Summary
지 베 렐 린 인식 센서 1 (GPS1)는 첫 번째 포스터 공명 에너지 전송 기반 바이오 센서 측정 지 베 렐 린 phytohormones spatiotemporal 고해상도 세포 수준 이다. 이 프로토콜은 시각화 하 고 애기 hypocotyls 및 루트 팁 유전자 인코딩된 nlsGPS1 바이오 센서를 사용 하 여 셀룰러 지 베 렐 린 레벨 계량 방법에 보고 합니다.
Abstract
Phytohormone 지 베 렐 린 (GA)은 식물에서 씨 발 아, 세포 신장, 및 발달 전환에 중요 한 역할을 재생 하는 작은, 모바일 신호 분자 이다. 지 베 렐 린 인식 센서 1 (GPS1)은 첫 번째 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워)-vivo에서 세포가 레벨의 모니터링 수 있는 바이오 센서를 기반으로. 핵 지역화 GPS1 (nlsGPS1)의 형광 방출 비율을 측정 하 여 다른 조직 유형에서 endogenously 및 것 제공 조지아 그라디언트 spatiotemporal 매핑은 세포 수준에서 가능 합니다. 이 프로토콜 3 예제 실험에서 nlsGPS1 방출 비율을 이미지 하는 방법을 설명 합니다: 정상, 전 후 외 인 지 베 렐 린 A4 (GA4) 치료, 그리고 치료 시간 코스. 우리는 또한 nlsGPS1 방출 비율 피지, 상업 3 차원 (3 차원) 현미경 사진 시각화 및 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 하 고 제한 및 nlsGPS1를 사용 하 여 지 베 렐 린 수준의 척도 가능성이 함정을 설명 하는 메서드를 제공 합니다.
Introduction
식물 호르몬은 식물의 성장과 개발에 근본적인 역할을 한다. 이 작은, 모바일 신호 분자는 생 합성, 놓을, 짧은 및 긴 distance 전송1,2,,34등 여러 수준에서 일반적으로 통제 된다. 호르몬 신호 경로 및 다운스트림 transcriptional 응답 이해 년 동안 날카롭게 했다. 그러나, 호르몬 분배를 감독 하는 규제 입력 호르몬 신호 통로의 다양 한 세포질 응답을 연결, 셀룰러 규모 호르몬 수준의 spatiotemporal 정량화를 요구 합니다. 무서 워 기반 바이오 센서 phytohormones를 감지할 수 있는 세포 규모 호르몬 수준을 정할 수 과학자 사전 수 있습니다. 특정 ligand 바인딩 또는 생물 학적 자극에 반응 하는 감각 도메인에 연결 된 무서 워 쌍 (기증자 및 수락자 형광 단백질) 무서 워 기반 바이오 센서에 의하여 이루어져 있다. 작은 분자 바이오 센서에 대 한 ligand 바인딩 방향 무서 워 쌍의 두 가지 형광 단백질 사이의 거리의 변화 귀착되는 감각 영역의 구조적 변화를 트리거합니다. 무서 워 바이오 센서의 비율 분석 기증자 흥분과 기증자5,6이상의 수락자의 형광 방출 비율을 측정 하 여 수행 됩니다. Ligand 바인딩은이 방출 비율7에 변화로 감지입니다.
우리는 최근 식물 호르몬 ga. 가스는 종자 발 아, 세포 신장, 그리고 식물에서 꽃 단계 발달 전환 홍보할 수 있는 호르몬의 클래스에 대 한 무서 워 기반 바이오 센서 개발. NlsGPS1 바이오 센서는 핵 언어와 다양 한 식물 조직에가 역학에 spatiotemporal 통찰력을 제공. 애기 셀에가 녹는 수용 체, 지 베 렐 린을 구분 하지 않는 난쟁이 (GID), 한다 복잡 한 유도 신호2의 부정적인 레 귤 레이 터로 동작 하는 델라 단백질의 저하. 애기 가 수용 체 (AtGID1C) 델라 단백질 (AtGAI)의 74-아미노 산 잘림에 연결 된 nlsGPS1의 조지아 감각 도메인 구성 고 무서 워 쌍의 구성 된 기증자 형광 단백질으로 리안의 이합체 화 변형 및 수락자 형광 단백질8로 아프로디테 (codon 다양 금성). NlsGPS1 바이오 센서는 생리 활성 GA4 에 대 한 높은 선호도 센서 (Kd = 24가4nM) 및 다양 한 조직-종류 지도 및 조지아 그라디언트 계량에 이용 될 수 있다. Vivo에서 애기 가 레벨의 오해를 피하기 위해, 우리는 또한 개발 nlsGPS1의 응답 하지 않습니다 변종 (nlsGPS1-NR) 부정적인 컨트롤로 사용 하. NlsGPS1-NR 단백질 돌연변이 바인딩 주머니에 조지아의 바인딩을 방해 하는 및 GID 수용 체 단백질7,9와 상호 작용을 방해 하는 델라 단백질에 돌연변이 운반 합니다. 방출 비율 패턴 또는 nlsGPS1 및 nlsGPS1 NR 라인에서 변경이 바인딩 이벤트에 직접 관련 된 유물을 간주 수 있습니다. 그것은 또한 조지아4 nlsGPS1 바인딩 하지 빠르게 가역 이며 따라서, 세포 nlsGPS1 방출 비율 대표는 최근 밀집이 주어진된 핵 보다는 실시간으로 해석 되어야 하는 것이 중요 정상 상태 수준입니다. 결과적으로, 떨어지는 레벨의 분석 nlsGPS1와 수는 없습니다.
여기 우리 애기는 고해상도에 confocal 영상 기반 접근을 사용 하 여 모델 식물의 셀에 nlsGPS1 바이오 센서를 이용 하 여 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 프로토콜 이미징 식물 뿌리와 안정 된 상태에서 및 시간-과정을 통해 hypocotyls에 정보를 제공합니다. 지도 및 조지아 배포판 계량 식물 종에서 뿐만 아니라 다양 한 조직 유형, nlsGPS1 센서를 활용할 수 잠재적으로.
Protocol
1입니다. 준비
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½ Skoog와 村 重 한 pH 5.7 아무 자당 (1 L)를 준비 합니다.
- 초순의 950 ml에서 Skoog (MS)와 村 重 기저 매체의 2.2 g 용 해. 5 m 코 5.7에 pH를 조정 합니다.
- 솔루션을 초순 물 1 L의 최종 볼륨을 확인 합니다. 두 500 mL 병, 각 포함 1% 공장 agar 나눕니다. 20 분 동안 121 ° C에 고압입니다.
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¼ MS 액체 pH 5.7 아무 자당 (1 L)와 준비 합니다.
- 초순의 950 ml에서 MS의 1.1 g을 분해. 5 m 코 5.7에 pH를 조정 합니다. 솔루션을 초순 물 1 L의 최종 볼륨을 확인 합니다. 2 개의 500 mL 병으로 나눕니다. 20 분 동안 121 ° C에 고압입니다.
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조지아4를 준비 합니다.
- 조지아4 에탄올 최종 농도 100 mM가4 주식을 70%에서 디졸브.
- 0.1-1 조지아4 주식 희석 작업 솔루션을 준비, ¼ MS 액체 pH 5.7 µ M.
2. 식물 성장
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애기 씨 소독.
- 화학 후드를 사용 하 여 작동 합니다. 약 수 2 mL microcentrifuge 튜브로 (약 200 씨앗) 씨앗. 염소 저항 잉크 마커를 사용 하 고 살 균 선박 (밀봉 될 수 있다 큰 상자) 내부 오픈 뚜껑 튜브를 배치.
- 초순의 및 염소 살 균 선박 내부 솔루션 50 mL 50 mL를 포함 하는 250 mL 비 커를 배치 합니다.
- 비 커에 집중된 한 염 산 (HCl)의 3 mL를 추가 합니다. 즉시 배를 밀봉 하 고 6-16 h에 대 한 염소 가스에 의해 살 균을 허용 합니다.
- 선박을 개봉한 후 씨 선반에서 모든 microcentrifuge 튜브의 뚜껑을 닫습니다. 소독된 씨앗은 도금의 시간까지 건조 저장할 수 있습니다.
- 약 20 소독된 애기 씨앗 ½ MS agar 사각형 접시에 뿌린. 다공성 외과 테이프와 플레이트를 봉인 하 고 알루미늄 호 일 그들을 포장. 계층에 대 한 1-3 일 동안 그들을 4 ° C에서 품 어.
- 루트 이미징에 대 한 번호판을 전송 수직 위치에 성장 챔버 다음 성장 조건 3 일: 긴-하루의 조건 (LD, 어둠 속의 빛/8 h 16 h); 120 µmol⋅m-2s-1 빛의 강도; 22 ° C (광 주기) 또는 (어두운 주기), 동안 18 ° C의 온도 65% 상대 습도 (RH).
- 어두운 성장 hypocotyl에 대 한: 발 아를 동기화 하려면 1-4 h의 빛 펄스에 대 한 성장 챔버에 접시를 전송. 알루미늄 호 일 접시를 포장 하 고 3 일 동안 수직 위치에서 성장 챔버에 배치.
3. 샘플 준비
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정상 상태 측정 (그림 1A)
- 깨끗 한 현미경 슬라이드에서 ¼ MS 액체 (지금부터 모의 솔루션으로 불리)의 50 µ L를 추가 합니다. 부드럽게 슬라이드에 접시에서 nlsGPS1을 표현 하는 묘를 전송 합니다.
- 깨끗 한 coverslip 고는 coverslip의 각 모서리에 진공 기름 한 방울을 자리. 묘 목에 부드럽게 배치 하는 coverslip 고 신중 하 게 모든 기포를 제거 하는 여분의 모의 솔루션을 추가 합니다.
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GA4 치료: 화학 교환 실험 (그림 1B).
- 조지아4 치료 전에 사각형을 그릴 (피펫으로 팁에 부착) 진공 기름 가득 20 mL 주사기를 사용 하 여 (길이: 3.5 c m, 높이: 2.5 c m)는 깨끗 한 유리 슬라이드 (그림 1B)에 진공 그리스의 균일 한 층으로. 진공 그리스의 좋은 라인에 대 한 있도록 피펫으로 팁 직경에서 1 m m의 개방을 잘라 되어야 합니다.
- 유리 슬라이드에 모의 솔루션의 50 µ L를 추가 합니다. 깨끗 한 집게와 nlsGPS1 묘를 선택 하 고 부드럽게 모의 솔루션에 그들을 배치. 어떤 손상을 방지 하는 집게와 묘 종을 파악 하지 않고는 cotyledons의 밑바닥을 지원 하 여 묘를 전송.
- 깨끗 한 coverslip 고는 coverslip의 각 모서리에 진공 기름 한 방울을 자리. 집게를 사용 하는 coverslip 진공 그리스 사각형의 중앙에 놓습니다. 이제는 coverslip 진공 그리스 사각형의 긴 모서리에 해당 하는 두 가지 측면에서 밀봉 된다.
- 신중 하 게 하는 저수지를 작성 하 고 내부 seedling(s)를 방해 하지 않고 저수지 내의 모든 기포를 제거 추가 모의 솔루션을 추가 합니다.
- 조지아4 치료 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다. 이 프로토콜의 섹션 4에에서 설명 된 대로 지침을 따릅니다.
- 조지아4 치료 confocal 무대에서 현미경 슬라이드를 제거 합니다. 20 분 타이머를 설정 합니다.
- 시작 후 타이머, ¼ MS 액체 1 µ M가4포함 된 버퍼 솔루션을 교환 합니다. 조지아4 솔루션 (약 50 µ L)는 coverslip의 왼쪽에서 추가 하 고 오른쪽에서 이전 (모의) 솔루션을 제거. (그림 1B) 약 10 분 소요 모의 솔루션을 완전히 대체 하는 솔루션을 교환에 계속.
- 현미경 단계에 다시 유리 슬라이드를 놓습니다. 후가 이미지를 취득 하기 전에 또 다른 10 분을 기다립니다.
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관심의 조직에 대 한 시간 코스의 설정
참고: 관심의 조직 수 있습니다, 예를 들어, hypocotyls 또는 뿌리. 우리는 정기적으로 이미징 상업 관류 시스템을 사용 하 여 nlsGPS1 바이오 센서에 대 한 시간 코스를 수행 (그림 1C, 재료의 표참조) 또는 RootChip7,,1011.- 스티커-슬라이드의 관류 채널의 센터 모의 솔루션의 200 µ L를 추가 ( 재료의 표참조). 부드럽게 nlsGPS1 묘를 선택 하 고 스티커-슬라이드에서 모의 솔루션에 그들을 배치.
- 집게를 사용 하 여 부드럽게 유리 coverslip 놓고, 스티커-슬라이드의 주변에 스티커 물자를 가진 강한 유대를 형성 하는 coverslip의 외부 가장자리에 부드럽게 눌러는 집게의 뒷면을 사용 하 여.
- 두 팔꿈치 루어를 사용 하 여 커넥터 (와 내부 [ID]의 직경 0.8 m m)와 (0.8 m m의 ID)로 실리콘 튜브 연결 끈 적-슬라이드 20 mL 주사기를 유출 솔루션을 수집 하는 콘센트 컨테이너. 실리콘 튜브에 주사기를 연결 하는 Luer 잠금 커넥터 (0.8 m m의 ID)를 사용 합니다.
- 부드럽게 수동으로 챔버에 남아 아무 기포는 챔버를 통과 하는 충분 한 솔루션 수 있도록 모의 솔루션이 포함 된 주사기를 누릅니다. 놓고 프로그래밍 가능한 주사기 펌프에 주사기를 개최 합니다.
- 주사기 사용 (즉,., 직경 및 볼륨) 함께 펌프와 함께 제공 된 설명서에 따라 유량에 펌프 매개 변수 특정 설정 합니다.
참고: 이 프로토콜에서 1-3 mL/h의 유량 사용 되었다, 그리고이 실험적인 요구에 따라 변경 될 수 있습니다. 펌프를 시작 하 여 시간 과정을 시작 합니다. - 치료를 위해 조지아4 시간 과정 (그림 1C), 펌프를 일시 중지 하 여는 관류를 중지 하 고 조지아4보충 새로운 한 포함 ¼ MS 액체 주사기를 변경 합니다. 다음 섹션에서와 같이 confocal 영상 진행.
4입니다. 현미경
참고: 우리는 레이저 confocal 현미경 검사 법을 수행합니다.
- 무서 워 이미징 수행을 갖춘 레이저 confocal 현미경을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.
참고: NlsGPS1에 대 한 청록색 형광 단백질 (CFP)와 노란 형광 성 단백질 (YFP)의 이체는 몇 군데. 이 프로토콜에서 상업 현미경 ( 테이블의 자료, 현미경 1과 2로 참조) 10 배 또는 20 x 건조 0.70 고조파 복합 APO 계획 목표와 함께 사용 됩니다. - 현미경 1, 사용 448 nm와 514 nm 파장 레이저 자극 CFP와 YFP, 각각. 순차적 검사를 취득 합니다. CFP의 흥분 후 CFP (기증자 방출)에 대 한 460-500 nm와 525-560 nm YFP (무서 워 방출)에 대 한 감지 검출기 (예: 유압 SMD)를 설정 합니다. 두 번째 시퀀스를 사용 하 여 YFP 여기 후 525-560 nm YFP (YFP 방출)에 대 한 검출 하는 검출기를 설정 합니다.
참고: 이 YFP 형광 표면 상업적인 3 차원 현미경 사진 시각화 및 분석 소프트웨어를 사용 하 여 생성 하는 식 컨트롤 뿐만 아니라 핵, 세그먼트에 사용 됩니다. - 현미경 2, 사용 440 nm와 514 nm 파장 레이저 라인 자극 CFP와 YFP, 각각. 두 트랙을 얻을. 트랙 1, CFP의 흥분 후 YFP (무서 워 방출)에 대 한 CFP (기증자 방출)에 대 한 464-500 nm와 526-562 nm 감지 검출기 (예:., ChS)을 설정 합니다. 에 대 한 트랙 2, YFP 여기 후 YFP (YFP 방출)에 대 한 526-562 nm를 검출 하는 검출기를 설정.
참고: 이 YFP 형광 표면 3 차원 시각화 및 분석 소프트웨어에서 생성 하는 식 컨트롤 뿐만 아니라 핵, 세그먼트에 사용 됩니다. - 512 x 512 픽셀의 형식, 12 비트 해상도 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.
- 이득을 하지 픽셀을 흠뻑 젖 게 하는 동안 좋은 신호를 허용 하는 경험적으로 결정된 값으로 조정 될 필요가 있다. 이득 사이 CFP와 무서 워 방출 실험을 통해 변경할 수 없습니다. 1 공기 단위 (AU) pinhole을 설정 합니다. Confocal 현미경의 단계에서 IBIDI 스티커-슬라이드를 놓고 이전에 표시 된 이미지와 함께 진행 합니다.
- 현미경 1 소프트웨어에서 활성 라이브 검색에 활용 이상/아래 노을 이미지 화면의 왼쪽 상단에 있는 부족 및 채도의 관심 영역을 결정 하. 현미경 2 소프트웨어에서 범위 표시기 이미지 화면 하단에 있는 부족 및 관심 영역의 채도 결정 하기 위해 사용 합니다. 모든 양적 이미지 분석 픽셀 채도 없음 있어야 합니다.
- 1 μ m의 스텝 크기와 z-스택을 설정 합니다. 단계 크기 증가 z 해상도 대 한 감소 하거나 인수 또는 몇 군데 수 위치/샘플 수를 증가 하는 증가 속도가 증가 수 있습니다. 자동된 시간 과정에 대 한 설정된 시간 간격으로 이미지를 얻으려고 z-스택 (수집 모드 탭에서 xyzt 모드)와 함께 시간을 설정 합니다.
5. 이미지 분석 피지를 사용 하 여
참고: ImageJ (피지)를 사용 하 여 이미징 데이터를 처리 하 고 애기 모 종에 nlsGPS1 방출 비율의 2 차원 (2 차원) 이미지를 생성 가능 하다. 이미지의 예 그림 2A, 2c, 2E, 2 세대및 3A를 참조. ImageJ,에서는 검색 기능을 사용 하 여이 프로토콜의 각 명령을 찾을 수입니다. 컴퓨터 키보드에는 스페이스 바와 L을 누릅니다. 새 창이 열립니다. 검색 필드에 필요한 명령을 입력 합니다.
- 피지 (이미지 J)으로 (.lif 또는.lsm 파일) 파일을 끌어서 하이퍼 스택으로 이미지를 엽니다.
- 주 메뉴에서 이미지 선택 > 스택 > Z 프로젝트 및 선택 합계 조각 최대 투영에서 밝은 픽셀만 보다는 오히려 모든 픽셀을 잡으려고.
- 주 메뉴에서 선택 하는 프로세스 > 빼기 배경 및 설정 롤링 볼 반지름 50 픽셀을. 다른 모든 옵션의 선택을 취소 하 고 모든 세 개의 이미지를 처리 합니다. 이 단계는 "롤링 볼" 알고리즘을 사용 하 여 백그라운드를 제거 합니다.
참고: 50 픽셀 경험적으로 전경으로 핵을 포함 하도록 결정 되었다. - 주 메뉴에서 이미지 선택 > 색상 > 분할 채널. 3 새로운 창이 열립니다: C1-합 (CFP 채널); C2-합계 (무서 워 채널), 및 C3-합 (YFP 채널).
- C3-합 창을 선택 하 고, 주 메뉴에서 선택 하는 프로세스 > 필터 > 가우시안 블러 이미지 노이즈를 줄이기 위해 1 가우스 블러를 적용.
- 주 메뉴에서 선택 이미지 > 조정 > 밝기/명암 대비 와 선택 자동.
- 주 메뉴에서 프로세스 를 선택 > 설정의 포화 및 대비 향상, 0.35 =.
- 메인 메뉴에서 이미지 선택 > 형식 > 8-비트 및 8 비트 이미지 스택 변환.
- 주 메뉴에서 선택 이미지 > 조정 > 자동-로컬 임계값. 자동 로컬 임계값에서 다음 매개 변수를 선택 합니다: Phansalkar 방법, 반경 = 15, 매개 변수 1 = 0, 매개 변수 2 = 0, 및 백색 스택. 이 단계에서는 YFP 스택 이진 마스크를 만드는 데 사용 됩니다.
- C2-합 창을 선택 하 고, 주 메뉴에서 선택 하는 프로세스 > 필터 > 가우시안 흐림 1 가우스 블러를 적용.
- C1-합 창을 선택 하 고, 메인 메뉴에서 프로세스 를 선택 > 필터 > 가우시안 흐림 1 가우스 블러를 적용.
- 주 메뉴에서 2 개의 채널에서 방출 비율 스택 생성을 선택 하는 프로세스 > 이미지 계산기. 새 창에서 표시 될 1 이미지로 선택 C2-합 연산자, 분할 을 선택 하 고 이미지 2 C1 합계 선택 합니다.
- 새 창 만들기 및 32 비트 형식 선택 되었는지 확인 합니다. 새 창 명명 된 결과의 C2-합계표시 됩니다.
- 주 메뉴에서 이미지 선택 > 조회 테이블 > LUT 16_colors.
- 주 메뉴에서 선택 하는 프로세스 > 이미지 계산기. 새 창에서 표시 될 1 이미지로 선택 결과의 C2-합 연산자, 곱하기 를 선택 하 고 이미지 2 c 3 합 선택 합니다. 이 단계에서는 YFP 이진 마스크 YFP 제어 채널에 있는 픽셀만 표시 YFP/c f P 스택 증식 이다.
- 주 메뉴에서 선택 하는 프로세스 > 수학 > 분할 하 고 255 값 설정. 새로운 창이 열리면에서 예 를 스택의 모든 이미지 분석을 선택 합니다. 새로운 이미지를 명명 된 결과의 결과의 C2-합계표시 됩니다.
- 주 메뉴에서 선택 이미지 > 조정 > 밝기/명암 대비 와 선택 자동.
- 주 메뉴에서 선택 하는 프로세스 > 대비 향상, 그리고 선택 유형 포화 0.35 =.
- 주 메뉴에서 이미지 선택 > 조정 > 밝기/대비및 최소 및 최대 값을 설정된 캡처 조지아 분포. 선택적 단계: 메인 메뉴에서 분석 을 선택 > 도구 > 교정 바 와 쇼 LUT 교정 바, 결과의 결과의 C2-합계 를.tiff 파일로 저장 하 고.
- 방출의 값을 가져올 비율, 주 메뉴에서 선택 분석 > 측정을 설정 하 고 선택 회색에 대 한 평균값 및 표준 편차.
- 도구 모음에서 사각형 셰이프를 선택 하 고 (ROI) 관심 영역을 그립니다. 주 메뉴에서 선택 분석 > 측정. 새 창에서 선택한 투자 수익 평균 값을 보고 합니다.
- 복사 하 고 스프레드시트 소프트웨어 (예: Excel 또는 OriginPro)에 얻은 값을 붙여 실험 전 후가4 치료에 대 한 히스토그램 또는 선 그래프 시간 과정에 대 한 실험.
6. 이미지 분석 3 차원 시각화 및 분석 소프트웨어를 사용 하 여
참고: 선택된 된 소프트웨어를 사용 하는 이점은 (참조 자료 테이블) 개체 (예: 핵) 세그먼트를 confocal z 스택의 3 차원 이미지를 생성입니다. 이미지의 예를 그림 2B, 2D, 2 층, 2 시간및 3B참조.
- 소프트웨어 열고 파일 (.lif 또는.lsm 파일)을 가져옵니다.
- 핵 표면 마법사를 사용 하 여 컨트롤 YFP 방출 채널에 따라 세그먼트. 세그먼트 개체 "표면" 불린다. 이 세분화 단계 핵 외부 복에서 배경 제거 하는 동안 하나의 개체로 핵에서 모든 복의 분석을 허용 합니다.
- 표면 마법사에서 3 µ m을 기본값으로 임계 처리 배경 빼기 (로컬 대비)을 설정 합니다. C f P 방출 (기증자 여기 기증자 방출 [DxDm]) 및 무서 워 방출 (기증자 여기 수락자 방출 [DxAm]) 채널 YFP 방출 (수락자 여기 수락자 방출 [AxAm]) 채널을 사용 하 여 만든 표면에 따라 마스크.
- 확장 XT 의미 강도 비율 를 사용 하 여 두 채널에 개별 서피스의 평균 강도 값 사이의 기증자 여기 기증자 방출 (DxAm/DxDm)로 나눈 기증자 여기 수락자 방출의 비율을 계산.
참고: 이 확장은 온라인 다운로드. - NlsGPS1 방출 비율 개별 서피스, 색상 색상 통계 코딩, 컬러 휠 아이콘으로 표시 되는 선택 합니다. 통계 유형으로 강도 비율을 의미 를 선택 합니다.
- 통계 아이콘 아래 발견 되는 테이블에서 개별 값의 비율을 내보냅니다.
- 복사 하 고 값을 스프레드시트에 붙여 조지아4 치료 실험 전과 후에 대 한 히스토그램 또는 과정 실험 시간에 대 한 선형 그래프.
7. 통계 분석
참고: NlsGPS1 방출 비율의 beeswarm 상자 줄거리 3D 그림 을 참조 하십시오.
- 소프트웨어 열고 Y 열으로 핵 표면 방출 비율을 붙여 넣습니다.
- 관심의 열을 선택 하 고 통계 를 선택 > 통계 설명 > 정상 테스트 샘플 일반적으로 배포 하는지 여부를 알아야. 정상 테스트를 실행 하 고 새 창이 열리고 결과 보고.
- 샘플은 일반적으로 배포 되는 경우 사용 하는 t-통계 테스트로 테스트. 통계 를 선택 > 가설 테스트 > 행에 2-표본 t-검정 및 실행 t-테스트.
- 예제 일반적으로 배포 되지 않은 경우 선택 통계 > 통계 가설 테스트 > 2 표본 분산에 대 한 테스트 샘플 사이의 편차는 크게 다른 지 여부를 알아야.
- 분산을 크게 다른 경우, 사용 하 여 테스트 하는 맨-휘트니 U 통계 테스트로. 통계 를 선택 > 비패라메트릭 테스트 > 맨-휘트니 테스트 및 실행 테스트.
- 분산 크게 다른 경우 사용 하 여 Kruskal 월리스 ANOVA 테스트 통계 테스트로. 통계 를 선택 > 비패라메트릭 테스트 > Kruskal 월리스 ANOVA 테스트 및 실행 테스트.
Representative Results
NlsGPS1를 사용 하 여, 의무가 형광 이미징, 루트 팁 및 어두운 성장 hypocotyls (그림 2)를 포함 하 여 조직에서 세포가4 레벨을 측정 가능 하다. 애기 루트에 nlsGPS1 방출 비율 그라데이션 meristematic과 영역에서가 저급 및 높은 늦게 신장 영역 (그림 2A 와 2B)에 나타내는 것입니다. 대조적으로, 방출 비율 그라데이션 하지 내 생 GA 그라디언트는 인 위 (그림 2C 및 2D) 아니다는 것을 제안 하는 nlsGPS1-NR 뿌리에서 관찰 되었다. NlsGPS1 방출 비율 그라디언트는 cotyledons 및 꼭대기 걸에 낮은 레벨 및 hypocotyl (그림 2E 와 2F)의 급속 하 게 늘이는 기초 지역에서 높은 수준의 어두운 성장 hypocotyls에서 또한 형성 되었다. 대조적으로, 방출 비율 그라데이션 하지 nlsGPS1 NR hypocotyls (그림 2G 및 2 H)에서 관찰 되었다. 애기 뿌리와 어두운 성장 hypocotyl 세포에서 내 생 GA 축적 셀룰러 연신 율 상관.
또한, 것 공급된가4 축적 우선적으로 애기 루트 (그림 3)의 부 지에 비해 신장 지역에서 내 인 성 및 외 인가 공부 하는 nlsGPS1를 사용할 수 있습니다 나타내는 패턴.
0.1 µ M와 치료를 다음 시간 과정 실험, nlsGPS1 묘 스티커 슬라이드 챔버에 배치 되었고 ¼ MS 액체 끼얹는다 동안 30 분 동안가4 . 동영상 분할 영역 (비디오 1)에 비해 루트 신장 지역에서 외 인 조지아4 의 빠른 축적을 보여줍니다.
그림 1: 샘플 confocal 영상에 대 한 준비. 이러한 패널 표시 (A) (B) 정상 상태 실험 전 후 외 인 조지아4 치료, 및 (C)는 치료 시간 과정 실험을 사용 하 여 샘플 준비의 도식 표현 스티커-슬라이드 (C)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 조지아 그라데이션 애기 뿌리에 어두운 성장 hypocotyls. NlsGPS1 (A)와 (C) nlsGPS1 NR 뿌리의 2 차원 이미지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 분석 했다 및 3 차원 이미지 (B) nlsGPS1 (D) nlsGPS1-NR의 3 차원 상업을 사용 하 여 분석 했다 이미지 분석 소프트웨어입니다. 두 분석 내 생 GA4 애기 뿌리에 그라데이션 보였다. (E) nlsGPS1 (G) nlsGPS1 NR 어두운 성장 hypocotyl의 2 차원 이미지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 분석 했다 그리고 (F) nlsGPS1 (H) nlsGPS1-NR의 3 차원 이미지를 사용 하 여 분석 했다는 상업적인 3 차원 이미지 분석 소프트웨어입니다. 두 분석 내 생 GA4 어두운 성장 hypocotyls에 그라데이션 보였다. LUT 바 nlsGPS1 방출 비율의 잘못 된 색을 표시합니다. YFP 이미지 식 컨트롤으로 보고 됩니다. Hypocotyl 이미지 두 단계 위치를 사용 하 여 인수 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 뿌리에서 외 인 조지아 그라데이션. 첫 번째 두 개의 패널 표시 (A) 2 차원 및 nlsGPS1 루트 전에 세가4 (1 µ M)의 치료 후 20 분의 (B) 3 차원 이미지. YFP 이미지 식 컨트롤으로 보고 됩니다. 마지막 두 개의 패널 표시 (C) 평균 및 표준 편차 및 신장 영역 (흰색 프레임으로 정의 되는 영역)의 핵에 대 한 nlsGPS1 방출 비율의 (D) beeswarm 상자 줄거리. 신장 지역에 nlsGPS1 방출 비율 조지아4 치료 후 훨씬 더 높은 했다 (맨-휘트니 U 테스트 * * * P-값 < 0.0001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1: 스티커 슬라이드를 사용 하 여 nlsGPS1 루트의 관류 실험. 이 비디오는 nlsGPS1 ¼ MS 액체 끼얹는다 고 0.1 µ M가4 30 분 치료의 3 차원 이미지를 보여줍니다. 시간 과정에서 영상 획득 다음과 같은 간격으로 3 시간 마다 10 분: 모의 솔루션의 30 분 ( t 프레임 = 1, t = 2, t = 3), 조지아4 치료의 30 분 (프레임 t = 4, t = 5, t = 6), 모의의 2 h 그래서 lution (프레임 t = t 로 7 = 18) 솔루션. 인수, 이전 샘플은 2 h. 가이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오에 대 한 모의 솔루션 끼얹는다. (다운로드 오른쪽 클릭.)
Discussion
GA 무서 워 기반 바이오 센서 nlsGPS1 보고 및 다세포 식물에 조지아 호르몬 그라디언트를 측정 하는 양적 방법을 제공 합니다. 질량 분석 및 transcriptional 기자 또는 신호 단백질-저하-기반 방법12, 간접 측정 하 여 직접 검색을 통해 향상 된 spatiotemporal 해상도 역학 계량 수 무서 워 기반 바이오 센서 13. 다양 한 조직의 종류에 고해상도 세포 이미징 조지아로 의미 있는 통찰력 규정과 다세포 컨텍스트에서 축적의 기능에 대 한 생물학과 스파크 새로운 가설을 얻을 수 있습니다. 예를 들어 nlsGPS1 바이오 센서 catabolic, 특정가 생 합성 및 전송 돌연변이 뿐만 아니라 spatiotemporally 유발된 물결, 동안에 변화를 모니터링 수 구체적으로 어떻게가 그라디언트는 설립에 테스트를 매우 유익 루트 및 주소 루트 셀 조지아 그라디언트에 대 한 응답. 센서 테스트 씨앗 발 아, 세포 신장, 및 꽃의 GA 중재 컨트롤을 제어 하는 메커니즘의 보존을 다른 모델 및 작물 종에 사용 될 수 있습니다.
NlsGPS1 바이오 센서의 무서 워 기반 영상에서 중요 한 단계는, 1) 픽셀 양적 무서 워 분석 중 포화 하지 해야, "감지기 이득" 2) 이미징 매개 기증자 방출 (DxDm)에 대 한 상수 유지 되어야 한다 고 수락자 방출 (DxAm) 인수, 3) 제어 nlsGPS1 NR 라인 유물, 및 4를 배제 하기 위해 사용 해야 합니다) 샘플 드리프트와 초점 변경 문제를 최소화 하기 위해 준비 되어야 한다. 또한, 샘플 재배 되 고 있는 환경 조건에 이후가 빛 기간 및 빛의 강도14,,1516 같은 환경 조건에 민감한 제어 하는 것이 중요 17. 분석의이 종류의 주요 한계는 높은 신호 대 잡음 비율 영상 잡음 비율 영상에 있는 증가 때문에 필요한입니다. 따라서, nlsGPS1 이미징 조직 및 장기는 청록색과 노란색 형광 단백질을 사용 하 여 비율 형광 현미경 검사 법에 순종 하는 데 유용 되지 것입니다-예를 들어 깊은 조직 형광 단백질 제대로 감지 되었습니다. 다른 한편으로, 비율 정보는 종종 선호 intensiometric 판독을 통해 내부 통제 규칙 유물에 따른 바이오 센서 식, 안정성, 밝기, 또는 주어진된 셀, 조직에에서 여 형태소 분석을 하는 데 도움이 있기 때문에 또는 조건. 예를 들어 바이오 센서 이미징 초조해 하 고 이미지 분석은 또한 조직5,6,,1819,20,의 다양 한 ligands의 다양 한 연구에 이용 되었다. 이미징 실험 및 이미지 분석 여기 보고, 예를 들어 깊은 루트 조직-형식에 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 빛 시트 현미경 같은 새로운 이미징 방법에 맞게 수정할 수 있습니다.
1 세대 nlsGPS1 바이오 센서는 또한 조지아 exogenous 조지아 치료 따르는 세포내 증가에 보고할 수 있는 조지아 그라디언트의 고해상도 지도 제공 하는 높은 선호도 센서입니다. NlsGPS1의 현재 한계 중 하나는 센서는 빠르게 되돌릴 수 및, 따라서, 정상이 레벨에 아니지만, 가능성, 관심의 솔루션에 최대 최근 조지아 농도 보고입니다. 센서에 대 한 정확한 이직 률 이기도 하지 알려진와이, 낮은 가역 결합 일어나 고 있을 수 있습니다 내 생 GA 달콤하게의 감지 하는 걸로 어떤 조직 종류에는 몇 시간 분 이내. 그것은 또한 그 nlsGPS1가4 에 대 한 높은 선호도가지고 주의 하는 것이 중요 (Kd = 24 nM) 다른가 형태에 비해 (GA3 Kd= 240 nM, 조지아1Kd = 110 nM) 다른 생리 활성 가스 이미징 하는 경우 7. 조지아 바이오 센서의 미래 세대는 높은 선호도 유지 하면서 가역을 증가 하거나 다양 한 전조, 생리, 또는 catabolite 가스에 대 한 서로 다른 특이성을 전시 설계 될 수 있다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 (보조금 계약 n ° 759282) 유럽 연구 회의 (ERC)에서 자금을 받고 있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| nlsGPS1 Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107734 | |
| nlsGPS-NR Col0 Arabidopsis seeds | NASC | N2107735 | |
| Gibberellin A4 (GA4) | Sigma | G7276 | dissolve in EtH 70% , and keep at -20 °C |
| sodium hypochlorite solution (Bleach) | Fisher S/5040 | HSRA 064 | |
| Hydrogen cloride HCl | Sigma | 31434 | |
| Micropore tape | 3M | 1530-1 | |
| ibidi sticky-slide | Ibidi | 81128 | Luer 0.1 for root imaging |
| ibidi sticky-slide | Ibidi | 80168 | Luer 0.2 for hypocotyl imaging |
| glass coverslip for sticky slides | Ibidi | 10812 | |
| Elbow Luer Connectors | Ibidi | 10802 | |
| silicone tubing | Ibidi | 108401 | |
| Luer Lock Connector | Ibidi | 10826 | |
| programmable syringe pump | World Precision Instruments | AL-1000 | |
| Vacuum grease | Sigma | 18405 | |
| Murashige and Skoog Basal Salts | Duchefa | M0221 | |
| Agar plant, 1 kg | Melford | P1001 | |
| Microscope slide ground edges, 76 mm x 26 mm, 1.0 mm to 1.2 mm thick | Fisher Scientific | 12383118 | |
| Cover slip No.1 1/2 glass 22 mm x 22 mm | Fisher Scientific | 12363138 | |
| Luer-slip Syringe 20 mL | Fisher Scientific | 10785126 | |
| 3M Micropor Surgical Paper Tape | Fisher Scientific | 12787597 | |
| Potassium Hydroxide, 500 g | Sigma Aldrich | 221473-500G-D | |
| Absolute Ethanol | Fisher Scientific | 10428671 | |
| Forceps Watchmaker 5 StSteel | Scientific Laboratory Supplies | INS4340 | |
| Scissors, 125 mm, stainless steel | Fisher Scientific | 12338099 | |
| Fitting reducer 0.5 to 1.6 | Ibidi | 10829 | |
| Leica SP8 | Confocal laser microscope 1 | ||
| Zeiss LSM 780 | Confocal laser microscope 2 | ||
| Imaris | Bitplane | 3D visualization and Analysis software | |
| Fiji | image analysis software | ||
| OriginPro | Origin Lab | Statistical Analysis Software |
References
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