Summary
Vi leverer protokoller for evaluering af mesenkymale stamceller isoleret fra dental pulp og prostata kræft celle interaktioner baseret på direkte og indirekte Co kultur metoder. Betingelse medium og trans-godt membraner er egnet til at analysere indirekte paracrine aktivitet. Såning varierende er farvede celler sammen en passende model for direkte celle-celle interaktion.
Abstract
Kræft som en omstændelig proces og kompliceret sygdom er ikke kun reguleres ved individuelle celledelingen og vækst men også kontrolleres af tumor miljø og celle-celle interaktioner. Identifikation af kræft og stamceller interaktioner, herunder ændringer i ekstracellulære miljø, fysisk interaktioner og udskilles faktorer, kunne bruges til opdagelsen af nye terapi muligheder. Vi kombinerer kendte Co kultur teknikker for at skabe et modelsystem for mesenchymale stamceller (msc) og kræft celle interaktioner. I den aktuelle undersøgelse, blev dental pulp stamceller (DPSCs) og PC-3 prostata kræft celle interaktioner undersøgt af direkte og indirekte Co kultur teknikker. Betingelse medium (CM) fremstillet af DPSCs og 0,4 µm pore størrelse trans-godt membraner blev brugt til at studere paracrine aktivitet. Fælles kultur af forskellige celletyper blev sammen udført for at studere direkte celle-celle interaktion. Resultaterne viste at CM øget celleproliferation og nedsat apoptose i prostata kræft cellekulturer. Både CM og trans-godt system forøget celle migration kapacitet af PC-3 celler. Celler farves med forskellige membran farvestoffer var seedede i de samme kultur fartøjer, og DPSCs deltog i en selvstændig organiseret struktur med PC-3 celler under denne direkte Co kultur betingelse. Samlet set viste resultaterne, at co kultur teknikker kan være nyttigt for kræft og MSC interaktioner som et modelsystem.
Introduction
Mesenchymale stamceller (msc), med mulighed for differentiering og bidrag til revitalisering af mesenchymale væv såsom knogle, brusk, muskler, ledbånd, senen og fedtholdigt, har været isoleret fra næsten alle væv i voksen krop1 , 2. bortset fra at levere væv homøostase ved at producere bosiddende celler i tilfælde af kronisk betændelse eller en skade, de producerer vitale cytokiner og vækstfaktorer at orkestrere angiogenese, immunsystemet og væv remodellering3. Samspillet mellem MSCs med kræft væv er ikke velforståede, men akkumulere tyder på, at MSC'er kan fremme tumor indledning, progression og metastase4.
MSC'er homing evne til tilskadekomne eller kronisk betændte gør dem en værdifuld kandidat til stamcelle-baseret terapi. Dog, kræft væv, "aldrig healing sår", også slip inflammatoriske cytokiner, pro-angiogene molekyler og afgørende vækstfaktorer, som tiltrækker MSC'er til cancerogenous område5. Mens der er begrænset rapporteret rapporter viser hæmmende effekter af MSCs på kræft vækst6,7, deres kræft progression og metastase fremme effekter har været flittigt8. MSC'er påvirker direkte eller indirekte carcinogenese på forskellige måder, herunder undertrykke immun celler udskiller vækstfaktorer/cytokiner, der understøtter kræft celleproliferation og migration, forbedring af angiogene aktivitet, og regulering epitel-mesenchymale overgang (EMT)9,10. Tumor miljø består af flere celletyper, herunder kræft-associerede fibroblaster (cafïr) og/eller myofibroblasts, endotel celler, adipocytter og immunceller11. Af dem er cafïr den mest rigelige celletype i området tumor, der udskiller forskellige kemokiner fremme kræft vækst og metastase8. Det har vist sig at knoglemarven-afledte MSCs kan differentiere til cafïr i tumor stroma12.
Dental pulp stamceller (DPSCs), karakteriseret som de første dental væv-afledte MSCs af Gronthos et al. 13 i 2000 og derefter almindeligt undersøges af andre14,15, udtryk pluripotency markører som Oct4, Sox2og Nanog16 og kan udvikle sig til forskellige celle linages17. Gen og protein udtryk analyse viste sig at DPSCs producere sammenlignelige niveauer af vækstfaktorer/cytokiner med andre MSCs som vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF), angiogenin, fibroblast vækstfaktor 2 (FGF2), interleukin-4 (IL-4), IL-6, IL-10, og stamceller faktor (SCF), samt fms-lignende tyrosin kinase-3 ligand (Flt - 3L), der kan fremme angiogenese, modulere immunceller og støtte kræft celle spredning og migration18,19,20 . Mens MSCs interaktioner med kræft miljø har været veldokumenteret i litteraturen, er forholdet mellem DPSCs og kræftceller ikke blevet evalueret endnu. I den foreliggende undersøgelse etableret vi fælles kultur og betingelse medium behandling strategier for en yderst metastatisk prostata cancer cellelinie, PC-3 og DPSCs at foreslå potentielle aktioner af mekanisme af dental MSCs i kræft progression og metastaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Skriftlig informeret samtykke af patienterne blev opnået efter godkendelse fra Udvalget om institutionelle etik.
1. DPSC Isolation og kultur
- Overføre visdom tænder fremstillet af unge voksne i alderen mellem 17 og 20-15 mL rør indeholdende komplet Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM) [lav glucose DMEM medier, suppleret med 10% føtal bovint serum (FBS) og 1% penicillin/streptomycin / amphotericin (PSA) løsning], inden for 8 h efter resektion. Holde væv materiale koldt (4 ° C) under overførsel at undgå potentielle celledød.
- Fjerne pulp væv af sterile udvinding pincet fra midten af tanden forsigtigt, placere pulp væv i den kolde komplet DMEM medium i 10 cm vævskultur retter og hakke dem i små stykker (2-3 mm) af skalpel.
Bemærk: Alle eksperimentelle procedurer bør gennemføres under sterile forhold i laminar flow hætte. Denne ikke-enzymatisk teknik har været tidligere anvendte21,22,23. - Sted lille pulp væv inde i vævskultur behandlet 6-godt plader og tilføje 200 µL af komplet DMEM medier til at dække hver lille pulp væv stykker.
- Inkubér vævskultur brøndene ved 37 ° C i en befugtet luft atmosfære (80% fugtighed) med 5% CO2 for 2 h at give væv vedhæftet fil.
Bemærk: Dette trin kunne forlænges til 3-4 h ved at styre fordampningen af medier. - Tilføje passende volumen (2-2,5 mL) af komplet DMEM medium brønde og inkuberes ved 37 ° C i en befugtet luft atmosfære med 5% CO2 for celler til at sprede fra vævet.
Bemærk: Celler blive synlige efter ca. 4 dage og nå confluency efter 8-9 dage. - Når celler nå 80% confluency, fjerne medier fra 6-godt plader, vask med 2 mL af fosfatbufferet saltopløsning (PBS), og der tilsættes 2 mL trypsin. Der inkuberes i 2 min i en inkubator ved 37 ° C med befugtet luft atmosfære og 5% CO2. Derefter tilsættes 2 mL af komplet DMEM medium efterfulgt af 2 min inkubation at hæmme trypsin. Der centrifugeres celler ved 300 x g i 5 min at sammenpresse cellerne.
- Passage celler til kolberne i komplet DMEM medier og butik for yderligere eksperimenter. Tilsættes 15 mL komplet DMEM media T-75 kolber og overførsel celler fra to brønde af 6-godt plade til én T-75 kolber og inkuberes ved 37 ° C med befugtet luft atmosfære og 5% CO2.
2. karakterisering af DPSCs
- Udføre morfologiske analyser.
- Frø celler (trin 1,6) i vævskultur belagt kolberne (eller 6-godt plader) i komplet DMEM medium for mindst 8 passager til at observere celle morfologi.
- Visualiser celler ved lysmikroskop og definere fibroblast-lignende celle morfologi. Celler bør tillægger kulturen retter og har spindel-lignende celle morfologi.
Bemærk: Alternativt celler kan være kulturperler som enkelt celler i op til 14 dage i well-plader til at observere koloni dannelse kapacitet, som en konkret kendetegner fibroblaster og MSCs.
- Udføre overflade markør analyser.
- Trypsinize celler fra trin 1.7. Fjerne medier fra T-75 vævskultur kolbe, vask med 2 mL PBS, og der tilsættes 2 mL trypsin. Der inkuberes i 2 min i en inkubator ved 37 ° C med befugtet luft atmosfære og 5% CO2. Derefter tilsættes 2 mL af komplet DMEM medium efterfulgt af 2 min inkubation at hæmme trypsin. Der centrifugeres celler ved 300 x g i 5 min at sammenpresse cellerne.
- Fix cellerne med 4% PARAFORMALDEHYD i 20 min. ved stuetemperatur i 1,5 mL rør og derefter vaske dem med 500 µL af PBS 3 gange at fjerne PARAFORMALDEHYD.
- Inkuber fast celler med antistoffer mod CD29, CD34, CD14, CD45, CD90, CD105, CD166 og CD73 i 1 time ved 4 ° C i 100 µL af PBS.
Bemærk: Koncentrationen af antistof bruges er 0,5 µg/mL. CD34, CD14 og CD45 bruges som negative markører, mens CD29, CD90, CD105, CD166 og CD73 bruges som positive celle overflade markører til MSCs. - Vaske cellerne 3 gange med PBS og bruge respektive sekundære antistoffer fluorescein isothiocyanat (FITC), phycoerythrin (PE), etc. for mærkning. Inkuber celler med 1: 500 fortyndet sekundære antistoffer i 100 µL af PBS i 30 min. ved 4 ° C og vask 3 gange med PBS.
- Holde prøver i mørke for flow flowcytometri analyse og påvise positive og negative farvning ved flowcytometri.
Bemærk: Brug unstained kontrol celler til at arrangere frem og side scatter. Arrangere gating af positivt farves befolkninger ved at udelukke døde hudceller, debris og un-farvede befolkning. Bruge 100 µm mundstykke med 45 psi kappe pres og indsamle 10.000 begivenheder Bestem positive DPSCs ved at arrangere kanaler.
- Udføre differentiering af DPSCs.
- Frø 1 × 104 celler på 24-godt plader i komplet DMEM medier og inkuberes i 24 timer ved 37 ° C i en befugtet luft atmosfære med 5% CO2.
- Formulere differentiering medier bruger konkurrere DMEM medium som base medier. Forberede osteogenic medier ved blanding af 100 nM dexamethason, 10 mM β-glycerophosphate og 0,2 mM ascorbinsyre. Forberede chondrogenic medier ved at blande 1 × insulin-transferrin-selen (ITS-G), 100 nM dexamethason, 100 ng/mL omdanne vækst faktor beta (TGF-β), 14 μg/mL ascorbinsyre og 1 mg/mL bovint serumalbumin (BSA). Forberede adipogenic medier ved blanding af 100 nM dexamethason, 5 μg/mL insulin, 0,5 mM 3-isobutylacetophenon-1-Methylxanthin (IBMX) og 60 μM indomethacin.
Bemærk: Differentiering medier kan opbevares ved 4 ° C i mindst en uge. - Ændre vækst medier osteo-, chondro-eller adipo-genic differentiering medier og Opdater medier to gange om ugen i to uger.
- Bekræfte differentiering af von Kossa og Alcian blå farvning, enzymaktivitet (alkalisk fosfataseaktivitet), immuncytokemi og kvantitative polymerase kæde reaktion (qPCR) analyser efter protokoller tidligere beskrevet21.
- Udføre von Kossa og Alcian blå stainings på celler, der er fastsat med 4% PARAFORMALDEHYD ved stuetemperatur i 10 min. fast cellerne vaskes med PBS og bejdse dem med vonKossa kit ifølge producentens anbefalinger til at observere kalkaflejringer .
- Forberede Alcian blå farvning løsning ved at opløse 1,00 g af Alcian blå farvestof i 100 mL 3% (v/v) eddikesyre til yderligere farvning. Fast cellerne vaskes med PBS og plette celler i 30 min med Alcian blå løsning. Visualisere de farvede prøver af et lysmikroskop.
3. forberedelse af betingelse Medium (CM)
- Erstatte medier af celler fra trin 1.7 med friske komplet DMEM 24 h før CM samling.
Bemærk: Passage 2-4 anbefales. - Indsamle tilstand medium (CM) fra dyrkede DPSCs, når celler nå 80% confluency. Der centrifugeres indsamlede medier på 300 x g for 5 min at fjerne affald væv materiale og celle debris.
Bemærk: Brug alternativt 0,2 µm sprøjte filtre til at fjerne snavs fra betingelse medium. - Indsamle supernatanten og opbevares ved-20 ° C til yderligere forsøg.
Bemærk: Hold supernatanten ved-80 ° C til langtidsopbevaring.
4. behandling af kræftceller med CM
- Udføre celle levedygtighed analyser.
- Frø PC-3 celler (menneskers prostatakræft celler) på 96-brønd plader med en celle tæthed på 5 × 103 celler/brønd i komplet DMEM og inkuberes i en fugtig kammer ved 37 ° C og 5% CO2 i 24 timer.
- Behandling af celler med 10, 20, 30, 40 og 50% af CM (v/v) blandet med komplet DMEM for 24 timer.
- Måling af cellers levedygtighed ved hjælp af 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium (MTS)-assay som tidligere beskrevet24.
- Udføre terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick ende mærkning (TUNEL) analyser.
- Frø PC-3 celler på 6-godt cellekultur plader med en celle tæthed på 2 × 105 celler/brønd og Inkuber i et befugtet kammer ved 37 ° C og 5% CO2 natten over.
- Bland 20% CM (v/v) med komplet DMEM medium og anvende på celler i 24 timer.
- Trypsinize celler og suspendere i 50 μL af TUNEL reaktionsblandingen (mærkning løsning + enzym løsning, leveres med kittet) og inkuberes ved 37 ° C i 60 min i en fugtig og 5% CO2 atmosfære.
Bemærk: For trypsinization, fjerne medier fra 6-godt celle kultur plader, vask med 1 mL PBS og tilsættes 500 µL af trypsin. Der inkuberes i 2 min i en inkubator ved 37 ° C med befugtet luft atmosfære og 5% CO2. Der tilsættes 1 mL af komplet DMEM medium efterfulgt af 2 min inkubation at hæmme trypsin. Der centrifugeres celler ved 300 x g i 5 min at sammenpresse cellerne. - Skyl med PBS og analysere celler i PBS ved hjælp af flowcytometri.
- Udføre qPCR analyser.
- Frø PC-3 celler på 6-godt cellekultur plader med en celle tæthed på 2 × 105 celler/brønd og Inkuber i et befugtet inkubator ved 37 ° C og 5% CO2 natten over.
- Bland 20% CM (v/v) med komplet DMEM medium og anvende på celler i 24 timer.
- Trypsinize celler og indsamle celle pellet for RNA isolering og cDNA syntese.
Bemærk: Fjerne medier fra 6-godt celle kultur plader, vask med 1 mL PBS og tilsættes 500 µL af trypsin. Inkuber 2 min i en inkubator ved 37 ° C med befugtet luft atmosfære og 5% CO2. Der tilsættes 1 mL af komplet DMEM medium efterfulgt af 2 min inkubation at hæmme trypsin. Der centrifugeres celler ved 300 x g i 5 min at sammenpresse cellerne. - Udføre qPCR eksperimenter ifølge den tidligere beskrevne protokol25.
- Udføre celle migration af kræftceller.
- Frø 1 × 105 PC-3 celler på 12-godt plader og inkuberes i en fugtig inkubator natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
- Skrab celler med en steril 200 μl spids og ændre medium straks med friske medium indeholdende forskellige koncentrationer af CM [fx10, 20, 30, 40 og 50% af CM (v/v) blandet med komplet DMEM].
- Observere ridser under en inverteret mikroskop og tage billeder på forskellige tidsintervaller (0-24 timer).
- Måle scratch lukning ved hjælp af billede Jørgensen software ved hjælp af formlen:
Bemærk: Åbne ridse billedet med billede Jørgensen software. Tegne en linje, der har samme størrelsesorden som skalalinjen, der allerede findes i billedet. Klik på analysere, angive målestok og observere afstanden i pixel som forstørrelse af den tegnede linje. Skrive størrelsen af skalalinjen kendt distance del, arrangere enhed (pixels, cm, etc.), og klik på ok. Gå til afsnittet analyser igen og klik på målinger. Dette vil først give størrelsen af skalalinjen som den valgte enhed. Klik på kanten af bunden og træk indtil nå anden enden af bunden. Bemærk værdien for hvert tidspunkt (0 og 24 h). Sæt disse værdier i formlen ovenfor og beregne de scratch lukning.
5. celle Migration af indirekte kontakt af kræftceller og DPSCs
- Frø 3 × 104 DPSCs på 24-godt plade skær med 0,4 μm pore og inkuberes i en fugtig inkubator natten over ved 37 ° C.
- Frø PC-3 celler på 24-godt plader med en celle tæthed på 5 × 104 og inkuberes i en fugtig inkubator natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
- Skrab PC-3 celler med en steril 200 μl tip, ændre medium med friske medium og placere skær transporterer DPSCs ind på PC-3 celler.
- Observere celler under en inverteret mikroskop og tage billeder på forskellige tidsintervaller (0-24 h) til at analysere celle migration.
6. fælles kultur Assay og Flow flowcytometri analyse
- Label PC-3 celler og DPSCs ved hjælp af PKH67 (grøn) og PKH26 (rød) fluorescerende celle linker farvestoffer, henholdsvis26.
- Trypsinize PC-3 og DPSCs celler, henholdsvis. Fjerne medier fra T-75 vævskultur kolbe, vask med 2 mL PBS, og der tilsættes 2 mL trypsin. Der inkuberes i 2 min i en inkubator ved 37 ° C med befugtet luft atmosfære og 5% CO2. Der tilsættes 2 mL af komplet DMEM medium efterfulgt af 2 min inkubation at hæmme trypsin.
- Centrifugeres celler ved 300 x g i 5 min, kassere supernatanten og resuspend celle pellets i opløsningen farvestof forberedt i fortyndingsmiddel-C buffer leveret af sættet (Se Tabel af materialer).
- Inkuber celler i opløsningen farvestof i 10 min og opsige den farvning reaktion ved at tilføje 100 µL af FBS. Centrifugeres celler ved 300 x g i 5 min, supernatanten fjernes, og cellerne vaskes med komplet vækstmediet før Co dyrkning.
- Pladen hedder celler (5 × 104/godt) på 6-godt plader på 1:1 ratio (DPSCs: PC3). Vedligeholde Co kulturperler celler i komplet DMEM.
- Indsamle celler efter 24 h eller 48 h inkubation perioder ved centrifugering af celler ved 300 x g i 5 min og vask med PBS.
- Resuspend celler i 300 µL af fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) buffer i 5 mL rund bund flow flowcytometri rør. Vortex at sprede celle aggregater lige før prøven analyse.
- Bruge en 100 µm dyse med 45 psi kappe pres.
Bemærk: Ekstremt høje strømningshastighed kan mindske følsomheden af fluorescens påvisning. - Brug unstained kontrol celler og enkelt farvede celler til at justere passende frem og side scatter laser spænding for celletyper og kompensation som tidligere nævnt27.
Bemærk: Brug gating for levende celler for at udelukke celle debris, døde celler eller aggregater. - Indsamle 10.000 hændelser (100.000 er at foretrække) for at fastslå procent positive grønne DPSCs og røde PC-3 celler ved at arrangere FL-1 (grøn) og FL-2 (rød) kanaler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser de generelle MSC Karakteristik af DPSCs kultur betingelser. DPSCs øve fibroblast-lignende celle morfologi efter plating (figur 1B). MSC overflade antigener (CD29, CD73, CD90, CD105 og CD166) udtrykkes meget mens hæmatopoietisk markører (CD34, CD45 og CD14) er negativ (figur 1 c). Ændringer på morfologiske og molekylære plan vedrørende osteo-, chondro-, og adipo-genic differentiering er observeret i DPSCs kultur efterfulgt af differentiering cocktail anvendelse (fig. 1 d).
For at bestemme aktivitet udskilles molekyler fra DPSCs på prostatakræft celleproliferation og migration, anvendte vi CM, der opsamlet fra kulturperler dental stamceller og analyseret kræft celleproliferation og vandrende adfærd. CM behandling (20% v/v) blev udvalgt på grundlag af MTS celle levedygtighed analyser. PC-3 celler behandles med stamcelle CM blev udsat for TUNEL assay og qPCR analyser at fastslå celle død og apoptotiske forordning under kontrol og forsøgsbetingelser. Vi konkluderede, at CM behandling øget cellernes levedygtighed og reduceret celledød i PC-3 cellekultur. Ex vivo celle migration assay (scratch assay) blev udført for at vurdere, om CM af DPSCs påvirker PC-3 kræft celle migration. Behandling med koncentrationerne af 10% og 20% CM (v/v) øget scratch lukning betydeligt i forhold til kontrolgruppe på 24 h (figur 2). Tilsvarende induceret 20% CM (v/v) behandling opregulering af ekstracellulære matrix protein gen udtryk som kollagen, fibronektin, og laminin, som spiller en betydelig rolle i celle migration.
Vi brugte to forskellige kultur teknikker til at etablere direkte og indirekte Co kulturer af PC-3 celler og DPSCs på ex vivo betingelser. Trans-godt system blev valgt til at oprette en indirekte interaktion miljø for PC-3 celler. PC-3 celler var seedet på bunden af den godt plade og skær transporterer DPSCs var placeret på toppen. Fordi vi har til formål at generere en in-direkte interaktion, blev trans-godt membraner med 0,4 μm porestørrelse brugt til at forebygge fysiske celle bevægelse af DPSCs fra den øverste del at nederste del gennem membranen. Udskilles molekyler fra DPSCs steg scratch lukning af PC-3 celler markant i forhold til kontrol celler. PC-3 celler Co kulturperler med DPSCs viste en 51% scratch lukning mens kontrol celler havde 38% lukning efter 24 h (figur 3A). Direkte Co kulturer indeholdende 1:1 forholdet mellem DPSCs og PC-3 celler blev brugt til at analysere selv-organisering af stamceller og kræftceller. Celler var plettet med røde og grønne membran farvestoffer til at skelne mellem forskellige celletyper under mikroskop. PC-3 celler plettet med røde fluorescens dye var omgivet af DPSCs i en tube-lignende struktur efter en inkubationstid på 24 timer. Co kulturperler celler farves med fluorescerende farvestoffer blev analyseret ved flowcytometri baseret på fluorescens farvning, og celle nøgletal blev opdaget. DPSCs og PC-3 celler lavet en velorganiseret struktur, hvor PC-3 celler tilvækst hurtigt efter 48 h (figur 3B). Selvom cellerne var seedet på en lige forhold (1:1) til direkte Co kultur, blev 62.22% af PC-3 celler fastsat efter 48 h inkubation, der angiver den højere spredning sats af PC-3 celler.
Figur 1: karakterisering af dental pulp stamceller (DPSCs). (A) papirmasse væv fra midten af tanden. (B) Fibroblast-lignende celle morfologi stordriftsfordele DPSCs. bar: 100 μm. (C) Flow flowcytometri analyser af DPSCs. CD29, CD73, CD90, CD105 og CD 166 er positive celleoverflademarkører, mens CD14, CD34, og CD45 er negative overflade markører. NC: negativ kontrol (vækstmediet behandlede celler). (D) differentiering af DPSCs til mesenchymale celletyper blev bekræftet med von Kossa farvning, Alcian blå farvning, og lipid dråber (skalalinjen: 200 μm). Osteocalcin, collagen skrive II (Col II) og fedtsyre bindende protein 4 (FABP4) immunostainings viste osteo-, chondro- og adipogenic differentiering af DPSCs. skalalinjen: 200 μm. Dette tal er tilpasset fra Dogan et al. 34. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: samling af betingelse medium (CM) fra DPSCs til celle levedygtighed og bunden analyser. TUNEL positive celler var faldt med 20% CM (v/v) program. Kvantitativ måling af scratch lukning viste, at CM øget PC-3 celle migration. CM: konditioneret medium; NC: negativ kontrol (vækstmediet behandlede celler). * P < 0,05. Dette tal er tilpasset fra Dogan et al. 34. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: metode til trans-godt celle migration assay og co kultur. (A) PC-3 celle scratch lukning i trans-godt Co kultur-systemet. (B) interaktion mønster af farvede DPSCs (grøn fluorescens) og PC-3 celler (rød fluorescens) efter 24 h og 48 h Co kultur (1:1 seeding ratio). Højere PC-3 celle nummer blev fundet med hensyn til DPSCs. skalalinjen: 200 μm. Dette tal er tilpasset fra Dogan et al. 34. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bidrag af MSC'er til tumor miljø er reguleret af flere interaktioner herunder hybrid celle generation via celle fusioner, entosis eller cytokin og chemokine aktiviteter mellem stamceller og kræft celler28. Strukturelle organisation, celle-celle interaktioner og udskilles faktorer bestemme kræft celle adfærd tumor forfremmelse, progression og metastaser til omkringliggende væv. Ordentlig ex vivo modelsystemer til at undersøge mekanismerne bag samspillet mellem bosiddende cellepopulationer skal forstå cellular meddelelser for kræft progression og metastaser.
Vi brugte DPSCs til at skabe et modelsystem for prostatakræft og dental stamcelle interaktioner. Fordelen ved denne type af voksne stamceller er tilgængeligheden af væv kilde og let isoleret trin. På den anden side er bruger kun DPSCs uden sammenligning med kendte voksne stamceller typer en begrænsning af denne protokol. Nuværende Co kultur metoder er kategoriseret i direkte og indirekte teknikker, som omfatter paracrine signalering af opløselige udskilles molekyler og direkte kultur af forskellige cellepopulationer i det samme miljø29,30, 31. CM af fuldt karakteriseret DPSCs blev brugt til at vurdere paracrine signaling medieret kræft cellevækst i kultur. CM ansøgning er den enkleste metode for celle interaktion undersøgelser og giver mulighed for observation af opløselige mægler aktiviteter i kultur-systemet. Selvom CM ikke er en fuldt tilstrækkelig modelsystem, er CM anvendelse som en fælles kultur metode meget effektiv til at observere celle-celle interaktioner ex vivo. CM af DPSCs øget celleproliferation og migration af prostata cancerceller, der angiver erhvervelse af metastatisk fænotype på grund af faktorer, der udskilles fra DPSCs.
En anden model af celle-celle interaktion er oprettelsen af en fysisk barriere som en trans-godt membran mellem celle populationer30. Trans-godt systemer er opdelt i to typer: dem, der tillader celle bevægelse gennem porerne, og dem, der muliggør overførsel af udskilles faktorer samtidig hindrer celle kontakt gennem membranen. Vi brugte trans-brønde med 0,4 μm porestørrelse analysere lukning af PC-3 ridser, afslørende højere kræft celle migration sats i den DPSC gruppe i forhold til kontrol celler.
Selvom CM og trans-godt-baserede systemer er fordelagtige for blot analysere bidrag af en bestemt celle type32, er direkte dyrkning af forskellige delpopulationer i det samme miljø nødvendigt parallelt med indirekte Co kultur metoder. Seeding forholdet kan kontrolleres og strukturelle organisation af adskilte populationer kan let analyseres af direkte Co kultur af MSC med kræftceller. Vi brugt 1:1 forholdet mellem DPSCs og PC-3 celler farves med grønne og røde fluorescens membran farvestoffer, henholdsvis. DPSCs omkranset PC-3 celler og lavet en tube-lignende struktur i kultur brønde. PC-3 celler dannede klynger i form af Holme omgivet af kanal-lignende strukturer dannet af DPSCs.
For nylig, Brunetti et al. viste, at DPSCs udskiller TNF-relaterede apoptose-inducerende ligand (TRAIL) under osteogenic differentiering og påvirke myelomatose kræftcelle levedygtighed, der angiver de mulige interaktioner af dental stamceller med kræft celler33. Vores undersøgelse er den første betænkning, der evaluerer interaktioner af dental afledte MSCs og prostata kræftceller som en ex vivo -model. Vi brugte tre forskellige direkte/indirekte metoder i vores eksperimenter. Spredning af kræftceller og høj migration priser blev opdaget enten af CM og trans-godt assays eller ved co dyrkning af varierende farvede celler, der giver mulighed for flere interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Yeditepe Universitet. Alle data og tal, der anvendes i denne artikel var tidligere udgivne34.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 11885084 | For cell culture |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | For cell culture |
| PSA | Lonza | 17-745E | For cell culture |
| Trypsin | Invitrogen | 25200056 | For cell dissociation |
| PBS | Invitrogen | 10010023 | For washes |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Component of differentiation media |
| β-Glycerophosphate | Sigma | G9422 | Component of osteogenic differentiation medium |
| Ascorbic acid | Sigma | A4544 | Component of osteo- and chondro-genic differentiation medium |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS −G) | Invitrogen | 41400045 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| TGF-β | Sigma | SRP3171 | Component of chondrogenic differentiation medium |
| Insulin | Sigma | I6634 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma | I7018 | Component of adipogenic differentiation medium |
| Indomethacin | Sigma | I7378 | Component of adipogenic differentiation medium |
| MTS Reagent | Promega | G3582 | Cell viability analyses |
| TUNEL Assay | Sigma | 11684795910 | Apoptotic analyses |
| 24-well plate inserts | Corning | 3396 | For trans-well migration assay |
| PKH67 | Sigma | PKH67GL | For co-culture cell staining |
| PKH26 | Sigma | PKH26GL | For co-culture cell staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | For cell fixation |
| von Kossa Kit | BioOptica | 04-170801.A | For cell staining (differentiation) |
| Alcian blue | Sigma | A2899 | For cell staining (differentiation) |
References
- Camberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
- Demirci, S., Doğan, A., Şahin, F. Dental Stem Cells. , Springer. 109-124 (2016).
- Fox, J. M., Chamberlain, G., Ashton, B. A., Middleton, J. Recent advances into the understanding of mesenchymal stem cell trafficking. British journal of haematology. 137 (6), 491-502 (2007).
- Chang, A. I., Schwertschkow, A. H., Nolta, J. A., Wu, J. Involvement of mesenchymal stem cells in cancer progression and metastases. Current cancer drug targets. 15 (2), 88-98 (2015).
- Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. New England Journal of Medicine. 315 (26), 1650-1659 (1986).
- Lu, Y. -r, et al. The growth inhibitory effect of mesenchymal stem cells on tumor cells in vitro and in vivo. Cancer biology & therapy. 7 (2), 245-251 (2008).
- Secchiero, P., et al. Human bone marrow mesenchymal stem cells display anti-cancer activity in SCID mice bearing disseminated non-Hodgkin's lymphoma xenografts. PloS one. 5 (6), e11140 (2010).
- Hong, I. -S., Lee, H. -Y., Kang, K. -S. Mesenchymal stem cells and cancer: friends or enemies? Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 768, 98-106 (2014).
- Brennen, W. N., Chen, S., Denmeade, S. R., Isaacs, J. T. Quantification of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) at sites of human prostate cancer. Oncotarget. 4 (1), 106 (2013).
- Klopp, A. H., Gupta, A., Spaeth, E., Andreeff, M., Marini, F. Concise review: dissecting a discrepancy in the literature: do mesenchymal stem cells support or suppress tumor growth. Stem cells. 29 (1), 11-19 (2011).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nature Reviews Cancer. 7 (2), 139 (2007).
- Quante, M., et al. Bone marrow-derived myofibroblasts contribute to the mesenchymal stem cell niche and promote tumor growth. Cancer cell. 19 (2), 257-272 (2011).
- Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (25), 13625-13630 (2000).
- Mori, G., et al. Dental pulp stem cells: osteogenic differentiation and gene expression. Annals of the new York Academy of Sciences. 1237 (1), 47-52 (2011).
- Mori, G., et al. Osteogenic properties of human dental pulp stem cells. Journal of biological regulators and homeostatic agents. 24 (2), 167-175 (2010).
- Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
- Potdar, P. D., Jethmalani, Y. D. Human dental pulp stem cells: applications in future regenerative medicine. World journal of stem cells. 7 (5), 839 (2015).
- Ahmed, N. E. -M. B., Murakami, M., Hirose, Y., Nakashima, M. Therapeutic potential of dental pulp stem cell secretome for Alzheimer's disease treatment: an in vitro study. Stem cells international. 2016, (2016).
- Gorin, C., et al. Priming dental pulp stem cells with fibroblast growth factor-2 increases angiogenesis of implanted tissue-engineered constructs through hepatocyte growth factor and vascular endothelial growth factor secretion. Stem cells translational medicine. 5 (3), 392-404 (2016).
- Wakayama, H., et al. Factors secreted from dental pulp stem cells show multifaceted benefits for treating acute lung injury in mice. Cytotherapy. 17 (8), 1119-1129 (2015).
- Doğan, A., et al. Differentiation of human stem cells is promoted by amphiphilic pluronic block copolymers. International Journal of Nanomedicine. 7, 4849 (2012).
- Taşlı, P. N., Doğan, A., Demirci, S., Şahin, F. Boron enhances odontogenic and osteogenic differentiation of human tooth germ stem cells (hTGSCs) in vitro. Biological trace element research. 153 (1-3), 419-427 (2013).
- Yalvac, M., et al. Isolation and characterization of stem cells derived from human third molar tooth germs of young adults: implications in neo-vascularization, osteo-, adipo-and neurogenesis. The pharmacogenomics journal. 10 (2), 105 (2010).
- Doğan, A., et al. Sodium pentaborate pentahydrate and pluronic containing hydrogel increases cutaneous wound healing in vitro and in vivo. Biological trace element research. 162 (1-3), 72-79 (2014).
- Doğan, A., Yalvaç, M. E., Yılmaz, A., Rizvanov, A., Şahin, F. Effect of F68 on cryopreservation of mesenchymal stem cells derived from human tooth germ. Applied biochemistry and biotechnology. 171 (7), 1819-1831 (2013).
- Rizvanov, A. A., et al. Interaction and self-organization of human mesenchymal stem cells and neuro-blastoma SH-SY5Y cells under co-culture conditions: A novel system for modeling cancer cell micro-environment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 76 (2), 253-259 (2010).
- Troiano, L., et al. Multiparametric analysis of cells with different mitochondrial membrane potential during apoptosis by polychromatic flow cytometry. Nature protocols. 2 (11), 2719 (2007).
- Melzer, C., von der Ohe, J., Lehnert, H., Ungefroren, H., Hass, R. Cancer stem cell niche models and contribution by mesenchymal stroma/stem cells. Molecular cancer. 16 (1), 28 (2017).
- Aguirre, A., Planell, J., Engel, E. Dynamics of bone marrow-derived endothelial progenitor cell/mesenchymal stem cell interaction in co-culture and its implications in angiogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 400 (2), 284-291 (2010).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H. Biomimetics and Stem Cells. , Springer. 29-36 (2013).
- Plotnikov, E., et al. Cell-to-cell cross-talk between mesenchymal stem cells and cardiomyocytes in co-culture. Journal of cellular and molecular. 12 (5a), 1622-1631 (2008).
- Bogdanowicz, D. R., Lu, H. H.
- Brunetti, G., et al. High expression of TRAIL by osteoblastic differentiated dental pulp stem cells affects myeloma cell viability. Oncology reports. 39 (4), 2031-2039 (2018).
- Doğan, A., Demirci, S., Apdik, H., Apdik, E. A., Şahin, F. Dental pulp stem cells (DPSCs) increase prostate cancer cell proliferation and migration under in vitro conditions. Tissue and Cell. 49 (6), 711-718 (2017).
