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Genetics

कैप्सूल राशि एक सतत घनत्व ढाल का उपयोग करके बैक्टीरिया को अलग

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58679
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Wellcome Sanger Institute, Wellcome Genome Campus, 2Department of Medicine, University of Cambridge

Summary

हम कैप्सूल उत्पादन के आधार पर बैक्टीरियल आबादी को अलग करने के लिए सतत घनत्व ढाल के उपयोग का प्रदर्शन । इस विधि के लिए संस्कृतियों के बीच कैप्सूल राशि की तुलना, एक विशिष्ट कैप्सूल phenotype के साथ म्यूटेंट अलग, या कैप्सूल नियामकों की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. यहां वर्णित अनुकूलन और परख के चल रहा है ।

Abstract

कैप्सूल कई बैक्टीरियल प्रजातियों में एक प्रमुख डाह कारक है, प्रतिरक्षा चोरी और विभिन्न शारीरिक तनाव के लिए प्रतिरोध मध्यस्थता. जबकि कई तरीकों और अलग उपभेदों या म्यूटेंट के बीच कैप्सूल उत्पादन की तुलना करने के लिए उपलब्ध हैं, वहाँ वे उत्पादन कितना कैप्सूल के आधार पर बैक्टीरिया छँटाई के लिए कोई व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि है. हम कैप्सूल राशि से बैक्टीरिया अलग करने के लिए एक विधि विकसित की है, एक सतत घनत्व ढाल का उपयोग कर. इस विधि के कैप्सूल मात्रा अर्द्ध मात्रात्मक संस्कृतियों के बीच तुलना करने के लिए प्रयोग किया जाता है, बदल कैप्सूल उत्पादन के साथ म्यूटेंट को अलग करने के लिए, और जटिल नमूनों से capsulated बैक्टीरिया को शुद्ध करने के लिए. इस विधि भी कैप्सूल विनियमन में शामिल जीन की पहचान करने के लिए transposon-सम्मिलन अनुक्रमण के साथ युग्मित किया जा सकता है । यहां, विधि विस्तार से प्रदर्शित किया जाता है, कैसे एक नया जीवाणु प्रजातियों या तनाव के लिए ढाल की स्थिति का अनुकूलन करने सहित, और कैसे निर्माण और घनत्व ढाल चलाने के लिए ।

Introduction

कई जीवाणु प्रजातियों के एक polysaccharide कैप्सूल है, जो विभिन्न शारीरिक तनाव से बैक्टीरिया की कोशिका की रक्षा और मान्यता और प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा हत्या से बचाता है । Klebsiella निमोनियामें, कैप्सूल उत्पादन1,2संक्रमण के लिए एक निरपेक्ष आवश्यकता है । निमोनिया कैप्सूल रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स प्रतिरोध करने के लिए विरोध मध्यस्थता, पूरक मध्यस्थता की हत्या करने के लिए प्रतिरोध, phagocytosis की रोकथाम, और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के दमन3. अतिरिक्त कैप्सूल उत्पादन वृद्धि हुई डाह और समुदाय के साथ जुड़ा हुआ है-अधिग्रहीत (बजाय nosocomial) संक्रमण4.

कैप्सूल उत्पादन की जांच करने के लिए मात्रात्मक और गुणात्मक परीक्षणों की एक श्रेणी उपलब्ध है । Klebsiella प्रजातियों के लिए, इन स्ट्रिंग परीक्षण5शामिल हैं, जिसमें एक दंर्तखोदनी एक कॉलोनी को छुआ ऊपर की ओर खींच लिया है और मापा उत्पादित स्ट्रिंग की लंबाई, और mucoviscosity परख6, जो की धीमी गति के केंद्रापसारक शामिल एक संस्कृति supernatant के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के बाद । इन तरीकों सरल और जल्दी कर रहे हैं, लेकिन कमी संवेदनशीलता जब शास्त्रीय Klebsiella उपभेदों पर इस्तेमाल के बजाय कैप्सूल reproducing उपभेदों । कैप्सूल ठहराव की एक और विधि uronic एसिड परख है, जो तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है और केंद्रित सल्फर एसिड1के उपयोग की आवश्यकता है । अंत में, कैप्सूल सीधे माइक्रोस्कोपी (आंकड़ा 1a) द्वारा दिखाई देता है । इन तरीकों में से, केवल माइक्रोस्कोपी एक ही आबादी के भीतर अलग capsulation राज्यों का पालन करने के लिए उपयोगकर्ता की अनुमति देता है, और इन तरीकों में से कोई भी capsulated और गैर capsulated बैक्टीरिया की शारीरिक जुदाई सक्षम बनाता है ।

घनत्व आधारित जुदाई ढाल केंद्रापसारक द्वारा नियमित रूप से सेल जीवविज्ञान में इस्तेमाल के लिए विभिंन eukaryotic सेल7प्रकार शुद्ध कर रहे हैं, लेकिन शायद ही कभी सूक्ष्मजीवविज्ञानी अनुसंधान में प्रयोग किया जाता है । Klebsiella के लिए mucoviscosity परख अवलोकन पर आधारित है कि अत्यधिक capsulated बैक्टीरिया केंद्रापसारक द्वारा गोली करने के लिए और अधिक समय ले, और हम कारण है कि यह capsulated कोशिकाओं के कम समग्र घनत्व के कारण हो सकता है । यहां दिखाया विधि कैप्सूल राशि से शारीरिक रूप से अलग K. निमोनिया आबादी के लिए विकसित किया गया था, घनत्व ढाल केंद्रापसारक का उपयोग (चित्रा 1). यह विधि स्ट्रेप्टोकोकस निमोनियाके लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था, यह दर्शाता है कि यह अन्य जीवाणु प्रजातियों के लिए लागू है । एक संतृप्त transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय transposon-सम्मिलन अनुक्रमण (घनत्व-TraDISort) के साथ युग्मित के घनत्व ढाल जुदाई कैप्सूल उत्पादन और विनियमन8में शामिल जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है । इसी प्रकार, इस विधि का उपयोग गैर-capsulated K. निमोनिया म्यूटेंट को अलग करने के लिए व्यक्तिगत कॉलोनियों के रैंडम-प्राइम पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के साथ संयोजन के रूप में किया गया था । इस विधि भी विभिंन आबादी और शर्तों के बीच कैप्सूल उत्पादन की तेजी से तुलना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या जटिल नमूनों से capsulated बैक्टीरिया शुद्ध (आंकड़ा 1b) । अंत में, वहां परख अंय phenotypes कि इस तरह के सेल आकार या एकत्रीकरण के रूप में घनत्व को प्रभावित करने का विकल्प है ।

इस पांडुलिपि को दर्शाता है कि कैसे एक नए जीवाणु प्रजातियों या तनाव के लिए प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए और निर्माण दर्शाता है और एक सतत घनत्व ढाल के चलाने के लिए हाइपर अलग-capsulated, capsulated और गैर capsulated बैक्टीरिया ।

Protocol

नोट: सुनिश्चित करें कि जीवाणु उपभेदों के लिए लागू किसी भी जोखिम आकलन जब संवर्धन और हैंडलिंग नमूनों का पालन कर रहे हैं । ध्यान रखें कि एक समय में बहुत अधिक ग्रेडिएंट्स सेट करने से शामिल धीमे pipetting से जोड़ों पर होने वाले दबाव के कारण पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस विकार हो सकते हैं. योजना काम और चोट से बचने के लिए सावधानियों ले ।

1. बैक्टीरियल उपभेदों या उत्परिवर्ती पुस्तकालयों की तैयारी

  1. तनाव से बाहर लकीर उचित आगार प्लेटों पर परीक्षण किया जाएगा । ये प्रयोग के लिए स्टॉक प्लेटें हैं ।
    1. एकल कालोनियों को प्राप्त करने के लिए वांछित तापमान पर रात भर प्लेटें । इस प्रयोग के लिए, संस्कृति K निमोनिया (NTUH-K2044 और ATCC43816 उपभेदों) पर Luria शोरबा (पौंड) ३७ डिग्री सेल्सियस पर आगर, और एस निमोनिया (23F जंगली प्रकार और 23F Δसीपीएस) पर एक humidified मोमबत्ती जार में ३७ ° c.
  2. एक स्टॉक प्लेट (१.१ कदम) से एक ही कॉलोनी उठाओ उचित शोरबा के 10 मिलीलीटर inoculate एक बाँझ पाश या कॉकटेल स्टिक का उपयोग कर । यादृच्छिक उत्परिवर्ती पुस्तकालयों की स्क्रीनिंग के लिए, inoculate यादृच्छिक उत्परिवर्ती पुस्तकालय स्टॉक (TraDIS लाइब्रेरी) के 10 µ एल के साथ शोरबा ।
    1. कंपन कम नमक पौंड मीडिया में ३७ डिग्री सेल्सियस पर मिलाते के साथ निमोनिया उपभेदों, और मस्तिष्क हार्ट अर्क (BHI) मीडिया में निमोनिया उपभेदों, स्थिर रूप से ३७ डिग्री सेल्सियस पर ।
    2. एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए रातोंरात संस्कृति हस्तांतरण और एक बेंच टॉप में ३,२०० x जी में 10 मिनट के लिए ऊपर केंद्रापसारक 15 मिलीलीटर ट्यूब आवेषण और एयरोसोल तंग ढक्कन के साथ बाल्टी बाहर स्विंग में ।
    3. supernatant त्यागें और 1x फास्फेट के 2 मिलीलीटर बफर खारा (पंजाब) में गोली resuspend ।
      नोट: प्रयोगशाला में उपयुक्त तरल जैविक अपशिष्ट मार्ग के जरिए supernatant का निपटारा. इस केंद्रापसारक और resuspension कदम (1.2.2 और 1.2.3) के प्रयोजन के लिए ढाल पर आसान दृश्य के लिए बैक्टीरिया ध्यान केंद्रित है । बैक्टीरियल संस्कृतियों सीधे ढाल पर लोड किया जा सकता है अगर पसंद है । भारी capsulated उपभेदों एक तंग गोली फार्म नहीं हो सकता है । यदि ऐसा होता है, किसी भी जीवाणु कोशिकाओं को हटाने के बिना जितना संभव हो उतना supernatant निकालें, 5 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा में 1x पंजाबियों जोड़ने और गोली resuspend । प्रोटोकॉल चरण 1.2.5 के साथ जारी रखें ।
    4. गैर-mucoid उपभेदों के लिए, चरण 2 पर जाएं ।
    5. कदम 1.2.2 में वर्णित के रूप में ट्यूबों के केंद्रापसारक ।
    6. supernatant छोड़ें और 1x पंजाब के 2 मिलीलीटर में गोली resuspend । कक्ष अब उपयोग करने के लिए तैयार हैं ।
      नोट: बैक्टीरियल कोशिका निलंबन के घनत्व महत्वपूर्ण नहीं है, लेकिन ढाल में दृश्य के लिए पर्याप्त होने की जरूरत है । 4 के एक ंयूनतम आयुध डिपो६०० (६०० एनएम पर ऑप्टिकल घनत्व) का सुझाव दिया है ।

2. ढाल कमजोर पड़ने और मिनी ढाल परीक्षण की तैयारी

  1. ग्रेडिएंट कमजोरियां तैयार करें ।
    नोट: घनत्व ढाल माध्यम की सटीक सांद्रता (जैसे, Percoll) घनत्व ढाल में की जरूरत अच्छी जुदाई को प्राप्त करने के जीवाणु तनाव और विकास की स्थिति के आधार पर अलग किया जाएगा । मिनी ढाल परीक्षण पहले प्रदर्शन कर रहे हैं, एकाग्रता है कि सबसे अच्छा जुदाई दे देंगे की पहचान करने के लिए । ये एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में एक कमजोर पड़ने के ५०० µ एल शामिल हैं । यदि बैक्टीरिया ढाल और बहाव अनुप्रयोगों के लिए उपसंस्कृत से निकाला जाएगा, इन चरणों अपूतित शर्तों के तहत किया जाना चाहिए ।
    1. घनत्व ढाल कमजोर पड़ने बनाने के लिए 1x पंजाबियों के साथ घनत्व ढाल मध्यम गठबंधन । 20%, 30%, ४०%, ५०%, ६०%, ७०%, और ८०% (जैसे, घनत्व ढाल मध्यम से अधिक 8 मिलीलीटर की 2 मिलीलीटर 1x पंजाब के = 10 मिलीलीटर 20% घनत्व ढाल मध्यम) के कमजोर पड़ने बनाओ ।
    2. Aliquot ५०० µ एल के 20% ढाल कमजोर पड़ने के लिए एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में प्रत्येक तनाव के लिए परीक्षण किया जा (जैसे, 4 उपभेदों = 4 ५०० µ l से युक्त 20% ढाल कमजोर पड़ने के एल ट्यूब) ।
    3. ढाल कमजोर पड़ने के आराम के लिए कदम 2.1.2 दोहराएं ।
  2. ढाल पर बैक्टीरिया लागू होते हैं ।
    1. लागू करें १०० कदम में तैयार बैक्टीरियल कोशिकाओं के µ एल 1.2.3 और 1.2.6 नीचे दिए गए चरणों का पालन प्रत्येक ढाल कमजोर पड़ने के शीर्ष करने के लिए ।
      1. एक २०० µ l पिपेट का उपयोग कर कोशिकाओं के १०० µ एल ले लो और बस मिनी ढाल के meniscus के नीचे ट्यूब के पक्ष पर पिपेट टिप जगह है ।
      2. महाप्राण ढाल पर बैक्टीरियल कोशिकाओं को बहुत धीरे से इतना है कि वे ढाल के शीर्ष पर एक परत के रूप में, किसी भी अंतरफलक के मिश्रण के बिना ।
      3. दोहराएं कदम 2.2.1.1-सभी उपभेदों के लिए 2.2.1.2 परीक्षण किया जाना है ।
    2. एक एयरोसोल तंग ढक्कन के साथ एक निश्चित कोण रोटर का उपयोग कर, 10 मिनट के लिए एक microcentrifuge में ८,००० x जीमें तैयार ट्यूबों केंद्रापसारक
    3. केंद्रापसारक के बाद, एक रैक के लिए ट्यूबों के हस्तांतरण के लिए ंयूनतम ढाल कमजोर पड़ने के लिए बस ढाल परत निंनलिखित केंद्रापसारक ऊपर बनाए रखने की आवश्यकता के ऊपर की कल्पना ।
    4. यदि परिणाम स्पष्ट नहीं कर रहे हैं, 5% घनत्व ढाल मध्यम कमजोर पड़ने की वृद्धि के साथ मिनी ढाल परीक्षण दोहराने और नीचे कदम 2.1.1 में परिभाषित सांद्रता (जैसे, 25% और ३५% कमजोर पड़ने का परीक्षण किया जाना चाहिए अगर 30% पर परिणाम अस्पष्ट है) ।
      नोट: एक एकल घनत्व ढाल मध्यम कमजोर पड़ने पर विशिष्ट परिणामों के लिएएक चित्र 2देखें ।
    5. बड़े पैमाने पर निरंतर ग्रेडिएंट में कक्षों को अलग करने के लिए आदर्श ग्रेडिएंट कमजोरियां निर्धारित करने के लिए चरण 2.2.3 – 2.2.4 से परिणामों का उपयोग करें.

3. मुख्य प्रयोग के लिए कक्षों की तैयारी

  1. १.२ कदम में वर्णित के रूप में उपयुक्त शोरबा के 10 मिलीलीटर inoculating द्वारा ताजा रातोंरात संस्कृतियों तैयार करते हैं ।
    1. कदम 1.2.1 में वर्णित के रूप में उपयुक्त परिस्थितियों में रातोंरात संस्कृतियों गर्मी ।
    2. कदम 1.2.2 में वर्णित के रूप में रात भर संस्कृति गोली ।
  2. चरण 1.2.3 में बताए गए अनुसार कक्षों को धोएं ।
  3. supernatant त्याग और 1x पंजाब के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend । यदि तनाव mucoid है और गोली आसानी से नहीं करता है, अप करने के लिए में गोली resuspend 2 पंजाबियों या अवशिष्ट मीडिया के मिलीलीटर । कक्ष अब उपयोग करने के लिए तैयार हैं ।

4. सतत घनत्व ढाल की तैयारी

नोट: नीचे से ढाल तैयार करने का एक वैकल्पिक तरीका (सबसे केंद्रित) ऊपर (कम ध्यान केंद्रित) एक पिपेट का उपयोग कर चरण 7 में वर्णित है ।

  1. पिपेट एक 5 मिलीलीटर में सबसे पतला घनत्व ढाल कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर गोल नीचे ट्यूब दौर के शीर्ष, सबसे पतला, ढाल की परत के रूप में ।
    नोट:     और अधिक केंद्रित ढाल कमजोर पड़ने के बाद की परतों इस परत के नीचे एक सुई का उपयोग कर जोड़ा जाएगा, ताकि परतों को बाधित नहीं है । दो और अधिकतम 1 एमएल के तीन ढाल परतों की एक ंयूनतम एक मजबूत जुदाई और बैक्टीरिया की आसान दृश्य के लिए सिफारिश कर रहे हैं ।
    1. एक १.५ इंच सुई संलग्न के साथ एक 1 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सिरिंज का उपयोग करना, सिरिंज में अगले सबसे केंद्रित घनत्व ढाल मध्यम कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर ले । किसी भी हवा लेने से बचें, के रूप में बुलबुले ढाल परतों को बाधित कर सकते हैं ।
    2. पहली परत युक्त ट्यूब के तल पर सुई अंत प्लेस । महाप्राण सिरिंज सामग्री बहुत धीरे इंटरफेस मिश्रण से बचने के लिए ।
      नोट: दो कमजोर पड़ने के इंटरफेस के रूप में अधिक केंद्रित ढाल कमजोर पड़ने के रूप में वृद्धि होगी जोड़ा है । यह प्रकाश या एक बाहर खिड़की करने के लिए पकड़ द्वारा इंटरफेस का निरीक्षण । यदि कोई अलग अंतरफलक नहीं मनाया जाता है, ढाल त्यागें और फिर से शुरू करते हैं ।
      1. ढाल से सुई निकालें बहुत धीरे ताकि अलग ढाल कमजोर पड़ने के बीच इंटरफेस परेशान करने के लिए नहीं । एक उपयुक्त रैक में ट्यूब प्लेस इसे ईमानदार रखने के लिए ।
    3. यदि तीन विभिन्ना कमजोरयों का प्रयोग करें तो दोहराएँ कदम शुू – 4.1.2.1 ताकि घने कमजोर पड़ने पर सबसे नीचे । ढाल सफलतापूर्वक निर्माण किया गया है, तो इंटरफेस पर कोई मिश्रण के साथ तीन अलग परतों हो जाएगा ।

5. ढाल और जुदाई से तैयार कोशिकाओं को जोड़ने के द्वारा केंद्रापसारक

  1. जोड़ें ६०० µ से तैयार कोशिकाओं के एल कदम ३.३ में ढाल के शीर्ष करने के लिए ट्यूब बहुत धीरे और इंटरफ़ेस मिश्रण के बिना, के रूप में चरण २.२ में वर्णित.
  2. ट्यूब एडेप्टर में ट्यूबों प्लेस और संयुक्त एडेप्टर और वे संतुलित कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए ट्यूबों तौलना.
    1. एक बेंच-टॉप केंद्रापसारक के भीतर एक निश्चित कोण रोटर में ट्यूब एडेप्टर प्लेस । ३,००० x जीपर 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक
    2. केंद्रापसारक के बाद, ध्यान से ट्यूबों को दूर, उंहें एक उपयुक्त रैक में जगह है, और एक रिकार्ड के रूप में परिणाम तस्वीर ।
  3. चरण 6 का पालन करके uronic एसिड ठहराव या डीएनए निष्कर्षण के लिए बैक्टीरियल अंशों को पुनर्प्राप्त करें ।
    1. यदि बहाव आवेदन की आवश्यकता नहीं है, प्रयोगशाला में उपयुक्त तरल जैविक अपशिष्ट मार्ग के माध्यम से नमूनों के निपटान/
      नोट: यह नई प्रजातियों के लिए अलग प्रमाणित करने के लिए महत्वपूर्ण है/ ढाल से अलग भिन्न सूक्ष्म द्वारा जांच की जानी चाहिए, uronic एसिड परख द्वारा (8 कदम), या एक अन्य उपयुक्त मात्रात्मक परख प्रत्येक अंश के कैप्सूल phenotype की पुष्टि करने के लिए. यदि उद्देश्य एकत्रीकरण या कोशिका के आकार के आधार पर अलग करने के लिए है, स्वतंत्र उपयुक्त परख इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

6. वसूली नमूना भिंन और वैकल्पिक वृद्धि कदम

  1. हटाने और शीर्ष कमजोर पड़ने से किसी भी तरल त्याग द्वारा एक ढाल से भागों पुनर्प्राप्त अगर कोई जीवाणु अंश उस परत के भीतर मौजूद है ।
    1. शीर्ष अंश निकालने के लिए, किसी P200 पिपेट का उपयोग करें और पिपेट टिप को ग्रैडिएंट के माध्यम से भिंन पर ले जाएं, और भिंन को लें । एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब और लेबल में अंश उचित रूप में रखें ।
    2. आगे अंशों को पुनर्प्राप्त करने के लिए, अभी भी P200 पिपेट का उपयोग करते हुए, अंश को ग्रैडिएंट के माध्यम से धीरे से टिप डालें और एक ताजा १.५ एमएल ट्यूब करने के लिए भिन्न पुनर्प्राप्त करें । अतिरिक्त ग्रेडिएंट को हटाने के रूप में भिंन ग्रैडिएंट तक पहुंच रहे हैं ।
    3. यदि एक बहुत कम सेल संख्या युक्त अंश से डीएनए निष्कर्षण की आवश्यकता है (जैसे, घनत्व के लिए TraDISort), उपसंस्कृति वैकल्पिक वृद्धि के लिए ६.२ कदम से प्रोटोकॉल का पालन करके भिंन अधिक कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए ।
      नोट: निचले अंशों में ग्रेडिएंट के शीर्ष पर कक्षों से carryover का निम्न स्तर होगा, क्योंकि भिन्नों को ऊपर से नीचे तक निकाला जाता है. सावधानी से काम कर इतना के रूप में ढाल मिश्रण करने के लिए नहीं, एक सुई का उपयोग करके कम भागों को दूर करने से इस को कम, और फिर से प्रदर्शन बहुत कम बहुतायत नमूनों की शुद्धि जहां carryover परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं ।
  2. कम बहुतायत अंश से स्थानांतरण कोशिकाओं 6.1.1-6.1.2 उपयुक्त तरल मीडिया के 5 मिलीलीटर में चरणों में बरामद किया । एक मशीन में प्लेस और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए बढ़ती है ।
    1. विकास के 2 ज या जब नमूना 1 के एक आयुध डिपो६०० तक पहुंच गया है के बाद, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के लिए संस्कृति हस्तांतरण । ३,२०० में एक्स जी पर 10 मिनट के लिए ट्यूब केंद्रापसारक बाहर बाल्टी और एयरोसोल तंग ढक्कन स्विंग के साथ एक केंद्रापसारक में । supernatant को छोड़ें
    2. 1x पंजाब के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend ।
  3. एक 5 एमएल के ट्यूब में एक ताजा एकल एकाग्रता घनत्व ढाल तैयार करें । सिर्फ मूल ढाल में अंश के स्थान के ऊपर से ढाल एकाग्रता का प्रयोग करें (उदाहरण के लिए, ΔslyA उत्परिवर्ती की शुद्धि के लिए चित्रा 2डी में दिखाया गया है, 15% घनत्व ढाल माध्यम का इस्तेमाल किया जाएगा) ।
    नोट:     यह पुनः शुद्धि चरण वैकल्पिक है ।
    1. ग्रेडिएंट के शीर्ष पर कक्षों को लागू करें और चरण २.२ और ५.१ में वर्णित के रूप में केंद्रापसारक ।
    2. एक उपयुक्त रैक में केंद्रापसारक और जगह से ट्यूबों निकालें । तस्वीर ढाल और डीएनए निष्कर्षण के लिए अंश ठीक के रूप में 6.1 में वर्णित-6.1.2 ।
      नोट: नमूना अब डीएनए निष्कर्षण या अंय बहाव अनुप्रयोगों के लिए तैयार है ।

7. नीचे से ढाल तैयारी के लिए वैकल्पिक विधि (सबसे केंद्रित) ऊपर से (कम ध्यान केंद्रित) एक पिपेट का उपयोग

  1. चरण 2.2.3 में निर्धारित ग्रेडिएंट कमजोर पड़ने का उपयोग करें । एक १,००० µ एल पिपेट का उपयोग कर, एक 5 मिलीलीटर ट्यूब के लिए घने ढाल कमजोर पड़ने के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    1. एक २०० µ एल पिपेट का प्रयोग, अगले घने ढाल कमजोर पड़ने के २०० µ एल जोड़ने बहुत धीरे ट्यूब में परत के शीर्ष पर है, तो के रूप में मिश्रण नहीं अंतरफलक । एक और २०० µ एल जोड़ें और फिर अंतिम ६०० µ एल जोड़ने एकाधिक छोटे संस्करणों pipetting गति पर अधिक नियंत्रण देता है और इंटरफेस के मिश्रण से बचाता है. यदि इंटरफ़ेस घोला जा सकता है, त्यागें और फिर से शुरू ।
    2. तीन कमजोर पड़ने का इस्तेमाल किया जा रहा है, तो तीसरे, कम घने ढाल एकाग्रता के साथ कदम 7.1.1 दोहराएँ । ट्यूब अब या तो 2 मिलीलीटर या 3 एमएल चरण 2.2.3 से परिणामों के आधार पर की ढाल होना चाहिए ।
    3. कक्षों को जोड़ने और प्रयोग जारी रखने के लिए प्रोटोकॉल के चरण 5 पर जाएं ।

8. Uronic एसिड परख द्वारा कैप्सूल राशि का माप

  1. पंजाबियों के साथ कमजोर पड़ने से ४.० के लिए प्रत्येक बरामद अंश के आयुध डिपो६०० समायोजित करें । पहले प्रकाशित1के रूप में uronic एसिड की ठहराव के साथ आगे बढ़ें ।

Representative Results

प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2में दिखाए जाते हैं. सटीक परिणाम की उंमीद करने के लिए बैक्टीरियल प्रजातियों पर निर्भर करेगा, सेट घनत्व ढाल के ऊपर है, और क्या उपयोगकर्ता एक ही तनाव या म्यूटेंट के एक पूल की जांच कर रहा है । अधिकांश उपभेदों एक ग्रेडिएंट के भीतर एक ही स्थान पर माइग्रेट करेंगे, जैसा चित्र 2a और 2d में दिखाया गया है । एक बैक्टीरियल उत्परिवर्ती पुस्तकालय के लिए विधि लागू ढाल के ऊपर एक प्रमुख बैंड को जंम देना होगा, एक कम घने ढाल के ऊपरवाला परत के माध्यम से वितरित बैंड, और नीचे एक छोटी सी acapsular अंश (चित्रा 2ख) । इन भिन्न कैप्सूल राशि में अलग uronic एसिड के लिए एक परख द्वारा दिखाए गए के रूप में (चित्रा 2बी). Transposon सम्मिलन sequencing अलग भिन्न ग्रैडिएंट भिन्न के भीतर विशिष्ट म्यूटेंट के स्पष्ट स्थानीयकरण में परिणाम, K. निमोनिया ATCC43816 (चित्रा 2C) के कैप्सूल के लिए के रूप में दिखाया गया लोकस. कश्मीर निमोनिया की शुद्ध संस्कृतियों के लिए प्रतिनिधि परिणाम NTUH-K2044 और एस निमोनिया, और विभिन्न कैप्सूलों के लिए अलग कैप्सूल या विनियामक म्यूटेंट, चित्रा 2डीमें दिखाए जाते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : कैप्सूल के आधार पर अलग बैक्टीरिया के लिए घनत्व केंद्रापसारक विधि की योजनाबद्ध, और इसके अनुप्रयोगों । (क) एक capsulated Klebsiella निमोनिया कोशिका के एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवि । यह कैप्सूल कोशिका के बाहर की ओर घने परत के रूप में दिखाई देता है । (ख) capsulated बैक्टीरिया के अध्ययन के लिए घनत्व केंद्रापसारक के आवेदन । (Bi) घनत्व जुदाई उच्च उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कम, और नहीं कैप्सूल एक transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय के अंशों और transposon प्रविष्टि अनुक्रमण द्वारा पीछा जीन परिभाषित करने के लिए कि कैप्सूल उत्पादन प्रभाव । (बीि) एक जटिल नमूना से capsulated बैक्टीरिया का शुद्धिकरण. (Biii) नमूनों के बीच कैप्सूल राशि की तेजी से तुलना के लिए घनत्व आधारित जुदाई का प्रयोग करें । इस विधि भी बैक्टीरियल आबादी में heterogenous कैप्सूल उत्पादन के दृश्य की अनुमति देता है, के रूप में (Biii) में दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : प्रतिनिधि परिणाम । (A) मिनी-ग्रेडिएंट परीक्षणों से आउटपुट का उदाहरण. दो अलग K. निमोनिया उपभेदों 15% घनत्व ढाल मध्यम के 1 मिलीलीटर पर केंद्रापसारक थे । hypermucoviscous NTUH-K2044 तनाव घनत्व ढाल मध्यम परत के ऊपर बनी हुई है, जबकि ATCC43816 (जो कम कैप्सूल बनाता है) परत के नीचे की ओर जाता है । (Bi) एक घनत्व ढाल का उपयोग करने के लिए तीन भागों में एक transposon उत्परिवर्ती पुस्तकालय अलग । ध्यान दें कि नीचे अंश म्यूटेंट की एक कम अनुपात है और इस तस्वीर पर दिखाई नहीं है । (बीि) ऊपरी, मध्यम, और नीचे uronic एसिड के लिए एक परख का उपयोग कर भागों में अलग कैप्सूल राशि का सत्यापन । ऊपर से कोशिकाओं, मध्य, और पार कर नीचे भागों अलग कर रहे थे और एक आयुध डिपो में resuspend 4 के६०० , तो कैप्सूल polysaccharides निकाले और uronic एसिड1मापा । (ग) उदाहरण घनत्व-TraDISort परिणाम । उत्परिवर्तन की पहचान स्थानों गुणसूत्र आरेख के ऊपर नीली लाइनों द्वारा दिखाए जाते हैं । म्यूटेंट कमी कैप्सूल इनपुट पुस्तकालय में मौजूद हैं, लेकिन शीर्ष अंश में समाप्त कर रहे हैं, जबकि नीचे अंश में समृद्ध किया जा रहा है, के रूप में कैप्सूल के लिए यहाँ दिखाया के रूप में पहचान की जा सकती है लोकस संश्लेषण8. (घ) घनत्व ढाल केंद्रापसारक का उपयोग करने के लिए जंगली प्रकार और K. निमोनिया के उत्परिवर्ती उपभेदों के बीच कैप्सूल राशि की तुलना NTUH-K2044 और एस निमोनिया 23F का एक उदाहरण है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

कैप्सूल K. निमोनिया3, स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया9, Acinetobacter10, और नेइसेरिया11 प्रजातियों सहित कई जीवाणु प्रजातियों में एक महत्वपूर्ण डाह कारक है । हालांकि विभिन्न तरीकों ठहराव और बैक्टीरियल कैप्सूल के दृश्य के लिए मौजूद हैं, वर्तमान में वहाँ कोई व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है शारीरिक रूप से अलग capsulated और गैर-capsulated कोशिकाओं के लिए विधि. इस अनुच्छेद में, हम कैप्सूल के लिए एक मजबूत विधि-बैक्टीरियल आबादी की जुदाई आधारित है, विभिंन नदी के नीचे या बहाव प्रोटोकॉल के साथ संयोजन के रूप में कई संभावित अनुप्रयोगों के साथ प्रदर्शन किया है ।

एक सतह कैप्सूल की उपस्थिति बैक्टीरियल कोशिका घनत्व को कम कर सकते हैं, जो घनत्व ढाल केंद्रापसारक (चित्रा 2डी) द्वारा जुदाई की अनुमति देता है । हम में इस विधि की पुष्टि की है K. निमोनिया NTUH-K204412 औरATCC43816 13 के रूप में अच्छी तरह के रूप में स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया 23F में14 और उसके Δसीपीएस उत्परिवर्ती15. इस विधि घनत्व ढाल के मुख्य घटक के रूप में16 Percoll का उपयोग करता है, जो लेपित कोलाइडयन सिलिका कणों कि कम चिपचिपापन और बैक्टीरिया की दिशा में कोई विषाक्तता है-सिद्धांत में, अंय पदार्थों की बैठक इन मानदंडों की जा सकती का निलंबन है घनत्व ढाल स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया ।

यह सुनिश्चित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है कि विभिन्न घनत्व की परतों मिश्रण नहीं है जब घनत्व ढाल का निर्माण, और अगर मिश्रण होता है, जुदाई विधि साफ परिणाम नहीं दे देंगे. हम ढाल डालने के लिए दो वैकल्पिक तरीकों को शामिल किया है, एक सुई या एक पिपेट का उपयोग-दोनों प्रभावी हैं, और जो विधि का उपयोग करने के लिए बस वरीयता की बात है. सभी कदम है कि एक पदार्थ pipetting शामिल करने के लिए (या तो एक बैक्टीरियल निलंबन, या एक और अधिक पतला ढाल परत) एक ढाल परत के ऊपर, pipetting छोटे संस्करणों के कई aliquots यह आसान परतों के किसी भी मिश्रण के बिना एक तेज अंतरफलक को प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं ।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि अंय जीवाणु प्रजातियों के साथ अपने प्रदर्शन की गारंटी नहीं किया जा सकता है । इसलिए, यह महत्वपूर्ण है जब एक नए जीवाणु प्रजातियों या तनाव की जांच के लिए घनत्व आधारित जुदाई एक अतिरिक्त, स्वतंत्र कैप्सूल ठहराव विधि का उपयोग कर पुष्टि । उपयुक्त कैप्सूल दाग के साथ सूक्ष्म द्वारा प्रत्येक अंश में मौजूद बैक्टीरिया visualizing जो विस्तृत प्रोटोकॉल उपलब्ध है17के लिए एक विश्वसनीय विधि है । वैकल्पिक रूप से, uronic एसिड युक्त कैप्सूल (जैसे ई कोलाई और K. निमोनियाके उन के रूप में) एक विशिष्ट परख द्वारा quantified जा सकता है के रूप में चित्रा 2बी1में दिखाया गया है । इस केंद्रापसारक आधारित mucoviscosity परीक्षण एक स्वतंत्र सत्यापन विधि के रूप में उपयुक्त नहीं है, के रूप में इस परख भी बैक्टीरियल कोशिकाओं के घनत्व पर निर्भर करता है ।

इस विधि की एक और सीमा है कि कैप्सूल उत्पादन बहुत संस्कृति की स्थिति के प्रति संवेदनशील है, और विकास के लिए भी छोटे परिवर्तन मध्यम, तापमान, या वातन इस परख के परिणामों को प्रभावित कर सकता है । इस समस्या को कम करने के लिए, शोधकर्ताओं का उपयोग कर सकते हैं एक परिभाषित वृद्धि मध्यम या एक बैच-संगत जटिल माध्यम, अन्य सभी वृद्धि पैरामीटर प्रयोगों के बीच समान रखें, और अप्रत्याशित परिणामों की व्याख्या को सक्षम करने के लिए उपयुक्त नियंत्रण उपभेदों शामिल . कुछ बैक्टीरियल कैप्सूल नाजुक है और कोशिका से दूर कतरनी कर सकते है जब संस्कृतियों pipetted हैं । कैप्सूल के बाल काटना से बचने के लिए, संस्कृतियों और शुरू कर दिया जाना चाहिए नहीं ढाल पर लदान के लिए तैयारी के दौरान दो बार से अधिक resuspend । यदि संस्कृतियों की एकाग्रता के दौरान कैप्सूल की हानि समस्याग्रस्त रहता है, बैक्टीरियल संस्कृतियों एक घनत्व ढाल सीधे लागू किया जा सकता है, बैक्टीरियल निलंबन की एक बड़ी मात्रा के साथ जोड़ा यदि दृश्य के लिए आवश्यक है ।

इस विधि के भविष्य अनुप्रयोगों के लिए यह अन्य जीवाणु प्रजातियों के लिए लागू होते हैं, और विभिन्न नदी के नीचे और बहाव प्रौद्योगिकियों के साथ संयोजन के रूप में इस जुदाई का उपयोग करने के लिए. घनत्व के अलावा-TraDISort8, हम सुझाव है कि capsulated बैक्टीरिया के घनत्व ढाल जुदाई बदल कैप्सूल के साथ म्यूटेंट के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, मिश्रित संस्कृतियों या जटिल नमूनों से capsulated कोशिकाओं के शोधन के लिए, और के लिए कई उपभेदों में कैप्सूल उत्पादन की तेजी से profiling । अंत में, इस तकनीक को एकत्रीकरण जैसे अन्य जीवाणु phenotypes की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Disclosures

लेखकों के पास कोई वित्तीय हितों का खुलासा नहीं है.

Acknowledgments

हम जिन-शहर वांग और ट्विटर साल्टर की आपूर्ति उपभेदों के लिए धंयवाद, और उपयोगी विचार विमर्श के लिए Parkhill समूह के सदस्य हैं । यह काम वेलकम ओरिजिनल इंस्टिट्यूट (वेलकम ग्रांट २०६१९४) द्वारा वित्त पोषित किया गया था, और एक सर हेनरी वेलकम postdoctoral फेलोशिप से F.L.S. (ग्रांट 106063/ M.J.D. को वेलकम सैंज इंस्टीट्यूट पीएचडी की छात्राओं ने सपोर्ट किया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500 mL buckets Eppendorf 5810 718.007
Adapters for 15 mL tubes Eppendorf 5810 722.004
Fixed andgle rotor F-34-6-38 Eppendorf 5804 727.002
2.6 to 7 mL tube adapter Eppendorf 5804 739.000
Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11 Eppendorf 5424 000.460
2 mL tubes Eppendorf 0030 120.094
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120.086
5 mL polypropylene round bottom tube Falcon 352063
1 mL disposable syringe Luer slip Becton Dickinson 300013
AGANI Needle 21G Green x 1.5" Terumo AN 2138R1
P1000 pipette and tips
P200 pipette and tips

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References

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आनुवंशिकी अंक १४३ सतत घनत्व ढाल कैप्सूल TraDIS hypermucoidy Klebsiella
कैप्सूल राशि एक सतत घनत्व ढाल का उपयोग करके बैक्टीरिया को अलग
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Feltwell, T., Dorman, M. J.,… More

Feltwell, T., Dorman, M. J., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient. J. Vis. Exp. (143), e58679, doi:10.3791/58679 (2019).

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