Separación de bacterias por cápsulas cantidad usando un gradiente de densidad discontinuo

Muchas especies bacterianas producen una cápsula de polisacárido, que protege a la célula bacteriana de varias tensiones físicas y de reconocimiento y matanza por el sistema inmune. En Klebsiella pneumoniae, producción de cápsula es un requisito absoluto para la infección^1,2. K. pneumoniae cápsula media resistencia a péptidos antimicrobianos, resistencia a la muerte mediada por complemento, prevención de la fagocitosis y la supresión de la respuesta inmune innata³. Exceso de producción de cápsula se asocia con mayor virulencia y las infecciones adquiridas en la comunidad (nosocomiales)⁴.

Una gama de pruebas cuantitativas y cualitativas están disponibles para investigar la producción de cápsulas. Especies de Klebsiella , estos incluyen la cadena prueba⁵, en la que un palillo de dientes tocaba a una colonia se tira hacia arriba y mide la longitud de la cadena producida y de ensayo de mucoviscosity⁶, que consiste en la centrifugación lenta de una cultura siguió midiendo la densidad óptica del sobrenadante. Estos métodos son sencillos y rápidos pero carecen de sensibilidad cuando se utiliza el clásico Klebsiella cepas en vez de cepas superproductoras cápsulas. Otro método de cuantificación de cápsula es el análisis de ácido urónico, que es un desafío técnico y requiere el uso de ácido sulfúrico concentrado¹. Finalmente, la cápsula es visible directamente por microscopía (figura 1A). De estos métodos, sólo microscopía permite observar Estados de encapsulamiento diferentes dentro de una población única, y ninguno de estos métodos permite la separación física de bacterias encapsuladas y no encapsulados.

Separaciones basadas en la densidad mediante centrifugación del gradiente se utilizan habitualmente en biología de la célula para purificar células eucariotas diferentes tipos⁷, pero raramente se utilizan en la investigación microbiológica. El ensayo mucoviscosity de Klebsiella se basa en la observación que muy encapsuladas bacterias tardan más tiempo en pellets por centrifugación, y razonamos que esto puede ser debido a la menor densidad de células encapsuladas. El método mostrado aquí fue desarrollado para K. pneumoniae las poblaciones separadas físicamente por cápsula cantidad, utilizando centrifugación de gradiente de densidad (figura 1). Este método fue aplicado con éxito a Streptococcus pneumoniae, lo que indica que es aplicable a otras especies bacterianas. Separación del gradiente de densidad de una biblioteca mutante transposon saturado junto con la secuencia de inserción de transposones (densidad-TraDISort) se ha utilizado para identificar los genes involucrados en la producción y regulación cápsula⁸. Del mismo modo, este método fue utilizado en conjunto con la reacción en cadena de polimerasa al azar-prime (PCR) de colonias individuales para aislar no encapsulados de K. pneumoniae mutantes. Este método también puede usarse para comparaciones rápidas de producción cápsula entre condiciones y poblaciones diferentes, o para purificar las bacterias encapsuladas de muestras complejas (figura 1B). Por último, existe la opción analizar otros fenotipos que afectan la densidad, como el tamaño de la célula o agregación.

Este manuscrito muestra cómo optimizar el procedimiento para una nueva especie bacteriana o cepa y demuestra la construcción y funcionamiento de un gradiente de densidad discontinuo para separar las bacterias hyper encapsulados, encapsuladas y no encapsulados.

Nota: Asegurar que cualquier evaluación de riesgos aplicables a las cepas bacterianas es adoptadas cuando el cultivo y manejo de muestras. Tenga en cuenta que establecer gradientes demasiados a la vez puede conducir a trastornos musculoesqueléticos debido a la presión en empalmes de pipetear lenta involucrados. Plan de trabajo y tomar precauciones para evitar lesiones.

1. preparación de las cepas bacterianas o bibliotecas mutantes

1. Raya a las cepas a probar en placas de agar apropiado. Se trata de chapa para el experimento.
   1. Incubar las placas durante la noche en la temperatura deseada para lograr colonias individuales. Para este experimento, K. pneumoniae (cepas de NTUH-K2044 y ATCC43816) de la cultura en agar caldo (LB) de Luria a 37 º C y S. pneumoniae (tipo salvaje de 23F y 23F Δcps) en agar sangre en un frasco de la vela humidificado a 37 ° C.
2. Escoge una sola Colonia de una placa común (paso 1.1) para inocular 10 mL de caldo apropiado utilizando un asa estéril o palillo de cóctel. Para la detección de bibliotecas mutantes al azar, inocular el caldo con 10 μl del stock al azar biblioteca mutante (TraDIS biblioteca).
   1. Incubar las cepas de K. pneumoniae en baja de sal LB los medios a 37 ° C con agitación y las cepas de S. pneumoniae en cerebro corazón infusión (BHI) medios de comunicación, estáticamente a 37 ° C.
   2. Transferencia de la cultura durante la noche para un tubo de 15 mL y centrifugar en una centrífuga de mesa durante 10 min a 3.200 x g en batiente cubos con inserciones de tubo de 15 mL y tapas herméticas de aerosol.
   3. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 2 mL de 1 x de tampón fosfato salino (PBS).
      Nota: Eliminar sobrenadante a través de la ruta residuos biológica líquida apropiada en el laboratorio. El propósito de los pasos de centrifugación y resuspensión (1.2.2 y 1.2.3) es concentrar las bacterias para fácil visualización en el gradiente. Cultivos bacterianos se pueden cargar directamente el gradiente si se prefiere. Las cepas fuertemente encapsuladas no podrán formar una pelotilla apretada. Si esto ocurre, quite tanto sobrenadante como sea posible sin la eliminación de las células bacterianas, agregue 1 x PBS a un volumen final de 5 mL y resuspender el precipitado. Seguir el protocolo con paso 1.2.5.
   4. Para cepas no mucoides, vaya al paso 2.
   5. Centrifugar los tubos como se describe en el paso 1.2.2.
   6. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 2 mL de PBS 1 x. Las células ahora están listas para usar.
      Nota: La densidad de la suspensión de la célula bacteriana no es crítica pero debe ser suficiente para la visualización en el gradiente. Un mínimo de OD₆₀₀ (densidad óptica a 600 nm) de 4 sugiere.

2. preparación de diluciones de gradiente y mini-gradiente prueba

1. Preparar diluciones de gradiente.
   Nota: Concentraciones exactas de medio gradiente de densidad (e.g., Percoll) necesarias en los gradientes de densidad para lograr buena separación variará dependiendo de las condiciones de tensión y crecimiento bacteriano utilizadas. En primer lugar, se realizan pruebas de mini-gradiente para identificar las concentraciones que le dará la mejor separación. Estos comprenden 500 μl de una dilución individual en un tubo de 2 mL. Si las bacterias se extrae el gradiente y subcultivadas para aplicaciones posteriores, estos pasos deben realizarse bajo condiciones asépticas.
   1. Combinar medio de gradiente de densidad con 1 x PBS para hacer las diluciones de gradiente de densidad. Hacer diluciones del 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% y 80% (e.g., 2 mL de la densidad del gradiente medio más 8 mL de PBS 1 x = 10 mL del gradiente medio de 20% densidad).
   2. Alícuota de 500 μl de la dilución de gradiente de 20% en un tubo de 2 mL de cada cepa a ensayar (por ejemplo,, 4 cepas = 4 tubos conteniendo 500 μl de dilución gradiente 20%).
   3. Repita el paso 2.1.2 para el resto de las diluciones de gradiente.
2. Aplicar bacterias al gradiente.
   1. 100 μl de las células bacterianas que preparó en los pasos 1.2.3 y 1.2.6 a la parte superior de cada dilución gradiente siguiendo los pasos siguientes se aplican.
      1. Tomar 100 μl de células mediante una pipeta μl 200 y coloque la punta de la pipeta en el tubo justo por debajo del menisco de la gradiente de mini.
      2. Aspire muy lentamente las células bacterianas en el gradiente de modo que formen una capa en la parte superior de la pendiente, sin ninguna mezcla de la interfaz.
      3. Repita los pasos 2.2.1.1–2.2.1.2 para todas las cepas a probar.
   2. Usando un rotor de ángulo fijo con una tapa apretada del aerosol, centrifugar los tubos preparados en una microcentrífuga durante 10 min a 8.000 x g.
   3. Después de la centrifugación, transferir los tubos a un estante para visualizar la dilución gradiente mínima necesaria para conservar las células justo por encima de la capa de degradado después de centrifugación.
   4. Si los resultados no son claros, repita la prueba de gradiente mini con incrementos de 5% de densidad gradiente medio las diluciones por encima y por debajo de las concentraciones definidas en el paso 2.1.1 (por ejemplo, diluciones de 25% y 35% de, deben analizarse si el resultado en el 30% es ambiguo).
      Nota: Ver figura 2A de resultados típicos en una dilución media gradiente de densidad única.
   5. Utilizar los resultados de los pasos 2.2.3–2.2.4 para determinar las diluciones gradiente ideal utilizar para separar las células en mayor escala los gradientes discontinuos.

3. preparación de células para el experimento principal

1. Preparar cultivos durante la noche frescas al inocular 10 mL de caldo apropiado como se describe en el paso 1.2.
   1. Incubar los cultivos durante la noche en condiciones adecuadas como se describe en el paso 1.2.1.
   2. De la pelotilla de la cultura durante la noche como se describe en el paso 1.2.2.
2. Lavar las células como se describe en el paso 1.2.3.
3. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 1 mL de PBS 1 x. Si la cepa es mucoide y no de pellets fácilmente, Resuspender el precipitado en hasta 2 mL de PBS o restos de medios. Las células ahora están listas para usar.

4. preparación de gradientes discontinuos de densidad

Nota: Un método alternativo de preparación degradado de fondo (más concentrada) al principio (menos concentrado) con una pipeta se describe en el paso 7.

1. Pipeta de 1 mL de la dilución de gradiente de densidad más diluida en un polipropileno de 5 mL redondo tubo inferior para formar la capa superior, más diluida, del gradiente.
   Nota: capas posteriores de diluciones más concentradas de gradiente se añadirá debajo de esta capa utilizando una aguja, para que no se alteran las capas. Se recomiendan un mínimo de dos y máximo tres capas gradiente de 1 mL para separación de sólidos y fácil visualización de las bacterias.
   1. Utilizando una jeringa desechable de 1 mL con una aguja de 1.5 pulgadas unida, tomar 1 mL de la siguiente más concentrada densidad gradiente medio dilución en la jeringa. Evitar tomar el aire, las burbujas pueden interrumpir las capas de degradado.
   2. Coloque el extremo de la aguja en la parte inferior del tubo que contiene la primera capa. Aspire el contenido de la jeringa muy lentamente para evitar la mezcla de la interfaz.
      Nota: La interfaz de las dos diluciones se levantará como la dilución más concentrada de degradado se añade. Observar la interfaz sosteniendo hasta la luz o una ventana exterior. Si no se observa interfaz distinta, deseche el gradiente y empezar de nuevo.
      1. Retire la aguja de la gradiente muy suavemente para no molestar a la interfaz entre las diferentes diluciones de gradiente. Coloque el tubo en un bastidor adecuado para mantenerlo vertical.
   3. Si utiliza tres diferentes diluciones, repita los pasos 4.1.1–4.1.2.1 para que la dilución más densa está en el fondo. Si el gradiente se ha construido con éxito, habrá tres capas distintas con ninguna mezcla en las interfaces.

5. Añadir las células preparadas a gradientes y separación por centrifugación

1. Añadir 600 μl de células preparadas en el paso 3.3 a la parte superior del gradiente en el tubo muy lentamente y sin mezclar la interfaz, como se describe en el paso 2.2.
2. Colocar los tubos en los adaptadores de tubo y pesar el combinado adaptadores y los tubos para asegurarse de que estén equilibrados.
   1. Colocar los adaptadores de tubo en un rotor de ángulo fijo dentro de una centrífuga de mesa. Centrifugar por 30 min a 3.000 x g.
   2. Después de la centrifugación, cuidadosamente retirar los tubos, colocar en un bastidor adecuado y los resultados de la fotografía como un registro.
3. Se recuperan las fracciones bacterianas para cuantificación de ácido urónico o la extracción de ADN siguiendo el paso 6.
   1. Si no se requieren aplicaciones downstream, disponer de muestras/gradientes a través de la ruta residuos biológica líquida apropiada en el laboratorio.
      Nota: Es importante validar la separación para nuevas especies/cepas de bacterias. Fracciones individuales de la pendiente deben ser examinadas por microscopía, ensayo de ácido urónico (paso 8), o un ensayo cuantitativo adecuado para confirmar el fenotipo cápsula de cada fracción. Si el objetivo es separar en base a la agregación o tamaño de celda, puede usarse independiente ensayos apropiados.

6. recuperación de fracciones de la muestra y consecuencia opcional paso

1. Recuperar las fracciones de un gradiente por retirar y desechar cualquier líquido de la dilución superior si ninguna fracción bacteriana está presente en esa capa.
   1. Para eliminar la fracción superior, utilice una pipeta P200 y suavemente pasar la punta de la pipeta a través de la pendiente a la fracción y tomar la fracción. Colocar la fracción en un tubo de 1,5 mL y etiquetar apropiadamente.
   2. Para recuperar otras fracciones, todavía con la pipeta de la P200, inserte la punta suavemente a través del gradiente para la fracción y recuperar la fracción a un nuevo tubo 1,5 mL. Quitar exceso pendiente como se accede a las fracciones más abajo del gradiente.
   3. Si la extracción de ADN de una fracción con números muy bajos de células es subcultura requiere (p. ej., densidad-TraDISort), la fracción siguiendo el protocolo de paso 6.2 para consecuencia opcional obtener más células.
      Nota: Habrá un nivel bajo de contaminación por arrastre de las células en la parte superior del gradiente en fracciones inferiores, como fracciones se quitan de arriba a abajo. Minimizar esto al trabajar con cuidado para que no se mezcle el gradiente, utilizando una aguja para remover fracciones menores y al realizar la purificación de las muestras de muy baja abundancia donde arrastre puede afectar los resultados.
2. Transferencia de las células de la fracción de baja abundancia, recuperado en 6.1.1–6.1.2 pasos en 5 mL de medio líquido apropiado. Coloque en una incubadora y crecer por 2 h a 37 ° C.
   1. Después de 2 h de crecimiento o cuando la muestra ha alcanzado un OD₆₀₀ de 1, transferencia de la cultura a un tubo de 15 mL. Centrifugar el tubo durante 10 min a 3.200 x g en una centrífuga con batiente de cubetas y tapas herméticas de aerosol. Eliminar el sobrenadante
   2. Resuspender el precipitado de células en 1 mL de 1 x PBS.
3. Preparar un gradiente de densidad de concentración solo fresca en un tubo de polipropileno de 5 mL. Utilizar la concentración gradiente desde justo por encima de la ubicación de la fracción del gradiente original (por ejemplo, para la purificación del mutanteslyA Δ se muestra en la figura 2D, se utilizarán 15% densidad gradiente de medio).
   Nota: este paso de la purificación es opcional.
   1. Las células se aplican a la parte superior de la centrífuga como se describe en los pasos 2.2 y 5.1 y el degradado.
   2. Retirar los tubos de la centrifugadora y colocar en un estante apropiado. Fotografiar el gradiente y recuperar la fracción de extracción de ADN como se indica en 6.1 – 6.1.2.
      Nota: La muestra está ahora lista para la extracción de ADN y otras aplicaciones posteriores.

7. otro método para preparación degradado de fondo (más concentrada) al principio (menos concentrada) usando una pipeta

1. Utilizar las diluciones gradiente determinadas en el paso 2.2.3. Utilizando una pipeta de μL 1.000, añadir 1 mL de la dilución de gradiente más densa a un tubo de 5 mL.
   1. Con una pipeta de 200 μL, añadir 200 μL de la dilución siguiente de gradiente densa muy lentamente a la parte superior de la capa en el tubo, para que no se mezcle la interfaz. Agregar 200 μL otra y luego la final 600 μl. adición de volúmenes más pequeños múltiples da más control sobre la velocidad de pipeteado y evita la mezcla de la interfaz. Si la interfaz de mezcla, desechar y comenzar de nuevo.
   2. Repita el paso 7.1.1 con la tercera, menos densa concentración gradiente si se utilizan tres diluciones. El tubo ahora debe tener gradientes de 2 mL o 3 mL dependiendo de los resultados del paso 2.2.3.
   3. Vaya al paso 5 del protocolo para agregar celdas y seguir el experimento.

8. medición de la cantidad de cápsulas por ensayo de ácido urónico

1. Ajustar el OD₆₀₀ de cada fracción recuperada a 4.0 por dilución en PBS. Proceder con la cuantificación de ácidos urónicos como previamente publicados¹.

Resultados representativos se muestran en la figura 2. El resultado exacto esperar dependerá de la especie bacteriana, la creación de los gradientes de densidad, y si el usuario está examinando una cepa o un grupo de mutantes. Mayoría de las cepas se migrará a una única ubicación dentro de un gradiente, como se muestra en la figura 2A y 2D. Aplicación del método en una biblioteca de mutantes bacteriana dará lugar a una importante banda arriba el gradiente, una banda menos denso distribuido a través de la capa superior de la pendiente y una fracción de menor acapsular en la parte inferior (figura 2B). Estas fracciones se diferencian en cantidad de cápsula como se muestra en un ensayo para ácidos urónicos (figura 2B). Secuencia de inserción de transposones de fracciones individuales resulta en clara localización de mutantes específicos en diferentes fracciones de gradiente, como se muestra para el locus de la biosíntesis de la cápsula de ATCC43816 de K. pneumoniae (figura 2C). Resultados representativos para cultivos puros de NTUH-K2044 de K. pneumoniae y S. pneumoniaey otra cápsula biosíntesis o mutantes regulatorios, se muestran en la figura 2D.

Figura 1 : Esquema del método de centrifugación de densidad para separar las bacterias, basadas en cápsulas y sus aplicaciones. (A) una imagen de microscopia electrónica de un encapsulado Klebsiella pneumoniae celular. La cápsula es visible como una capa densa en el exterior de la célula. (B) aplicaciones de la centrifugación de la densidad para el estudio de bacterias encapsuladas. (Bi) Separación de densidad puede utilizado para generar fracciones alta, baja y no-cápsula de una biblioteca de transposon mutante y seguido por la secuencia de inserción transposones definir genes que influyen en la producción de cápsula. (Bii) Purificación de bacterias encapsuladas de una muestra compleja. (Biii) Uso de separación por densidad para comparaciones rápidas de cápsula cantidad entre muestras. Este método también permite la visualización de la heterogénea producción de cápsula en poblaciones bacterianas, como se muestra en (Biii). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Resultados representativos. (A) ejemplo de la salida de las pruebas de mini-gradiente. Dos diferentes cepas de K. pneumoniae se centrifugaron en 1 mL de 15% densidad gradiente medio. Hypermucoviscous NTUH K2044 tensión se mantiene por encima de la capa media gradiente de densidad, mientras que ATCC43816 (que hace menos cápsula) que migra a la parte inferior de la capa. (Bi) Uso de un gradiente de densidad para separar una biblioteca mutante transposon en tres fracciones. Tenga en cuenta que la fracción de la parte inferior contiene una baja proporción de mutantes y no es visible en esta imagen. (Bii) Validación de diferentes cantidades de cápsula en la parte superior, media y fracciones de la parte inferior usando un análisis de ácidos urónicos. Las células de la parte inferior superior, media y pequeño fracciones fueron aisladas y se resuspendió en PBS a una OD600 de 4, entonces la cápsula de polisacáridos extraídos y ácidos urónicos miden1. (C) resultados de densidad-TraDISort ejemplo. Ubicaciones de mutación identificadas se muestran por líneas azules sobre el esquema de cromosoma. Mutantes que carecen de cápsula pueden ser identificados como aquellos que están presentes en la biblioteca entrada pero se agotan en la fracción superior y enriqueciéndose en la fracción de la parte inferior, como se muestra aquí para la biosíntesis de la cápsula del lugar geométrico8. (D) un ejemplo de uso de centrifugación gradiente de densidad para comparar cantidad cápsula entre el tipo salvaje y mutantes cepas de K. pneumoniae NTUH-K2044 y 23F de S. pneumoniae . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores tienen intereses financieros a revelar.