En Vivo Específica la expresión de proteínas de Optogenetic usando películas de seda/AAV

Resumen

Aquí, presentamos un método de distribución de vectores de la expresión viral en el cerebro utilizando películas de fibroína de seda. Este método permite entrega dirigida de vectores de expresión utilizando fibras ópticas recubiertas de seda/AAV, ahusado de las fibras ópticas y ventanas craneales.

Resumen

La búsqueda para entender cómo neuronales circuitos de información del proceso en orden de salida del variador comportamiento ha sido grandemente ayudado por métodos ópticos recientemente desarrollado para la manipulación y seguimiento de la actividad de las neuronas in vivo. Estos tipos de experimentos se basan en dos componentes principales: 1) los implantables que proporcionan acceso óptico hacia el cerebro y las proteínas 2) sensible a la luz que cambian la excitabilidad neuronal o proporcionan una lectura de la actividad neuronal. Hay un número de maneras de expresar proteínas sensibles a la luz, pero la inyección estereotáctica de vectores virales es actualmente el enfoque más flexible porque la expresión puede ser controlada con precisión genética, anatómica y temporal. A pesar de la gran utilidad de vectores virales, entregando el virus en el sitio de implantes ópticos plantea numerosos retos. Las inyecciones estereotáxicas virus exigen cirugías que aumentan el tiempo quirúrgico, aumentan el costo de los estudios y suponen un riesgo para la salud del animal. El tejido circundante puede ser físicamente dañado por la jeringuilla de inyección y por inmunogénica inflamación causada por la abrupta entrega de un bolo de virus de alto título. Alineando las inyecciones con implantes ópticas es especialmente difícil cuando pequeñas regiones en el cerebro. Para superar estos retos, se describe un método para el revestimiento de varios tipos de implantes ópticos con películas compuestas de fibroína de seda y vectores (AAV) virales Adeno-asociado. La fibroína, un polímero derivado del capullo del Bombyx mori, puede encapsular y proteger biomoléculas y se puede procesar en formas que van desde películas solubles a la cerámica. Cuando se implanta en el cerebro, capas de seda/AAV liberan virus en la interfase entre elementos ópticos y el cerebro circundante, conduce expresión precisamente donde se necesita. Este método se implementa fácilmente y se compromete a facilitar mucho en vivo los estudios de la función neuronal del circuito.

Introducción

La última década ha producido una explosión de ingeniería proteínas sensibles a la luz para el monitoreo y manipulación de la actividad neural¹. Virus ofrecen una flexibilidad sin precedentes para expresar estas herramientas de optogenetic en el cerebro. En comparación con animales transgénicos, los virus son mucho más fáciles de producir, transportar y almacenar, permitiendo la rápida implementación de las nuevas herramientas de optogenetic. Expresión puede ser dirigida genéticamente a distintas poblaciones neuronales y virus diseñados para el transporte retrógrado incluso pueden ser utilizados para orientar la expresión basada en la conectivi....

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron según los protocolos aprobados por el Comité permanente de la Harvard de Animal Care siguientes pautas descritas en la NIH nos Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Se utilizaron ratones C57BL/6 adultos de ambos sexos (6-15 semanas de edad) para todos los experimentos.

1. obtener la fibroína de seda acuosa

1. Preparar o comprar la fibroína seda acuosa (5-7.5% w/v).

2. mezcla seda acuosa con vectores AAV de la expresión

1. Elegir un vector de expresión de AAV para conducir las proteínas optogenetic o indicador fluoresce....

Resultados

Para evaluar el éxito de las películas de seda/AAV en la expresión que conduce, había inundada de animales 2-3 semanas después de la implantación y preparó rebanadas del cerebro de la región de interés. Imágenes de fluorescencia de proteínas optogenetic tagged fluoróforo (ChR2-YFP) proporcionan una medida del grado de expresión (figura 1). Fibras ópticas típicas (230 μm de diámetro) puede fácilmente acomodar 200 nL de seda/AAV. Con la práctica, los experiment.......

Discusión

El uso de la seda/AAV a la expresión de proteínas optogentic supera limitaciones de los enfoques que están actualmente en uso. Aunque muchos estudios utilizan inyecciones de AAV para expresar proteínas de optogenetic, es un reto para alinear la expresión hasta la punta de las fibras ópticas, a regiones alrededor de la longitud de las fibras cónicas y a la región de la visión de una lente GRIN. Debido a desalineamiento entre componentes ópticos y optogenetic expresión, inyecciones estereotáxicas pueden ser no fiables, y n.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Fibroína de seda acuosa	Sigma	5154-20ML	Fibroína de seda acuosa (5% p/v) para la fabricación de películas
Microinyector para depositar seda/AAV	Drummond	3-000-207	Nanoject III inyector de nanolitros
Manipulador para sujetar implantes	Narashige	MM-33	Micromanipulador
estereoscópico para visualizar depósitos de seda	AmScope	SM-6TX-FRL	3.5X-45X Microscopio trinocular de zoom articulado con anillo de luz
Cámara de vacío para almacenar implantes	Ablaze	N/A	desgasificación de vacío de 3.5 cuartos Opcional
, soporte de implante para almacenamiento	N/A	N/A	Para almacenar fibras ópticas prefabricadas, perfore una rejilla de orificios de ~ 4 mm de profundidad con un diámetro ligeramente mayor que el diámetro de la férula en un bloque de plástico.
Fibra óptica	Thorlabs	FT200EMT	Ø 200 y micro; m Fibra óptica multimodo central para implantes de fibra
Férulas	Kientec	FZI-LC-230	LC Circonio Férula para implantes de fibra
Varios materiales para la fabricación de implantes de fibra crónica	Varios	N/A	Para un procedimiento detallado, consulte Ung K, Arenkiel BR. Implantación de fibra óptica para la estimulación optogenética crónica del tejido cerebral. Revista de experimentos visualizados: JoVE. 2012(68).
Implantes de fibra cónica	Optogenix	Lambda-B	Implantes de fibra cónica
Lentes GRIN	GoFoton	CLH-100-WD002-002-SSI-GF3	Lentes GRIN
Ventanas craneales de vidrio pequeñas	Warner	64-0726 (CS-3R-0)	Cubierta de vidrio redonda pequeña, espesor #0
Ventanas craneales de vidrio grandes	Warner	64-0731 (CS-5R-0)	Cubierta de vidrio redonda pequeña, espesor
#0Varios materiales para la fabricación de ventanas craneales	Varios	N/A	Para obtener información detallada sobre el procedimiento, consulte Goldey GJ et al. Ventanas craneales removibles para la obtención de imágenes a largo plazo en ratones despiertos. Protocolos de naturaleza. noviembre de 2014; 9(11):2515.