En Vivo Específica la expresión de proteínas de Optogenetic usando películas de seda/AAV

Resumen

Aquí, presentamos un método de distribución de vectores de la expresión viral en el cerebro utilizando películas de fibroína de seda. Este método permite entrega dirigida de vectores de expresión utilizando fibras ópticas recubiertas de seda/AAV, ahusado de las fibras ópticas y ventanas craneales.

Resumen

La búsqueda para entender cómo neuronales circuitos de información del proceso en orden de salida del variador comportamiento ha sido grandemente ayudado por métodos ópticos recientemente desarrollado para la manipulación y seguimiento de la actividad de las neuronas in vivo. Estos tipos de experimentos se basan en dos componentes principales: 1) los implantables que proporcionan acceso óptico hacia el cerebro y las proteínas 2) sensible a la luz que cambian la excitabilidad neuronal o proporcionan una lectura de la actividad neuronal. Hay un número de maneras de expresar proteínas sensibles a la luz, pero la inyección estereotáctica de vectores virales es actualmente el enfoque más flexible porque la expresión puede ser controlada con precisión genética, anatómica y temporal. A pesar de la gran utilidad de vectores virales, entregando el virus en el sitio de implantes ópticos plantea numerosos retos. Las inyecciones estereotáxicas virus exigen cirugías que aumentan el tiempo quirúrgico, aumentan el costo de los estudios y suponen un riesgo para la salud del animal. El tejido circundante puede ser físicamente dañado por la jeringuilla de inyección y por inmunogénica inflamación causada por la abrupta entrega de un bolo de virus de alto título. Alineando las inyecciones con implantes ópticas es especialmente difícil cuando pequeñas regiones en el cerebro. Para superar estos retos, se describe un método para el revestimiento de varios tipos de implantes ópticos con películas compuestas de fibroína de seda y vectores (AAV) virales Adeno-asociado. La fibroína, un polímero derivado del capullo del Bombyx mori, puede encapsular y proteger biomoléculas y se puede procesar en formas que van desde películas solubles a la cerámica. Cuando se implanta en el cerebro, capas de seda/AAV liberan virus en la interfase entre elementos ópticos y el cerebro circundante, conduce expresión precisamente donde se necesita. Este método se implementa fácilmente y se compromete a facilitar mucho en vivo los estudios de la función neuronal del circuito.

Introducción

La última década ha producido una explosión de ingeniería proteínas sensibles a la luz para el monitoreo y manipulación de la actividad neural¹. Virus ofrecen una flexibilidad sin precedentes para expresar estas herramientas de optogenetic en el cerebro. En comparación con animales transgénicos, los virus son mucho más fáciles de producir, transportar y almacenar, permitiendo la rápida implementación de las nuevas herramientas de optogenetic. Expresión puede ser dirigida genéticamente a distintas poblaciones neuronales y virus diseñados para el transporte retrógrado incluso pueden ser utilizados para orientar la expresión basada en la conectividad neuronal².

Virus se introducen generalmente con inyecciones estereotáxicas, que pueden ser largo y difícil. Dirigidos precisamente a pequeñas regiones puede ser difícil, mientras que la expresión que conduce sobre grandes áreas a menudo requiere muchas inyecciones. Por otra parte, cuando un dispositivo óptico es posteriormente implantado en el cerebro para entregar luz en vivo, el implante debe estar correctamente alineado con la inyección viral. Aquí, describimos un método fácilmente implementados para la entrega de vectores virales en el tejido alrededor de un dispositivo implantado con fibroína seda películas³. Fibroína de seda está disponible en el mercado, bien tolerado por los tejidos neuronales y puede ser utilizada para producir materiales con propiedades variadas. Películas seda pueden aplicarse a implantes usando equipo de laboratorio común como microinyección pipetas o pipetas de la mano. Películas de seda/AAV eliminan el requisito de dos procedimientos quirúrgicos y aseguran de que la expresión mediada por virus es correctamente alineada al implante óptico. La expresión resultante está limitada a la punta de las fibras y los resultados en menos expresión no deseado a lo largo de la pista de fibra que las inyecciones estereotáxicas.

Además de producir la expresión específica en la punta de pequeñas fibras, películas de seda/AAV pueden utilizarse para conducir generalizada (> 3 mm de diámetro) expresión cortical bajo ventanas craneales. En vivo 2-fotón proyección de imagen de sensores fluorescentes de la actividad se ha convertido en una herramienta indispensable para evaluar el papel de la actividad neuronal en la conducción de procesamiento sensorial y cognitivo. Sin embargo, para conducir uniforme expresión sobre las grandes áreas corticales, experimentadores a menudo realizar inyecciones múltiples. Estas inyecciones pueden ser extremadamente desperdiciador de tiempo y pueden llevar a la expresión incoherente en el campo de visión. En cambio, seda/AAV-revestimiento ventanas craneales son extremadamente fáciles de fabricar, reducir considerablemente el tiempo necesario para las cirugías y conducir más notable expresión cientos de micras por debajo de la superficie cortical.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron según los protocolos aprobados por el Comité permanente de la Harvard de Animal Care siguientes pautas descritas en la NIH nos Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Se utilizaron ratones C57BL/6 adultos de ambos sexos (6-15 semanas de edad) para todos los experimentos.

1. obtener la fibroína de seda acuosa

1. Preparar o comprar la fibroína seda acuosa (5-7.5% w/v).

2. mezcla seda acuosa con vectores AAV de la expresión

1. Elegir un vector de expresión de AAV para conducir las proteínas optogenetic o indicador fluorescente de elección.
   Nota: Para minimizar el volumen de seda/AAV que deben aplicarse a los implantes durante la conducción aún robusta expresión, AAV título de stock (stock títulos obtenidos típicamente de corazones vector son alrededor de 10 ~¹³ gc/mL) se recomienda.
2. Inmediatamente antes de recubrimiento de implantes, descongele una alícuota del AAV y combinan con la fibroína de seda acuosa 5-7.5% (esta mezcla se hará referencia a como seda/AAV). En un tubo PCR μl 200, la mezcla acuosa fibroína y AAV en una proporción de 1:1 (para uso de windows craneal 1:4) inmediatamente antes de la aplicación. Pipetee suavemente la solución en y hacia fuera varias veces para mezclar bien la fibroína y AAV.
3. Mantener la mezcla de seda/AAV en el hielo antes de usarlo.

3. preparar equipo para la fabricación y almacenamiento de los dispositivos de seda/AAV-revestido

1. Adquirir equipo para fibras ópticas de la capa y lentes de gradiente de índice (GRIN) (figuras 1, 2).
   1. Construir un soporte estable de la virola. Para virolas de cerámica, taladre agujeros de 1.25 mm en un bloque de acrílico de la hoja de ¼". Orificios para insertar los tornillos de los laterales para sujetar férulas en posición de toque.
      Nota: Cualquier abrazadera puede utilizarse para este propósito.
   2. Posición de un manipulador con precisión submilimétrica para mover las fibras ópticas (aparato estereotáctica u otro instrumental quirúrgico de precisión).
   3. Montar un soporte estable para colocar el microinyector.
   4. Utilizar un estereoscopio para visualizar las fibras ópticas y gotitas de seda.
   5. Coloque una fuente de luz para iluminar las fibras ópticas.
2. Preparar el equipo para el recubrimiento de ventanas craneales (figura 3).
   1. Elija cualquier pipeta P10.
   2. Obtener un recipiente con tapa.
      Nota: Se sugiere cualquier recipiente con un fondo de silicona — el fondo suave facilita levantar windows craneales.
3. Preparar el equipo para almacenar acabados implantes (figura 4).
   1. Obtener una pequeña cámara de vacío (1-5 L).
   2. Asegúrese de que hay espacio para almacenar los implantes en un refrigerador de 4 ° C.

4. película de seda/AAV se aplican a dispositivos

1. Capa de fibras ópticas a la expresión focal de unidad en la punta de la fibra
   1. Preparar fibra crónica implantes como se describió anteriormente⁴.
   2. Antes de su uso, enjuague implantes con etanol y, a continuación, con agua ultrapura para asegurarse de que las fibras ópticas están limpias.
      Nota: Películas de seda se adhieren más confiablemente para limpiar superficies de vidrio.
   3. Prepara un dispositivo para sujetar férulas de fibra. Virolas de típico 1,25 mm de diámetro, uso un bloque de acrílico transparente, con ~1.3 1/4 pulgada mm agujeros y roscados tornillos entrando desde el lado del agujero implantes firmemente en su lugar (figura 1A).
   4. Monte el soporte del casquillo en un aparato estereotáctica (o cualquier solución de manipulación con precisión submilimétrica) equipado con un microinyector. Coloque el soporte de la virola sobre el microinyector y aplique la mezcla de seda/AAV desde abajo.
      Nota: Esto es debido a aplicaciones de grandes volúmenes desde arriba dio lugar a la seda/AAV que no fue restringida a la punta. Sin embargo, la aplicación de muchos pequeños volúmenes secuenciales desde arriba o abajo puede producir depósitos AAV seda que están confinados a la punta (aunque preferimos aplicar desde abajo).
   5. Tire de una pipeta estándar inyección intracraneal del vidrio de borosilicate capilar.
      1. Para facilitar la
      2. Para producir una punta de inyección con una punta limpia y plana del diámetro deseado, mantenga una pipeta en cada mano y use la parte más gruesa de la forma cónica en una pipeta para anotar la otra pipeta en el lugar de descanso deseado.
      3. Frote suavemente hacia adelante y hacia atrás en un movimiento de sierra (el método de puntuación en el vidrio).
      4. Después de anotar la pipeta, aplique presión suave a la punta de la pipeta anotó con el cuerpo de la pipeta de otros para lograr una ruptura.
   6. Coloque un estereoscopio para dar una visión clara de las caras de la fibra óptica.
      Nota: Ampliación debería ser suficiente para posicionar con precisión la pipeta de inyección sobre la cara de fibras ópticas.
   7. Insertar implantes de fibra en el soporte con el lado del cerebro de la fibra óptica hacia abajo.
   8. Cargar la pipeta de inyección con solución de seda/AAV, en cuanto a cualquier inyección intracraneal estándar⁵. Cargar la cantidad requerida para el número de implantes realizados, más el ~ 30% adicional para las pérdidas debido a la obstrucción de pipetas. Por ejemplo, si se hacen 10 implantes, luego cargar con 100 nL depósitos y retirar ~1.3 μl.
      Nota: Seda/AAV puede secar en la punta de la pipeta entre eyecciones, que puede obstruir la pipeta. Pipetas de diámetro grande (50-100 μm) son menos propensas a obstruir. Zuecos de retirar por un cepillado suave a la punta de la pipeta con un hisopo de trapo o alcohol de papel mojado.
   9. Maniobra de la pipeta de inyección hasta que está tocando o casi tocando el centro de la superficie de la fibra óptica. Extraer 10-20 nL de seda/AAV solución. Retirar la pipeta.
      Nota: La tasa de entrega no es crítica, pero las tasas típicas son 5-20 nL/s.
   10. Observar el bolo de seda/AAV en la superficie plana que aparece como una cúpula líquida que seca formando una película plana dentro de ~ 1 min (Figura 1B).
   11. Repita los pasos 4.1.9-4.1.10 hasta la cantidad deseada de seda/AAV es depositado (un total de 20-200 nL para la mayoría de las aplicaciones). Durante la preparación de múltiples implantes, seda/AAV se aplican a un implante y luego pasar a cubrir otros implantes antes de regresar a la primera.
   12. Permitir 1 h de secado antes de pasar a los implantes.
   13. Vacío noche secan en Torr ~ 125 (-25 en. Hectogramo), 4 ° C. Para ello, colocar el soporte de toda férula en una cámara de vacío.
   14. Evaluar la forma y posición de la película seda resultante bajo un microscopio de alta potencia. Asegurar que las películas se limitan a la punta de la superficie de la fibra óptica, ser relativamente delgada (> 100 μm) y simétrica (figura 1).
       Nota: Asimétricas o grandes películas de seda/AAV pueden desalojar de la fibra durante la implantación (figura 1). La causa más común de problemas surge de la aplicación de grandes volúmenes individuales en lugar de la aplicación secuencial de muchos pequeños volúmenes.
2. Afilado de capa de fibras ópticas a la expresión de unidad en el eje de la fibra
   1. Obtener implantes cónicos de fibra óptica y realizar pasos 4.1.2-4.1.8, excepto que la fibra cónica se coloca lateralmente, que es perpendicular al del inyector (figura 2A). Coloque el inyector sobre la fibra cónico.
      Nota: Carga de gotitas líquidas en poses de fibras cónicas añadido retos, porque la tensión superficial tiende a causar gotas saltar en la pipeta de inyección o migrar hasta la fibra afilada. Pipetas de inyección más pequeñas (30-50 μm de diámetro) ayudan a superar este problema pero aumentan el riesgo de que la pipeta de inyección se obstruirá. Debido a la tensión de superficie, las gotas tienden a adherirse a la zona de mayor superficie, para pipeta de inyección óptimo tamaño es dependiente en el tamaño de la fibra afilada y la tolerancia para la obstrucción ocasional.
   2. Coloque la pipeta de inyección de seda/AAV contra el lado de la fibra óptica al principio de la forma cónica. Asegúrese de que la pipeta de inyección es tocar la fibra óptica.
   3. Expulsión de 20 nL de seda/AAV para iniciar el proceso de recubrimiento. Asegúrese de que la gota se adhiere a la fibra óptica y que la interfaz de la pipeta de fibra. Mecha suavemente la gota hacia el final de la punta de la fibra como la seda/AAV se seca (~ 45 s). Mantenga la pipeta de inyección en contacto con la gota de secado para evitar la obstrucción de la punta de la pipeta.
      Nota: Cada depósito debe cubrir aproximadamente 400 μm de la fibra cónica (figura 2B).
   4. Cuando el primer bolo se ha secado casi por completo, expulsar otro 20 nL y absorbe la gota a lo largo de la forma cónica.
      Nota: La seda líquida se adhiere a la seda seca, anclaje a un extremo de la gota de la pipeta se desplaza a lo largo de la forma cónica.
   5. Repita el paso 4.2.4 por expulsar pequeñas cantidades de seda/AAV y poco a poco dibujando la solución por el lado de la forma cónica. 5-6 eyecciones son suficientes para recorrer la superficie de un cono de 2,5 mm.
   6. Para impulsar más la expresión uniforme en todos los lados de la fibra, girar la fibra y repita pasos 4.2.2-4.2.5 hasta la cantidad deseada de seda/AAV ha sido depositada.
   7. Si un colgante del filamento de seda seco/AAV se extiende más allá de la punta de la fibra, cuidadosamente corte el hilo con unas tijeras o utilizar la pipeta de expulsión la hebra detrás de la curva y adherirse a la forma cónica de la fibra.
   8. Permitir 1 h de secado antes de pasar a los implantes.
   9. Vacío secan durante la noche a 4 ° C. El titular de toda férula puede colocarse en una cámara de vacío.
   10. Evaluar la forma y posición de la película seda resultante bajo un microscopio de alta potencia.
       Nota: Las películas no necesitan ser totalmente uniformes pero no deben tener protuberancias que se extienden más de 100 μm más allá de la superficie de la fibra para minimizar el daño al tejido circundante durante la implantación (figura 3). Para minimizar el tamaño de la película, es fundamental que cada gotita esté completamente seco antes de depósitos posteriores.
3. Implantes de lente GRIN de capa
   1. Obtener sonrisa lentes^6,7 y repita los pasos 4.1.2-4.1.8. El inyector puede montarse encima.
   2. Depósito de seda/AAV en una sola eyección (1 μL para una lente de diámetro de 1,0 mm).
      Nota: Esto producirá una cúpula de líquido que se adhiere a la cara de la lente y se seca para producir una película uniforme (100-200 μm de espesor). Sin embargo, en caso de que una sola eyección grande seca irregularmente y produce una película que es más gruesa cerca de los bordes de la lente GRIN, trate de depositar múltiples gotitas más pequeñas (100-200 nL) en el centro de la superficie de la lente (permitiendo que cada gota se seque antes de depositar el siguiente) para asegurarse de que la película conducirá la expresión en el centro del campo de visión.
   3. Permitir 1 h de secado antes de pasar a los implantes.
   4. Evaluar la forma y posición de la película seda resultante bajo un microscopio de alta potencia para asegurar que la película cubre la superficie de la lente.
4. Recubrimiento de ventanas craneales
   1. Preparar vidrio ventanas craneales por adherir dos de 3 mm de diámetro redondo cubreobjetos (no. 1 de espesor) para una ventana de 5 mm de diámetro con pegamento óptico (para más detalles, véase Goldey et al 2014⁸).
   2. Mezcla de seda: virus en una proporción de 1:4 para reducir la cantidad total de seda en la película. Cantidades excesivas de la seda no se disuelven bajo ventanas craneales después de la implantación. Experimentos de titulación se requiera para determinar la proporción y el volumen que da el perfil de la expresión deseada.
   3. Mano tomar con pipeta una gota de 5 μl sobre la superficie del cubreobjetos 3 mm (revestimiento del cerebro). La gota debe extiende para cubrir la superficie entera (figura 3).
   4. Permitir 2-3 h de secado antes de pasar a windows.

5. almacenamiento de seda/AAV-implantes recubiertos con

1. Tienda de seda/AAV-revestimiento de las fibras ópticas en un desecador de vacío refrigerado (Torr ~ 125, 4 ° C) antes de su uso (Figura 4A).
2. No guarde windows craneales y lentes GRIN bajo vacío, como grandes películas seda almacenadas al vacío no se disuelven completamente después de la implantación. Implante lentes GRIN y windows craneales inmediatamente después del secado, o dentro de un día de fabricación si se almacenan a presión atmosférica y 4 ° C.

6. implantación de los dispositivos

1. Preparar los animales para cirugía de implantes como se describió anteriormente⁴.
   1. Brevemente, anestesiar ratones con una inyección intraperitoneal de ketamina/xilacina (100/10 mg/kg) y verificar la profundidad de la anestesia con una pizca de punta suave. Afeitarse el cráneo en la zona del implante y limpiar el cuero cabelludo con yodo y alcohol.
   2. Animales de Monte en un dispositivo estereotáxicas y suplemento anestesia utilizando una mezcla de oxígeno y el isoflurano (1-2%). Hacer una incisión en el cuero cabelludo sobre el área de interés y realizar una craneotomía lo suficientemente grande para acomodar el implante.
2. Implantar fibras ópticas⁹ y del microendoscope del lentes¹⁰ según los procedimientos previamente publicados. Manija de implantes con cuidado, como el depósito de seda/AAV puede caer por una craneotomía imperfecta, o por el implante en el borde del cráneo. Baje lentamente el implante en el cerebro (~ 2 mm/min).
3. Implante craneales windows como describen previamente⁸. No toque la cubierta de la ventana y evitar enjuagarse la ventana con el líquido en caso de sonda nasogástrica, como esto puede eliminar el virus. Para lograr la máxima expresión, realizar una durotomía.

7. evaluación de la expresión y solución de problemas

1. Para evaluar la expresión de proteínas expresadas de forma viral, permite ~ 2-3 semanas el virus de la unidad de expresión, luego realizar perfusión intracardial con paraformaldehído al 4% en fosfato tampón salino¹¹ y proceso cerebro tejido para fluorescente la microscopia¹².
2. Evaluar la expresión a través de microscopia fluorescente a la imagen del patrón de expresión de proteínas optogenetic etiquetadas con el fluoróforo.
3. Si el nivel de expresión es insuficiente, aumentar la cantidad de virus en los revestimientos incrementando el volumen total de la capa de seda/AAV, o preferiblemente mediante el uso de un virus de título superior.

Resultados

Para evaluar el éxito de las películas de seda/AAV en la expresión que conduce, había inundada de animales 2-3 semanas después de la implantación y preparó rebanadas del cerebro de la región de interés. Imágenes de fluorescencia de proteínas optogenetic tagged fluoróforo (ChR2-YFP) proporcionan una medida del grado de expresión (figura 1). Fibras ópticas típicas (230 μm de diámetro) puede fácilmente acomodar 200 nL de seda/AAV. Con la práctica, los experiment...

Discusión

El uso de la seda/AAV a la expresión de proteínas optogentic supera limitaciones de los enfoques que están actualmente en uso. Aunque muchos estudios utilizan inyecciones de AAV para expresar proteínas de optogenetic, es un reto para alinear la expresión hasta la punta de las fibras ópticas, a regiones alrededor de la longitud de las fibras cónicas y a la región de la visión de una lente GRIN. Debido a desalineamiento entre componentes ópticos y optogenetic expresión, inyecciones estereotáxicas pueden ser no fiables, y n...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fibroína de seda acuosa	Sigma	5154-20ML	Fibroína de seda acuosa (5% p/v) para la fabricación de películas
Microinyector para depositar seda/AAV	Drummond	3-000-207	Nanoject III inyector de nanolitros
Manipulador para sujetar implantes	Narashige	MM-33	Micromanipulador
estereoscópico para visualizar depósitos de seda	AmScope	SM-6TX-FRL	3.5X-45X Microscopio trinocular de zoom articulado con anillo de luz
Cámara de vacío para almacenar implantes	Ablaze	N/A	desgasificación de vacío de 3.5 cuartos Opcional
, soporte de implante para almacenamiento	N/A	N/A	Para almacenar fibras ópticas prefabricadas, perfore una rejilla de orificios de ~ 4 mm de profundidad con un diámetro ligeramente mayor que el diámetro de la férula en un bloque de plástico.
Fibra óptica	Thorlabs	FT200EMT	Ø 200 y micro; m Fibra óptica multimodo central para implantes de fibra
Férulas	Kientec	FZI-LC-230	LC Circonio Férula para implantes de fibra
Varios materiales para la fabricación de implantes de fibra crónica	Varios	N/A	Para un procedimiento detallado, consulte Ung K, Arenkiel BR. Implantación de fibra óptica para la estimulación optogenética crónica del tejido cerebral. Revista de experimentos visualizados: JoVE. 2012(68).
Implantes de fibra cónica	Optogenix	Lambda-B	Implantes de fibra cónica
Lentes GRIN	GoFoton	CLH-100-WD002-002-SSI-GF3	Lentes GRIN
Ventanas craneales de vidrio pequeñas	Warner	64-0726 (CS-3R-0)	Cubierta de vidrio redonda pequeña, espesor #0
Ventanas craneales de vidrio grandes	Warner	64-0731 (CS-5R-0)	Cubierta de vidrio redonda pequeña, espesor
#0Varios materiales para la fabricación de ventanas craneales	Varios	N/A	Para obtener información detallada sobre el procedimiento, consulte Goldey GJ et al. Ventanas craneales removibles para la obtención de imágenes a largo plazo en ratones despiertos. Protocolos de naturaleza. noviembre de 2014; 9(11):2515.