento más conveniente para el ensayo de adherencia del leucocito.

Disociación de óptima hiPSC-ECs debe resultar en una suspensión unicelular de grupos celulares. Figura 2 ilustra la densidad óptima hiPSC-CE justo después de la inyección. Normalmente, 15 minutos después de la inyección, hiPSC-ECs fije a la parte inferior del canal y empiezan a difundir (Figura 2D). 1 h después de la inyección, ECs hiPSC forman una monocapa difundida por el canal y estará listos para comenzar el análisis del flujo (Figura 2E).

Etiquetado de leucocitos con trazador fluorescente es beneficioso para fase automatizada de imágenes de contraste en cuantificación de imagen, ya que facilita el paso de identificación de la célula, sobre todo porque los leucocitos se adhieren a la monocapa de ECs y a menudo es difícil software distinguir diferentes tipos de células.

Gratis imagen de la abrir-fuente software de procesamiento es muy útil para la cuantificación automatizada de los leucocitos adherentes. La tubería que se describe en el protocolo aquí se basa en la identificación de objeto primario mediante umbralización adaptativa de imágenes fluorescentes de leucocitos (Figura 4A). Filtrado de identifica objetos basados en un área mínima además filtra objetos falsamente identificados como restos celulares, autofluorescencia o cualquier otro no específica señal fluorescente (figura 4 C, D).

Un chip de microfluidos con ocho canales paralelos permite la comparación de dos grupos independientes, por ejemplo, ECs distinguen de hiPSCs independientes, tales como donantes sanos o pacientes con trastornos genéticos. Controles adicionales, como ECs sin tratamiento o tratamiento previo con un anticuerpo bloqueo de ICAM-1 pueden ser incluidos como bien10,11. Dos a tres virutas de microfluidos pueden procesarse a la vez. Para la robustez de las conclusiones, se recomienda un mínimo de tres experimentos biológicos independientes realizados en días independientes.

Figura 1 : Preparación de hiPSC-ECs y leucocitos para el análisis del flujo. (A) pretratamiento de hiPSC-ECs con el estímulo proinflamatorias (TNFα). (B) representación esquemática de la disociación enzimática hiPSC-ECs, centrifugación y resuspensión. (C) representación esquemática de la capa de los canales (C, izquierda), la inyección de la suspensión hiPSC-CE (C media) y de la célula además de medio de cultivo después de accesorio hiPSC ECs en el chip de microfluidos. (D) representación esquemática del paso del leucocito lavado, etiquetado con colorante fluorescente DiOC6 y resuspensión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Chip de microfluidos con hiPSC ECs. Chip de microfluidos (A) en una placa de Petri de 10 cm. (B) la cámara humidificado utilizada para la incubación. (C, D, E) Imágenes representativas de hiPSC-ECs en la microfluídica canalizan 0 min (C), 15 min (D), (E) de 1 h después de la inyección. Barra de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Montaje experimental del celular directo imágenes y leucocito perfusión ensayo. (A, B) Representación de la foto (A) y esquema (B) de la disposición experimental del ensayo celular directo imágenes y flujo: bomba de microfluídica de la - microscopio fluorescente invertido con montado directo de cámara (5% CO2, 37 ° C, humidificado), (2) - (1), (3) - Canal 8 múltiple, (4) - PC para microscopio de imagen y control adquisición, (5) - PC para el control de la bomba de microfluidos. Chip de microfluidos (C) con el tubo insertado del múltiple de 8-canal fijado en un sostenedor de la placa y en la etapa motorizada del microscopio. (D) representación esquemática de los principales pasos del análisis de flujo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Análisis y detección automatizada de los leucocitos adherentes de la imagen. (A) la ventana de diálogo de la imagen de proceso de software con la configuración especificada para la identificación de leucocitos. (B) la ventana de diálogo del software de procesamiento de imagen con filtrado especificado criterios de los objetos identificados en base mínimamente aceptaron superficie (SAmin = 70 px). (C) ejemplo de la correcta identificación de los leucocitos y el filtrado de objetos inespecíficos de la pequeña área superficial (SA) (diámetro típico en píxel (Min, Max) = (9, 15); Filtrado de criterios SAmin = 70 px). Aceptados los objetos están representados en verde y objetos descartados son representados en violeta. (D) ejemplo de incorrecta identificación de los leucocitos debido a la gama incorrecta del diámetro típico (diámetro típico en píxel (Min, Max) = (3, 15); Filtrado de criterios SAmin = 70 px). Aceptados los objetos están representados en verde y objetos descartados son representados en violeta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.