Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

הפרדת חיידקים על ידי כמות הקפסולה באמצעות הדרגה צפיפות מקוטע

Published: January 7, 2019 doi: 10.3791/58679
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2
1Wellcome Sanger Institute, Wellcome Genome Campus, 2Department of Medicine, University of Cambridge

Summary

נדגים את השימוש צפיפות מקוטע הדרגתיים כדי להפריד בין אוכלוסיות חיידקים המבוססת על ייצור כמוסה. שיטה זו משמשת כדי להשוות בין כמות קפסולה בין תרבויות, לבודד מוטנטים עם פנוטיפ קפסולה ספציפית, או כדי לזהות הרגולטורים כמוסה. המתוארים כאן הוא אופטימיזציה ריצה של וזמינותו.

Abstract

הקפסולה היא גורם מפתח התקפה אלימה חיידקי מינים רבים, מתווכים חיסוניים התחמקות, עמידות בפני לחצים פיזיים שונים. בעוד שיטות רבות זמינים לכמת ולהשוות ייצור קפסולה בין זנים או מוטציות, לא קיימת בשימוש נרחב שיטה למיון חיידקים מבוססת על כמה כמוסה שהם מייצרים. פיתחנו שיטה להפרדת חיידקים על ידי כמות קפסולה, באמצעות הדרגה צפיפות מקוטע. שיטה זו משמשת כדי להשוות כמויות קפסולה באופן כמותי למחצה בין תרבויות, לבודד מוטנטים עם ייצור קפסולה מסולף, לטהר את החיידקים capsulated מדגימות מורכבים. שיטה זו יכולה גם להיות יחד עם transposon-הכניסה רצף לזיהוי גנים המעורבים בוויסות כמוסה. כאן, השיטה הוא הפגין בפירוט, כולל כיצד לייעל את התנאים הדרגתיות עבור מינים חדשים חיידקי או זן, וכיצד לבנות ולהפעיל את ההדרגה צפיפות.

Introduction

מינים חיידקיים רבים מייצרים קפסולה רב-סוכר, אשר מגנה את תא החיידק לחצים פיזיים שונים, זיהוי והרג על-ידי המערכת החיסונית. קלבסיאלה pneumoniae, ייצור קפסולה היא דרישה מוחלטת זיהום1,2. ק' pneumoniae כמוסה שמתווכת עמידות מיקרוביאלית פפטידים, עמידות הרג בתיווך המשלים, מניעת phagocytosis ולאחר דיכוי של תגובה חיסונית מולדת3. ייצור עודף קפסולה משויכת התקפה אלימה מוגברת וזיהומים רכשה הקהילה (ולא nosocomial)4.

מגוון של בדיקות והמעצרים כמותיים זמינים לחקור ייצור כמוסה. עבור מינים קלבסיאלה , אלה כוללים את מחרוזת הבדיקה5, בו קיסם נגע למושבת נמשך כלפי מעלה, למדוד אורך המחרוזת המיוצר, ו mucoviscosity assay6, אשר מערבת את צנטריפוגה איטי של תרבות ואחריו מדידת צפיפות אופטית תגובת שיקוע. שיטות אלה פשוטה ומהירה, אך חסרי רגישות בעת שימוש בקלאסית קלבסיאלה זנים ולא קפסולה זנים יצרה יותר מדי. שיטה נוספת של כימות קפסולה היא וזמינותו חומצה uronic, אשר הוא טכנית מאתגר ודורש השימוש של חומצה גופרתית מרוכזת1. לבסוף, כמוסה מוצגת ישירות על ידי מיקרוסקופ (איור 1 א'). השיטות האלה, רק במיקרוסקופ מאפשר למשתמש לצפות capsulation שונה הברית בתוך אוכלוסיה אחת, אף אחת משיטות אלה מאפשר ההפרדה הפיזית של חיידקים capsulated-capsulated.

הפרדות צבע מבוססות-צפיפות על ידי צנטריפוגה הדרגתיות משמשים באופן שגרתי לטהר את סוגי התאים האיקריוטים7ב ביולוגיה של התא, אך משמשים לעתים נדירות במחקר מיקרוביולוגית. וזמינותו mucoviscosity עבור קלבסיאלה מתבסס על התצפית כי חיידקים capsulated מאוד לארוך זמן רב יותר כדי הצניפה על ידי צנטריפוגה, אנחנו הסיק כי ייתכן שהסיבה מופחתת הכוללת צפיפות של תאים capsulated. השיטה המוצגת כאן פותחה כדי להפריד בין אוכלוסיות ק' pneumoniae פיזית על ידי כמות קפסולה, באמצעות צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות (איור 1). שיטה זו הופעלה בהצלחה pneumoniae סטרפטוקוקוס, המציין כי זה החלים מיני חיידקים אחרים. צפיפות-הדרגה ההפרדה של ספריית מוטנטים רוויים transposon יחד עם transposon-הכניסה רצף (צפיפות-TraDISort) שימש לזיהוי גנים המעורבים קפסולה ייצור, תקנה8. באופן דומה, שיטה זו שימשה בשיתוף עם פריים אקראי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) של מושבות בודדות כדי לבודד-capsulated ק' pneumoniae מוטציות. שיטה זו יכולה לשמש גם להשוואות מהירה של קפסולה ייצור בין אוכלוסיות שונות בתנאים, או לטהר חיידקים capsulated מדגימות מורכבים (איור 1B). לבסוף, יש האפשרות assay פנוטיפים אחרים המשפיעים על צפיפות, כגון גודל התא או צבירה.

כתב יד זה מדגים כיצד לייעל את ההליך עבור מינים חדשים חיידקי או זן ומדגים את הבנייה ואת הריצה של מעבר הדרגתי צפיפות רציף כדי להפריד בין חיידקים היפר-capsulated, capsulated ו- capsulated.

Protocol

הערה: ודא כי כל הערכות סיכונים החלים זני חיידקים הם דבקו כאשר culturing וטיפול דגימות. שימו לב כי הקמת מעברי צבע מדי בבת אחת יכולה להוביל בהפרעות שרירים עקב הלחץ על המפרקים מ איטי pipetting מעורב. תוכנית עבודה ולנקוט אמצעי זהירות כדי למנוע פציעות.

1. הכנת זני חיידקים או ספריות מוטציה

  1. פס החוצה הזנים כדי להיבדק על פלטות אגר המתאים. אלה הם לוחות מניות עבור הניסוי.
    1. דגירה הלוחות בן לילה על הטמפרטורה הרצויה להשגת קולוניות יחיד. עבור ניסוי זה,, תרבות pneumoniae ק' (זנים NTUH-K2044 ו- ATCC43816) על אגר מרק (LB) לוריא-37 ° C, ו ס pneumoniae (23F פראי סוג ו- Δ 23Fcps) על אגר דם בתוך צנצנת humidified הנר ב 37 º C.
  2. לבחור מושבה בודדת מצלחת מניות (שלב 1.1) לחסן 10 מ ל מרק המתאים באמצעות לולאה סטרילי או מקל קוקטייל. להקרנה של ספריות מוטציה אקראית, לחסן המרק עם 10 µL של המניה ספריית מוטציה אקראית (ספריית טרדיס).
    1. דגירה ק' pneumoniae זנים של תקשורתי LB מלח נמוך ב 37 מעלות צלזיוס ברעידות, וללחצים ס pneumoniae בתקשורת אינפוזיה (BHI) הלב המוח, באופן סטטי ב 37 º C.
    2. להעביר את התרבות לילה צנטריפוגה ומפרידה ספסל-top 10 דקות ב- 3,200 g x במתוך דליים עם 15 מ"ל צינור מוסיף ומכסים חזק תרסיס ובשעות 15 מ"ל.
    3. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 2 מ ל 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS).
      הערה: להיפטר supernatant דרך המתאימה נוזלי ביולוגי פסולת המסלול במעבדה. מטרת השלבים צנטריפוגה ו- resuspension (1.2.2 ו- 1.2.3) היא לרכז את החיידקים להמחשת קל במעבר הצבע. תרבויות חיידקי יכול להיטען ישירות על גבי המילוי ההדרגתי אם מועדף. זנים בכבדות capsulated אולי לא בצורת גלולה חזק. במקרה זה, להסיר כמה שיותר תגובת שיקוע ככל האפשר מבלי להסיר תאים חיידקיים, להוסיף 1 x PBS נפח הסופי של 5 מ"ל, resuspend בגדר. המשך הפרוטוקול עם צעד 1.2.5.
    4. עבור זנים שאינם-mucoid, עבור לשלב 2.
    5. Centrifuge הצינורות כפי שמתואר בשלב 1.2.2.
    6. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 2 מ ל 1 x PBS. תאים הם עכשיו מוכן לשימוש.
      הערה: הצפיפות של התליה תא החיידק אינו קריטי, אבל צריך להיות מספיק עבור ויזואליזציה במעבר הצבע. OD המינימלי600 (צפיפות אופטית על 600 ננומטר) של 4 הוא הציע.

2. הכנת דילולים הדרגתיות ובדיקה הדרגתי מיני

  1. להכין דילולים הדרגתיות.
    הערה: ריכוז המדויק של צפיפות בינונית מעבר הצבע (לדוגמה, Percoll) צורך במעברי צבע צפיפות להשיג הפרדה טובה ישתנו בהתאם לתנאים זן וצמיחה בקטריאלי בשימוש. הדרגה מיני בדיקות מבוצעות תחילה, כדי לזהות הריכוזים שתעניק את ההפרדה הטוב ביותר. אלה מהווים µL 500 לדילול יחיד צינור 2 מ"ל. אם חיידקים שחולצו מן המילוי ההדרגתי, subcultured עבור יישומים במורד הזרם, שלבים אלה צריכה להתבצע בתנאים אספטי.
    1. משלבים צפיפות בינונית מעבר צבע עם PBS 1 x כדי להפוך דילולים הדרגתי של צפיפות. להפוך דילולים של 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ו- 80% (למשל, 2 מ של צפיפות בינונית הדרגתיות פלוס 8 מ של PBS 1 x = 10 מ"ל של 20% צפיפות בינונית מעבר צבע).
    2. Aliquot µL 500 של 20% דילול הדרגתי לתוך צינור 2 mL עבור כל זן להיבדק (למשל, זנים 4 = 4 צינורות המכיל 500 µL של דילול הדרגתי 20%).
    3. חזור על שלב 2.1.2 למשך שארית דילולים הדרגתיות.
  2. חיידקים חלות על מעבר הצבע.
    1. החל µL 100 של תאים חיידקיים שהוכנו בשלבים 1.2.3 ו 1.2.6 לחלק העליון של כל דילול הדרגתי השלבים שלהלן.
      1. תופסים µL 100 של תאים באמצעות פיפטה µL 200 ולמקם את הטיפ פיפטה בצד הצינור מתחת במניסקוס מעבר הצבע המצומצמת.
      2. האחות של תאים חיידקיים על גבי המילוי ההדרגתי מאוד לאט כך הם יוצרים שכבה על מעבר הצבע, ללא ערבוב של הממשק.
      3. חזור על צעדים 2.2.1.1–2.2.1.2 עבור זנים כל להיבדק.
    2. באמצעות רוטור זווית קבועה עם מכסה הדוק תרסיס, centrifuge את צינורות מוכנים microcentrifuge 10 דקות ב x 8000 g.
    3. לאחר צנטריפוגה, העברת הצינורות מתלה כדי להמחיש דילול הדרגתי המינימלי הנדרש כדי לשמור את התאים בדיוק מעל שכבת צבע בעקבות צנטריפוגה.
    4. אם התוצאות אינן ברורות, חזור על מבחן הדרגתי מיני עם בהפרשים של 5% דחיסות צבע בינוני דילולים לעיל, להלן ריכוז מוגדרים צעד 2.1.1 (למשל דילולים 25% ו- 35%, צריך להיבדק אם התוצאה ב- 30% הוא רב-משמעי).
      הערה: ראה איור 2א לתוצאות טיפוסי-צפיפות יחיד לדילול ההדרגתי בינוני.
    5. השתמש התוצאות של צעדים 2.2.3–2.2.4 כדי לקבוע את דילולים הדרגתיות אידיאלי לשימוש כדי להפריד בין תאים ורחבה במעברי צבע רציף.

3. הכנה של תאים הניסוי הראשי

  1. הכן טרי תרבויות לילה על ידי מזריקים 10 מ ל מרק המתאים כמתואר בשלב 1.2.
    1. דגירה התרבויות ללון בתנאים המתאימים כמתואר בשלב 1.2.1.
    2. גלולה התרבות לילה כפי שמתואר בשלב 1.2.2.
  2. לשטוף את התאים כפי שמתואר בשלב 1.2.3.
  3. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 1 מ"ל של PBS 1 x. אם המתח הוא mucoid, לא גלולה בקלות, resuspend בגדר של עד 2 מ של PBS או מדיה שיורית. תאים הם עכשיו מוכן לשימוש.

4. הכנה של מעברי צבע צפיפות מקוטע

הערה: שיטה חלופית של הכנה הדרגתיות מלמטה (הכי מרוכז) למעלה (לפחות מרוכז) באמצעות פיפטה מתואר בשלב 7.

  1. פיפטה 1 מ"ל של דילול הדרגתי צפיפות שתדללו ביותר לתוך פוליפרופילן 5 מ ל סיבוב התחתית התחתונה כדי ליצור את השכבה העליונה, שתדללו ביותר, של מעבר הצבע.
    הערה:     עוקבים שכבות של דילולים מרוכז יותר הדרגתי יתווספו מתחת לשכבה זו באמצעות מחט, כדי לא לשבש את השכבות. מינימום של 2, לכל היותר שלוש שכבות צבע של 1 מ ל כל אחד מומלץ עבור ההפרדה חזקים והדמיה קל של חיידקים.
    1. באמצעות מזרק חד פעמיות 1 מ"ל עם מחט 1.5 inch המצורפת, לקחת 1 מ"ל של הבא הכי מרוכז צפיפות צבע בינוני דילול לתוך המזרק. הימנע מלקחת את כל האוויר, כמו בועות יכול לשבש את השכבות ההדרגתי.
    2. מקם את קצה המחט בחלק התחתון של הצינור המכיל את השכבה הראשונה. וארוקן את תוכן המזרק לאט מאוד כדי למנוע ערבוב של הממשק.
      הערה: הממשק של דילולים שני יעלו דילול הדרגתי מרוכז יותר מתווספת. התבונן בממשק על ידי מחזיק אור או חלון חיצוני. אם אין ממשק ייחודי הוא ציין, מחק את מעבר הצבע ולהתחיל שוב.
      1. הסר את המחט מעבר הצבע בעדינות כדי לא להפריע הממשק בין דילולים מעבר צבע שונה. מקם את הצינור מתלה מתאים כדי לשמור את זה זקוף.
    3. אם באמצעות שלושה דילולים שונים, חזור על השלבים 4.1.1–4.1.2.1 כך דילול הצפוף נמצאת בתחתית. אם המילוי ההדרגתי נבנתה בהצלחה, יהיו שלוש שכבות נפרדות עם כל ערבוב בכל הממשקים.

5. הוספת תאים מוכן מעברי צבע והפרדה על ידי צנטריפוגה

  1. להוסיף 600 µL של תאים מוכן מהשלב 3.3 העליון של מעבר הצבע בצינור באיטיות וללא ערבוב הממשק, כפי שמתואר בשלב 2.2.
  2. למקם את הצינורות צינור מתאמי ולשקול את מתאמי משולב, צינורות כדי להבטיח שהם מאוזנים.
    1. מקום מתאמי שפופרת של הרוטור זווית קבועה בתוך צנטריפוגה ספסל-העליון. צנטריפוגה למשך 30 דקות ב x 3000 g.
    2. לאחר צנטריפוגה, בזהירות להסיר את הצינורות, מקם אותם בתוך ארון תקשורת מתאימים, ולצלם את התוצאות כרשומה.
  3. לשחזר את השברים חיידקי על כימות חומצה uronic או מיצוי DNA על-ידי ביצוע בשלב 6.
    1. אם יישומי הזרם אינם נדרשים, תשליך דגימות/מעברי צבע באמצעות המתאים נוזלי ביולוגי פסולת המסלול במעבדה.
      הערה: חשוב לאמת את ההפרדה עבור מינים חדשים/זנים של חיידקים. שברים בודדים של מעבר הצבע צריך להיבדק על ידי מיקרוסקופ, על ידי assay חומצה uronic (שלב 8), או עוד assay כמותיים מתאימים כדי לאשר את ותפקיד קפסולה של כל שבר. אם המטרה היא להפריד על בסיס צבירה או גודל תא, מבחני המתאים עצמאי אמור לשמש.

6. מחלים דוגמת שברים ומספרים שלב תוצר אופציונלי

  1. להתאושש השברים מעבר צבע על-ידי הסרת ומחיקת כל הנוזל. דילול העליון אם אין שבר חיידקי קיים בשכבה.
    1. כדי להסיר את השבר העליונים, להשתמש פיפטה P200 בעדינות להעביר את הטיפ פיפטה דרך מעבר הצבע השבר ו לקחת את השבר. מקום השבר לתוך צינור 1.5 mL, תווית כראוי.
    2. לשחזר שברים נוספים, עדיין באמצעות הפיפטה P200 להוסיף את הטיפ בעדינות דרך מעבר הצבע כדי השבר ולשחזר את השבר לרכבת התחתית mL 1.5 טריים. הסרת צבע עודף כמו השברים למטה מעבר הצבע מתבצעת.
    3. אם הדנ א החילוץ של שבר המכיל את מספרי הטלפון הנייד נמוך מאוד תת-תרבות הדרושים (למשל, עבור צפיפות-TraDISort), השבר לפי הפרוטוקול מ שלב 6.2 עבור תוצר אופציונלי להשיג יותר תאים.
      הערה: תהיה רמה נמוכה של דחויים מתאי בחלק העליון של מעבר הצבע לתוך התחתון שברים, כמו שברים יוסרו מלמעלה עד למטה. למזער את זה על-ידי עבודה בזהירות כדי לא לערבב מעבר הצבע, באמצעות מחט כדי להסיר שברים נמוכה יותר, ועל ידי ביצוע טיהור מחדש נמוך מאוד שפע דוגמאות של איפה דחויים עשויים להשפיע על התוצאות.
  2. העברת תאים מן השבר נמוכה-שפע התאושש ב צעדים 6.1.1–6.1.2 אל 5 מ של המדיה המתאימה נוזלי. מניחים בתוך אינקובטור ולגדול עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
    1. לאחר שעתיים של צמיחה או כאשר המדגם הגיעה עם יתר600 של 1, להעביר את התרבות צינור 15 מ"ל. Centrifuge את הצינור 10 דקות ב x 3,200 g ומפרידה עם הנדנדה החוצה דליים ומכסים חזק תרסיס. למחוק את תגובת שיקוע
    2. Resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של 1 x PBS.
  3. להכין מעבר צבע טרי יחיד-ריכוז צפיפות צינור פוליפרופילן 5 מ. השתמש את הריכוז הדרגתי מפני מעל המיקום של השבר במעבר הצבע המקורי (למשל, עבור טיהור של המוטציהslyA Δ שמוצג באיור 2ד', 15% צפיפות בינונית הדרגתיות היה לשמש).
    הערה:     שלב טיהור מחדש זה הוא אופציונלי.
    1. להחיל את התאים העליונה של מעבר צבע, צנטריפוגה כפי שתואר בשלבים 2.2 ו- 5.1.
    2. להסיר את הצינורות לצנטריפוגה ומניחים האצטבה המתאים. לצלם את ההדרגה ולשחזר את השבר להפקת DNA כמתואר ב- 6.1 – 6.1.2.
      הערה: המדגם מוכן כעת עבור הפקת דנ א או יישומים אחרים של הזרם.

7. שיטה חלופית להכנה הדרגתיות מלמטה (הכי מרוכז) למעלה (לפחות מרוכז) באמצעות פיפטה

  1. השתמש את דילולים הדרגתיות שנקבע בשלב 2.2.3. באמצעות פיפטה 1,000 µL, להוסיף 1 מ ל הצפוף דילול הדרגתי שפופרת 5 מ.
    1. באמצעות פיפטה 200 µL, הוסף 200 µL של דילול הדרגתי צפופה הבא לאט מאוד לחלק העליון של השכבה בצינור, כדי לא לערבב את הממשק. להוסיף עוד 200 µL ואת ואז סופית 600 µL. הוספת אמצעי אחסון קטן יותר מרובים נותן יותר שליטה על מהירות pipetting, מונע ערבוב של הממשק. אם הממשק מערבב, למחוק ולהתחיל שוב.
    2. חזור על שלב 7.1.1 עם ריכוז הדרגה השלישית, לפחות צפוף אם דילולים שלושה משמשות. הצינור צריך כעת מעברי צבע של 2 mL או 3 מ ל בהתאם לתוצאות מהשלב 2.2.3.
    3. עבור לשלב 5 של פרוטוקול כדי להוסיף תאים ולהמשיך את הניסוי.

8. מדידה של כמות קפסולה על ידי חומצה Uronic Assay

  1. התאימו את יתר600 של כל שבר התאושש ל 4.0 באמצעות דילול עם PBS. להמשיך עם כימות של חומצות uronic כפי שפורסמו בעבר1.

Representative Results

נציג התוצאות מוצגות באיור2. התוצאה המדויקת לצפות יהיה תלוי בזן חיידקי, הסידור של מעברי צבע צפיפות, ובודקים אם המשתמש הוא זן יחיד או הבריכה של מוטציות. רוב זני להעביר למיקום יחיד בתוך הדרגתי, כפי שמוצג באיור 2A ו- 2D- החלת שיטת ספריית מוטנטים חיידקי יהיה להצמיח להקה גדולה מעל המילוי ההדרגתי, להקה פחות צפוף מופץ דרך השכבה העליונה של מעבר הצבע, שבר acapsular מינור בתחתית (איור 2B). אלו שברים שונים בכמות קפסולה כפי שמוצג על ידי וזמינותו עבור חומצות uronic (איור 2B). Transposon רצף הכניסה של שברים בודדים התוצאה ברורה לוקליזציה של מוטציות ספציפיות בתוך שברים מעבר צבע שונה, כפי שמוצג על מיקומה ביוסינטזה קפסולה של ק' pneumoniae ATCC43816 (איור 2C). נציג תוצאות תרבויות טהור של pneumoniae ק' NTUH-K2044, pneumoniae ס, ו שונה ביוסינטזה קפסולה או מוטציות רגולטוריות, מוצגים באיור 2D.

Figure 1
איור 1 : סכימטי של השיטה צנטריפוגה צפיפות כדי להפריד בין חיידקים בהתבסס על קפסולה, ושימושיה. (א) תמונה מיקרוסקופ אלקטרונים של capsulated קלבסיאלה pneumoniae התא. הקפסולה מוצגת כשכבה צפופה על החלק החיצוני של התא. (B) יישומים של צפיפות צנטריפוגה לחדר העבודה של חיידקים capsulated. (Bi) צפיפות ההפרדה ניתן להיות המשמש ליצירת שברים גבוה - נמוך-, לא-כמוסה של ספריית מוטנטים transposon, ואחריו transposon רצף הכניסה להגדרת גנים המשפיעים על ייצור כמוסה. (Bii) טיהור של חיידקים capsulated מתוך מדגם מורכבים. (ביל) השימוש ההפרדה מבוססת-צפיפות להשוואות מהירה של סכום קפסולה בין דגימות. שיטה זו מאפשרת גם הפריט החזותי של ייצור כמוסה heterogenous אוכלוסיות חיידקים, כפי שמוצג (ביל). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : תוצאות נציג. (א) דוגמה של הפלט מבדיקות הדרגתי המצומצמת. שני שונים זנים pneumoniae ק' היו centrifuged על 1 מ"ל של 15% צפיפות בינונית הדרגתיות. Hypermucoviscous NTUH-K2044 המתח נשמר מעל צפיפות הדרגתיות שכבת בינוני, ואילו ATCC43816 (מה שהופך את הקפסולה פחות) יועברו לתחתית של השכבה. (Bi) השימוש הדרגתי צפיפות כדי להפריד בין ספריה מוטציה transposon לתוך שלושה שברים. שימו לב כי השבר התחתון מכיל שיעור נמוך של מוטציות, אינה מוצגת בתמונה זו. (Bii) אימות של כמויות שונות קפסולה העליון, האמצעי, שברים התחתון שימוש assay חומצות uronic. תאים מהחלק התחתון העליון, האמצעי ו גדולים מדי שברים היו מבודדים, resuspended ב- PBS יתר600 של 4, ואז קפסולת פוליסכרידים שחולצו ומדד חומצות uronic1. (ג) דוגמה צפיפות-TraDISort תוצאות. מוטציה במיקומים זיהה מוצגים על-ידי קווים כחולים מעל הדיאגרמה כרומוזום. ניתן לזהות מוטציות חסר כמוסה כמו אלה נמצאים בספריה קלט, אך דלה של השבר העליון תוך כדי להיות מועשר השבר התחתון, כמוצג כאן הביוסינתזה קפסולה לוקוס8. (ד) דוגמה של שימוש דחיסות צבע צנטריפוגה כדי להשוות בין כמות קפסולה בין פראי סוג מוטציה זנים של ק' pneumoniae NTUH-K2044 ו- ס' pneumoniae 23F. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

כמוסת הוא גורם חשוב התקפה אלימה במינים חיידקים רבים, כולל ק' pneumoniae3, סטרפטוקוקוס pneumoniae9, Acinetobacter10ו11 Neisseriaמינים. למרות שיטות שונות קיימים עבור כימות והדמיה של קפסולות חיידקים, כיום לא קיימת בשימוש נרחב שיטה להפרדת פיזית תאים capsulated ו- capsulated. במאמר זה, הראו שיטה חזקה מבוססת-קפסולת הפרדה בין אוכלוסיות חיידקים, עם מספר יישומים פוטנציאליים בשיתוף עם פרוטוקולים שונים במעלה או במורד הזרם.

הנוכחות של קפסולה משטח יכול להפחית את צפיפות תא החיידק, אשר מאפשר הפרדה על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות (איור 2D). הבדיקה והאימות בשיטה זו pneumoniae ק' NTUH-K204412 ו- ATCC4381613 וכן pneumoniae סטרפטוקוקוס 23F14 ו מוטנטיםcps 15שלה Δ. שיטה זו משתמשת Percoll16 כמו המכוננת הראשי של המילוי ההדרגתי צפיפות, אשר הוא השעיה של מצופה סיליקה colloidal חלקיקי בעל צמיגות נמוכה, אין הרעלת לכיוון חיידקים - בעקרון, חומרים אחרים ישיבות קריטריונים אלה יכול להיות להשתמש בה כדי לקבוע מעבר הצבע צפיפות.

זה יכול להיות מאתגר כדי להבטיח כי אל תערבב בין שכבות של צפיפות שונה כאשר בונים צפיפות מעברי צבע, אם ערבוב מתרחשות, שיטת ההפרדה לא ייתן תוצאות נקיות. כללנו בשתי שיטות חלופיות למזיגה של מעברי צבע, באמצעות מחט או פיפטה של – שניהם יעילים, באיזו שיטה להשתמש זה פשוט עניין של העדפה. עבור כל השלבים המערבות pipetting חומר (השעיה חיידקי, או שכבה הדרגתיות ובדילול) מעל שכבת צבע, pipetting aliquots מרובים של אמצעי אחסון קטן יותר יכול להקל על מנת להשיג ממשק חד ללא ערבוב של שכבות.

מגבלה של פרוטוקול זה היא כי לא ניתן להבטיח את הביצועים שלו עם מיני חיידקים אחרים. לכן, חיוני בעת בחינת מין חיידקים חדשים או להתאמץ כדי לאמת את ההפרדה מבוססת-צפיפות באמצעות שיטת כימות קפסולה נוספים, עצמאית. להמחיש את החיידקים נוכח כל שבר על ידי מיקרוסקופ עם כתמי קפסולה המתאימה היא שיטה אמינה אשר הם פרוטוקולים מפורט זמין17. לחלופין, ניתן לכמת קפסולות המכילה חומצות uronic (כגון אלה של Escherichia coli וק' pneumoniae) על ידי assay ספציפיים כפי שמוצג באיור 2ב'1. המבדק מבוסס צנטריפוגה mucoviscosity אינה מתאימה כשיטת אימות עצמאית, כמו assay זה גם תלוי הצפיפות של תאים חיידקיים.

הגבלה נוספת של שיטה זו היא ייצור קפסולה היא רגישה מאוד תרבות תנאי, אפילו שינויים קטנים מדיום הגידול, טמפרטורה, או לערבב עשויים להשפיע על התוצאות של זה וזמינותו. כדי למזער את הבעיה, חוקרים יכול להשתמש מדיום הגידול מוגדרים או מדיום מורכבים אצווה-עקבי לשמור פרמטרים אחרים הצמיחה זהים בין ניסויים, כולל זנים הפקד המתאים כדי לאפשר את הפרשנות של תוצאות בלתי צפויות . קפסולות חיידקים מסוימים הם שבירים, ניתן להטות מן התא כאשר תרבויות הם pipetted. כדי למנוע הטיה של קפסולות, תרבויות צריכה להיות centrifuged, resuspended לא יותר מפעמיים במהלך הכנה טעינה במעבר הצבע. אם אובדן של הקפסולה במהלך הריכוז של התרבויות נשאר בעייתי, תרבויות חיידקי ניתן להחיל על מעבר הדרגתי צפיפות ישירות, עם נפח גדול יותר של הבולם חיידקי הוסיף במידת הצורך עבור פריט חזותי.

יישומים עתידיים של שיטה זו הם כדי להחיל אותה על מיני חיידקים אחרים, וכדי להשתמש ההפרדה הזאת בשילוב עם טכנולוגיות שונות ויוצאת. בנוסף צפיפות-TraDISort8, אנו ממליצים כי צפיפות ההפרדה מעבר של חיידקים capsulated יכול לשמש עבור בידוד של מוטציות עם כמוסה מסולף, לטיהור של תאים capsulated תרבויות מעורבות או דוגמאות מורכבות, ועבור מהירה יצירת פרופילים לייצור קפסולה של זנים מרובים. לבסוף, ניתן להשתמש בטכנולוגיה זו לבחון אחרים פנוטיפים חיידקיים כגון צבירת.

Disclosures

המחברים יש אינטרסים כלכליים לא לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים וואנג ג'ין-טאון, סוזאנה סולטר לאספקת זנים, חברי הקבוצה Parkhill לדיונים מועיל. עבודה זו מומן על ידי המכון סנגר Wellcome (Wellcome גרנט 206194), ועל ידי מלגת פוסט-דוקטורט סר הנרי Wellcome F.L.S. (גרנט 106063/א/14/ת). M.J.D. נתמך על ידי Studentship PhD Wellcome המכון סנגר.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Percoll GE Healthcare 17-0891-01
Centrifuge 5810R with Rotor A-4-81 and 500 mL buckets Eppendorf 5810 718.007
Adapters for 15 mL tubes Eppendorf 5810 722.004
Fixed andgle rotor F-34-6-38 Eppendorf 5804 727.002
2.6 to 7 mL tube adapter Eppendorf 5804 739.000
Centrifuge 5424 including Rotor FA-45-24-11 Eppendorf 5424 000.460
2 mL tubes Eppendorf 0030 120.094
1.5 mL tubes Eppendorf 0030 120.086
5 mL polypropylene round bottom tube Falcon 352063
1 mL disposable syringe Luer slip Becton Dickinson 300013
AGANI Needle 21G Green x 1.5" Terumo AN 2138R1
P1000 pipette and tips
P200 pipette and tips

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Favre-Bonté, S., Licht, T. R., Forestier, C., Krogfelt, K. A. Klebsiella pneumoniae capsule expression is necessary for colonization of large intestines of streptomycin-treated mice. Infection and Immunity. 67 (11), 6152-6156 (1999).
  2. Bachman, M. A., et al. Genome-wide identification of Klebsiella pneumoniae fitness genes during lung infection. mBio. 6 (3), 1-9 (2015).
  3. Paczosa, M. K., Mecsas, J. Klebsiella pneumoniae: Going on the offense with a strong defense. Microbiology and Molecular Biology Reviews : MMBR. 80 (3), 629-661 (2016).
  4. Shon, A. S., Bajwa, R. P. S., Russo, T. A. Hypervirulent (hypermucoviscous) Klebsiella pneumoniae. Virulence. 4 (2), 107-118 (2014).
  5. Fang, C. -T., Chuang, Y. -P., Shun, C. -T., Chang, S. -C., Wang, J. -T. A novel virulence gene in Klebsiella pneumoniae. strains causing primary liver abscess and septic metastatic complications. The Journal of Experimental Medicine. 199 (5), 697-705 (2004).
  6. Lai, Y. -C., Peng, H. -L., Chang, H. -Y. RmpA2, an activator of capsule biosynthesis in Klebsiella pneumoniae CG43, regulates K2 cps gene expression at the transcriptional level. Journal of Bacteriology. 185 (3), 788-800 (2003).
  7. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. Journal of Visualized Experiments. (91), 1-10 (2014).
  8. Dorman, M. J., Feltwell, T., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. The capsule regulatory network of Klebsiella pneumoniae defined by density-TraDISort. , (2018).
  9. Geno, K. A., et al. Pneumococcal capsules and their types: Past, present, and future. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 871-899 (2015).
  10. Weber, B. S., Harding, C. M., Feldman, M. F. Pathogenic Acinetobacter: From the cell surface to infinity and beyond. Journal of Bacteriology. 1986 (6), 880-887 (2016).
  11. Mubaiwa, T. D., Semchenko, E. A., Hartley-Tassell, L. E., Day, C. J., Jennings, M. P., Seib, K. L. The sweet side of the pathogenic Neisseria.: The role of glycan interactions in colonisation and disease. Pathogens and Disease. 75 (5), 1-9 (2017).
  12. Wu, K. -M. M., et al. Genome sequencing and comparative analysis of Klebsiellapneumoniae. NTUH-K2044, a strain causing liver abscess and meningitis. Journal of Bacteriology. 191 (14), 4492-4501 (2009).
  13. Broberg, C. A., Wu, W., Cavalcoli, J. D., Miller, V. L., Bachman, M. A. Complete genome sequence of Klebsiellapneumoniae. Strain ATCC 43816 KPPR1, a rifampin-resistant mutant commonly used in animal, genetic, and molecular biology studies. Genome Announcements. 2 (5), (2014).
  14. Croucher, N. J., et al. Role of conjugative elements in the evolution of the multidrug-resistant pandemic clone Streptococcuspneumoniae Spain23F ST81. Journal of Bacteriology. 191 (5), 1480-1489 (2009).
  15. Croucher, N. J., et al. Selective and genetic constraints on Pneumococcal serotype switching. PLoS Genetics. 11 (3), 1-21 (2015).
  16. Pertoft, H., et al. Density gradients prepared from colloidal silica particles coated by polyvinylpyrrolidone (Percoll). Analytical Biochemistry. 88, 271-282 (1978).
  17. Breakwell, D. P., Moyes, R. B., Reynolds, J. Differential staining of bacteria: Capsule stain. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), 1-4 (2009).

Tags

גנטיקה גיליון 143 צפיפות מקוטע הדרגתי קפסולת טרדיס hypermucoidy קלבסיאלה
הפרדת חיידקים על ידי כמות הקפסולה באמצעות הדרגה צפיפות מקוטע
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feltwell, T., Dorman, M. J.,… More

Feltwell, T., Dorman, M. J., Goulding, D. A., Parkhill, J., Short, F. L. Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient. J. Vis. Exp. (143), e58679, doi:10.3791/58679 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter