Summary
Este protocolo visa demonstrar como combinar em vitro matrizes de microeletrodos com dispositivos microfluídicos para estudar a transmissão do potencial de ação em culturas neuronal. Análise de dados, ou seja, a detecção e caracterização de potenciais de ação, de propagação é realizada utilizando um novo avançado, ainda amigável e livremente disponível, ferramenta computacional.
Abstract
Matrizes de microeletrodos (MEAs) são amplamente utilizados para estudar a função neuronal em vitro. Estes dispositivos permitem simultânea gravação/estimulação não-invasiva da atividade eletrofisiológica por longos períodos. No entanto, a propriedade de sensoriamento de sinais de todas as fontes em torno de cada microeletrodos pode tornar-se desfavorável ao tentar compreender a comunicação e propagação em circuitos neuronais do sinal. Em uma rede neuronal, vários neurônios podem ser ativados simultaneamente e podem gerar potenciais de ação sobrepostas, dificultando a discriminar e controlar a propagação do sinal. Considerando esta limitação, nós estabelecemos uma configuração em vitro focada na avaliação eletrofisiológica comunicação, que é capaz de isolar e amplificar sinais axonal com alta resolução espacial e temporal. Por interfaceando dispositivos microfluídicos e MEAs, somos capazes de compartimentalizar culturas neuronal com um alinhamento bem controlado dos axônios e microeletrodos. Esta configuração permite gravações de propagação de pico com uma alta relação sinal-ruído ao longo de várias semanas. Combinado com algoritmos de análise de dados especializados, fornece quantificação detalhada de vários comunicação relacionados propriedades tais como a velocidade de propagação de falha de condução, taxa de queima, picos anterógrada e mecanismos de codificação.
Este protocolo demonstra como criar uma configuração de cultura neuronal compartimentada sobre MEAs integrada ao substrato, como cultura neurônios nesta configuração e como com êxito, gravar, analisar e interpretar os resultados de tais experiências. Aqui, nós mostramos como a configuração estabelecida simplifica a compreensão da comunicação neuronal e propagação de sinal axonal. Essas plataformas pavimentar o caminho para novos modelos em vitro com topografias de rede neuronal engenharia e controlável. Eles podem ser usados no contexto das culturas neuronais homogêneas, ou com configurações de cultura co onde, por exemplo, a comunicação entre os neurônios sensoriais e outros tipos de células é monitorizada e avaliada. Esta configuração fornece condições muito interessantes para estudar, por exemplo, neurodesenvolvimento, circuitos neuronais, informações de codificação, abordagens neurodegeneração e Epilepsias.
Introduction
Compreender a comunicação elétrica em circuitos neuronais é um passo fundamental para revelar a função normal e elaborar estratégias terapêuticas para tratar a disfunção. Os neurônios integram, computar e potenciais de ação (APs), que se propagam ao longo de seus axônios finos de relé. Técnicas eletrofisiológicas tradicionais (por exemplo, braçadeira do remendo) são técnicas poderosas para estudar a atividade neuronal, mas muitas vezes são limitadas para as maiores estruturas celulares, tais como o soma ou os dendritos. Técnicas de imagem para oferecer uma alternativa para estudar sinais axonal com alta resolução espacial, mas eles são tecnicamente difíceis de executar e não permita que a longo prazo as medidas1. Neste contexto, a combinação de matrizes de microeletrodos (ama) e microfluídica pode dar um contributo poderoso em divulgar as propriedades fundamentais de transmissão de atividade e do sinal de neuron´s dentro de redes neuronais em vitro2 , 3.
Tecnologia MEA baseia-se em gravações extracelulares de culturas neuronal. As principais vantagens desta metodologia eletrofisiológicos são sua capacidade de oferecer suporte a estimulação simultânea, a longo prazo e gravação em vários locais e em uma maneira não-invasiva de3. MEAs são feitos de biocompatíveis, altos microeletrodos condutivos e resistentes à corrosão incorporados em uma carcaça de vidro da bolacha. Eles são compatíveis com celulares convencionais cultura bio-revestimentos de, promovendo a adesão célula significativamente aumentam a resistência da selagem entre o substrato e as células3,4. Além disso, eles são versáteis no design e podem variar em tamanho de microeletrodos, geometria e densidade. MEAs trabalham global, como vasos de cultura de células convencional com a vantagem de permitir simultâneas de imagem ao vivo e eletrofisiológica gravações/estimulação.
O uso da tecnologia MEA tem contribuído para o estudo das características importantes de redes neurais,5. No entanto, existem características inerentes que limitam o desempenho de MEAs para estudar comunicação e propagação de APs em um circuito neuronal. MEAs permitem gravações de simples células e estruturas subcelulares mesmo como axônios, mas quando comparado aos sinais somal, sinais axonal têm uma muito baixa relação sinal-ruído (SNR)6. Além disso, a característica de sensoriamento potenciais de campo extracelular de todas as fontes em torno de cada microeletrodos dificulta o rastreamento da propagação de sinal em um circuito neuronal.
Estudos recentes têm demonstrado, no entanto, que melhores condições de gravação podem ser conseguidas tendo os microeletrodos alinhados dentro de microcanais estreito no qual podem crescer axônios. Essa configuração fornece um aumento significativo do SNR tal que axonal sinais de propagação pode ser facilmente detectado7,8,9,10,11,12, 13. A estratégia de aliar microfluidic dispositivos com tecnologia MEA cria um isolado eletricamente microambiente adequado para amplificar sinais axonal11. Além disso, a presença de múltiplos microeletrodos sensoriamento ao longo de um disco é fundamental para detecção e caracterização de propagação do sinal axonal.
Tais plataformas em vitro com topografias altamente controlável rede neuronal podem ser adaptadas para muitas perguntas de pesquisa14. Essas plataformas são apropriadas para ser utilizados no contexto das culturas neuronais, mas podem ser expandidas para engenheiro configurações de cultura co, onde a comunicação entre os neurônios e outros tipos de células pode ser monitorizada e avaliada. Assim, esta configuração fornece condições muito interessantes para explorar uma série de estudos neurais relacionados como neurodesenvolvimento, circuitos neuronais, informações de codificação, neurodegeneração e Epilepsias. Além disso, sua combinação com modelos emergentes de de15,de células-tronco pluripotentes induzidas humana16 pode abrir novos caminhos no desenvolvimento de terapias potenciais para doenças humanas que afetam o sistema nervoso.
Nosso laboratório está usando esta plataforma combinando microeletrodos com microfluídica (µEF) para compreender processos neuronais ao nível celular e rede e sua implicação na physio - e patológico sistema nervoso. Dado o valor de tal plataforma no campo da neurociência, o propósito do presente protocolo é demonstrar como criar uma cultura neuronal compartimentada sobre MEAs integrada ao substrato, como os neurônios de cultura nesta plataforma e como gravar com êxito, analisar e interpretar os resultados de tais experiências. Este protocolo certamente irá enriquecer a caixa de ferramentas experimental para culturas neuronal no estudo da comunicação neural.
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Protocol
Todos os procedimentos que envolvam animais foram realizados de acordo com a União Europeia (UE) Directiva 2010/63/UE (transposta para a legislação portuguesa pelo Decreto-Lei 113/2013). O protocolo experimental (0421/000/000/2017) foi aprovado pelo Comitê de ética de ambos oficial autoridade portuguesa no bem-estar dos animal e a experimentação (Direção-Geral de Alimentação e Veterinária - DGAV) e da instituição de acolhimento.
1. preparação de meios de cultura e outras soluções
Nota: Recentemente prepare as soluções de revestimento no dia de seu uso. As soluções de revestimento não utilizados e meios de cultura podem ser armazenados a-20 ° C ou 4 ° C, conforme detalhado abaixo.
- Prepare-se 10 mL de um 0.05% (v/v), solução de trabalho de Poly(ethylene imine) (PEI).
- Prepare-se 20 mL da solução-mãe de PEI 0.25% (p/v), dissolvendo PEI purificado (ver Tabela de materiais) em água estéril.
- Dilua 2 mL de solução 0,25% (p/v) PEI em 8 mL de água destilada estéril. Misture bem e use. Solução não utilizada pode ser armazenada a 4 ° C.
- Prepare-se 1 mL de uma solução de laminina 5 µ g/mL.
- Diluir 5 µ l de solução-mãe laminina 1 mg/mL em 995 µ l de meio basal (ver Tabela de materiais). Misture bem e use. Solução não utilizada pode ser armazenada congelados a-20 ° C por até 1-2 semanas.
- Prepare 1 L de solução salina tampão HEPES Hank, equilibrada (H-HBSS).
- Prepare uma solução 1 M HEPES dissolvendo 11,9 g de pó HEPES em 50 mL de água ultrapura. Ajuste o pH para 7.2.
- Prepare a solução de H-HBSS (sem cálcio e magnésio), dissolvendo 5,33 mM de cloreto de potássio, 0,44 mM fosfato de potássio monobásico, cloreto de sódio 138 mM, 0.3 mM fosfato de sódio dibásico e glicose 5,6 mM em 800 mL de água ultrapura.
- Adicione 15 mL de solução 1 M de HEPES (concentração final de 15 mM).
- Ajustar o pH a 0,2-0,3 unidades abaixo o desejado pH 7,4 usando 1 N HCl ou 1 N NaOH. Adicione água ultrapura para perfazer o volume da solução final.
Observe o pH tende a aumentar durante a filtração. - Esterilize por filtração utilizando um 0,22 µm membrana de poly(ether sulfone) (PES) de porosidade.
- Prepare-se 10 mL de H-HBSS contendo 10% inactivadas pelo calor de soro Fetal bovino (hiFBS).
- Dilua 1 mL de hiFBS em 9 mL de HBSS-H. Misture bem e use. Solução não utilizada pode ser armazenada a 4 ° C por 3-4 semanas.
- Prepare-se 5 mL de 1,5 mg/mL solução de tripsina.
- Imediatamente antes do uso, dissolva 7,5 mg de tripsina em 5 mL de HBSS-H. Esterilize por filtração usando uma membrana PES de porosidade de 0,22 µm.
- Prepare-se 50 mL de meio completado.
- Em um tubo cónico de 50 mL, misturar 48,5 mL de meio base (veja Tabela de materiais), 2% (v/v) suplemento B-27, 0.5 mM L-glutamina e 1% caneta/Strep (10.000 U/mL penicilina e estreptomicina 10.000 de µ g/mL). Complementado médio pode ser armazenado a 4 ° C por 3-4 semanas.
2. microfluídicos e preparação de dispositivos MEA
Nota: Execute etapas 2.1-2.11 no dia antes da semeadura de célula.
- Dispositivos microfluídicos limpo para remover fabricação e outros detritos usando fita de vinil. Pressione suavemente a fita contra o dispositivo para alcançar todas as áreas do dispositivo.
- Ar de plasma-limpar o MEA por 3 min (0,3 mbar) para limpar a superfície e torná-lo mais hidrofílico.
- Brevemente submergir dispositivos microfluídicos em etanol a 70% e deixe-os secar ao ar livre dentro de uma capa de fluxo laminar.
- Coloque cada MEA em uma estéril 90 mm placa de Petri e esterilizá-los por 15 min de exposição a luz ultravioleta (UV).
- Revestir a superfície central MEA incubando com 500 µ l de solução de PEI 0.05% (v/v) pelo menos 1 h a 37 ° C.
Nota: Conforme descrito por outros17, revestimento PEI de MEAs resulta em menor célula de cluster que o uso de revestimento poly(lysine). - Aspirar a solução de revestimento PEI da superfície MEA e lavar MEAs 4 x 1ml de estéril de água destilada. Tenha cuidado para não tocar na superfície MEA durante etapas de lavagem, pois isso pode danificar os eletrodos.
- Guiado por um estereomicroscópio dentro de uma capa de fluxo laminar, centralize o chip MEA e adicionar 1 mL de água estéril para a área central de MEA.
- Coloque o dispositivo microfluidic em cima da superfície MEA.
- Alinhe cuidadosamente a microgrooves de dispositivo microfluidic com a grade de microeletrodos do MEA.
- Quando corretamente alinhados, Aspire cuidadosamente o excesso de água sem tocar o MEA ou o dispositivo microfluidic.
- Incube a µEFs durante a noite a 37 ° C, para secar e permitir a ligação completa. Para facilitar a ligação, pressione suavemente o dispositivo microfluidic contra o MEA.
Nota: Execute a etapa 2.12 no dia da semeadura de célula. - Uma vez que as µEFs tenham secado completamente, carregar os poços microfluidic com 150 µ l de 5 µ g/mL de solução de revestimento de laminina e incubar a 37 ° C, durante pelo menos 2 h antes da semeadura de célula.
Nota: Ao carregar µEF com solução de laminina, certifique-se de que a solução preenche o microgrooves. Use um aspirador para remover qualquer bolha de ar que pode estar presente dentro do microgrooves.
3. pré-frontal córtex dissecação
- Prepare a área de dissecação para a remoção do embrião.
- Desinfecte a superfície de trabalho e os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70%.
Nota: Embora este dissecação não é um procedimento estéril, desinfecção ajuda a reduzir as chances de contaminação. - Use uma fralda limpa descartável para limitar a área de dissecação e esquematizar os instrumentos cirúrgicos para a remoção do embrião.
- Preparar 4 pratos de Petri de 90 milímetros preenchido com H-HBSS frio e coloque-os em uma bandeja com gelo perto da área de dissecação.
- Desinfecte a superfície de trabalho e os instrumentos cirúrgicos com etanol a 70%.
- Eutanásia em um rato Wistar tempo-grávida de E-18 por inalação de dióxido de carbono (CO2).
- Após a conclusão do procedimento, retire o animal da câmara de CO2 e confirmar a morte por um método secundário de eutanásia, tais como perda de sangue.
- Coloque o lado ventral animal a fralda descartável, pulverizar a parte inferior do abdome com 70% de etanol e, com a ajuda de pinças e tesoura, fazer uma U-forma cortar através da pele para expor o útero.
- Cuidadosamente Retire os embriões no útero cortando qualquer tecido conjuntivo e colocá-los em um dos pratos Petri com H-HBSS frio.
- Retire seu saco embrionário cada embrião e, com a ajuda de pinças e tesoura, decapitar o embrião.
- A cabeça de embryo´s de transferência para uma segunda placa de Petri cheia de frio H-HBSS.
- Repita as etapas 3.6-3.7 para cada embrião.
- Disse o córtex pré-frontal.
- Transferi uma cabeça de embryo´s para um terceiro prato de Petri.
- Use um par de pinças para expor o cérebro.
- Remover o cérebro de sua cavidade e cubra-o com H-HBSS frio.
- Se estiver presente, remova e descarte os bulbos olfatórios. Dissecar o córtex pré-frontal e remover as meninges.
- Transferi os fragmentos do córtex pré-frontal para uma quarta placa de Petri preenchida com H-HBSS frio.
- Repita as etapas 3.9.1 - 3.9.5 para cada embrião.
4. cortical neurônios dissociação e cultura em µEF
Nota: Os procedimentos a seguir foram realizados dentro de uma capa de fluxo laminar, após 15 min de um ciclo de esterilização UV. Trabalho área de superfície, bem como todos os materiais colocados dentro do capô deve ser previamente desinfectado com etanol a 70%.
- Conforme descrito na etapa 1.5, dissolver a tripsina previamente ponderada em 5 mL de H-HBSS e filtrar a solução.
- Recolha os pedaços de córtex previamente dissecados em um total de 5 mL de HBSS-H. Transferi-los para um tubo cônico estéril 15 mL.
- Adicione 2,3 mL de solução de tripsina acabadas de 1,5 mg/mL para o tubo contendo fragmentos do córtex.
- A suspensão de misturar e incubar a 37 ° C por 15 min (brevemente agitar cada 5 min).
- Parar a digestão do tecido e desbotar tripsina.
- Desprezar o sobrenadante contendo a tripsina. Adicionar 5 mL de H-HBSS contendo 10% hiFBS para inactivar a tripsina restante; Agite suavemente.
- Deixe fragmentos do córtex sossegar e em seguida, descartar o sobrenadante.
- Adicione 5 mL de HBSS-H para remover os resíduos de hiFBS. Deixe fragmentos do córtex assentar e descartar o sobrenadante.
- Lave novamente os fragmentos do córtex com 5 mL de HBSS-H.
- Deixe fragmentos do córtex assentar e descartar o sobrenadante. Adicione 5 mL de meio neuronal completado.
- Mecanicamente, dissociar fragmentos do córtex de uma pipeta sorológica 5ml pipetando lentamente subindo e descendo para 10 - 15 vezes. Se necessário, repita o procedimento utilizando uma pipeta de pequeno calibre, até a suspensão de célula se torne homogênea.
- Descarte os tecidos restantes indissociados filtrando a calha de suspensão celular um coador de célula 40 µm.
- Contar as células viáveis e determinar a densidade de células.
- Em um microtubo, adicione 20 µ l de 0,4% (p/v) Trypan azul a uma suspensão de célula 20 µ l. Misturar bem a homogenate a solução e transferir 10 µ l para uma contagem câmara de Neubauer.
- Contar as células viáveis e determinar a densidade de células de células viáveis.
- Ajustar a densidade da célula para 3,6 x 107 células/mL (se necessário, centrifugar a suspensão de células).
- Imediatamente antes da semeadura de célula, remova laminina revestimento de todos os poços do µEF. Pipete 50 µ l de meio completado a cada poço do compartimento µEF axonal.
- Sementes de 5 µ l de suspensão de células no compartimento somal µEF. Incube a 37 ° C, durante 1 h, para permitir a fixação de células para o substrato.
- Com cuidado, encha cada um bem de µEF com aquecido médio complementado. Transferi o µEF para uma incubadora de humidificador a 37 ° C, fornecido com 5% de CO2.
Nota: Para evitar a evaporação rápida de meio de cultura, coloque um microtubo aberto cheio de água dentro do prato de Petri carregando o µEF. - Manter as culturas durante o período necessário, substituindo 50% do meio de cultura todos os dias de segunda para terceira da cultura.
Nota: Após os experimentos, a microfluídica pode ser separada da MEAs imergindo o µEF na água durante a noite. Se necessário, descasque delicadamente a microfluídica com a ajuda de pinças. Como pode ser limpo por incubação durante a noite com um detergente enzimático comercial de 1% (v/v) (ver Tabela de materiais).
5. gravação espontânea atividade Neuronal
Nota: Culturas de neurônios corticais embrionárias para mimcomo normalmente apresentam atividade espontânea, assim como 7 dias in vitro (DIV), mas dê estável de 2-3 semanas (14-21 DIV) para amadurecer e exibem atividade. Cabe o experimentador para decidir quando começar as medições eletrofisiológicas baseadas os objectivos do estudo. Neste protocolo, a gravação da atividade neuronal de µEF é demonstrada por meio de um sistema de gravação comercial (ver Tabela de materiais para obter detalhes de hardware), com um módulo de aquecimento incorporado. Para a realização de gravações, usamos um software livremente disponível (ver Tabela de materiais para detalhes do software).
- Ligar o MEA gravação sistema e controlador de temperatura e permitir a placa de base aquecida do pré-amplificador para chegar a 37 ° C.
Nota: para gravações de longa duração (> 30 min de cada vez) um também deve ter um sistema que mantém uma atmosfera de CO2 . - Coloque o µEF sobre o pré-amplificador (headstage).
Nota: Certifique-se que o chip MEA está corretamente alinhado com o número de referência na superior da borda. O chip MEA que usamos é simétrico e rotacionalmente, mas este alinhamento coincide com a orientação correta do layout pin dos eletrodos e o ID de hardware. - Fechar e travar a tampa do pré-amplificador.
- Para gravar, abra o software de gravação e definir os parâmetros de gravação e o caminho dos fluxos dados gravados (consulte o manual do software para obter detalhes sobre como configurar um esquema de gravação).
Nota: Uma aquisição com uma taxa de amostragem de 20 kHz é geralmente suficiente para a maioria dos aplicativos. Uma maior frequência de amostragem é aconselhável se mais precisão é necessário em horários de pico. Se se pretende apenas picos de registro, defina um filtro high-pass a 300 Hz, que irá atenuar os componentes de frequência mais baixos do sinal. Se dados brutos e filtrados são registrados simultaneamente, isto irá aumentar significativamente o tamanho do arquivo de dados. É sempre possível fazer filtragem off-line dos dados brutos. Para reduzir dados um tamanho de arquivo também pode limitar microeletrodos, da qual a record (por exemplo, a único microeletrodos dentro microgrooves). - Clique em Iniciar DAQ para iniciar a aquisição de dados. Verifique se o display mostra traços de execução de atividade e iniciar a gravação.
Nota: O nível de ruído é geralmente ligeiramente maior nos microeletrodos correspondente a microgrooves. Se o nível de ruído é muito alto (amplitude pico-a-pico > 50 µV) ou instável em várias microeletrodos, poderia ser devido a sujeira impedindo um bom contacto pin-pad. Este problema é geralmente resolvido limpando suavemente as almofadas de contato MEA e os pinos de pré-amplificador usando um cotonete umedecido com álcool 70%. - Abra o arquivo gravado no software análise (consulte a Tabela de materiais) para explorar rapidamente os dados.
6. análise de dados
Nota: As etapas a seguir mostram como usar o software µSpikeHunter, uma ferramenta computacional desenvolvida no laboratório de Aguiar (disponível mediante pedido de e-mail para pauloaguiar@ineb.up.pt), para analisar os dados registrados com µEF. Uma interface gráfica do usuário (Figura 2) é usado para carregar os dados, identificar a propagação de ondas de pico, determinar sua direção (anterógrada ou retrógrada) e estimar a velocidade de propagação. µSpikeHunter é compatível com arquivos HDF5 gerados a partir de gravações obtidas usando sistemas de família MEA2100, que podem ser usados em conjunto com 60 - 120- e 256-eletrodo MEAs. As gravações obtidas usando o experimentador de canal múltiplos podem ser facilmente convertidas para arquivos HDF5 usando software livremente disponíveis (ver Tabela de materiais).
- Clique em Browse para selecionar o arquivo de gravação. Em seguida, clique no botão de informações de arquivo para listar a taxa de amostragem, a duração da gravação, bem como uma lista dos fluxos dados gravados (por exemplo, os dados brutos, dados filtrados).
Nota: Para estimativas de velocidade de propagação de verdade, é recomendável selecionar o fluxo de dados brutos para análise. - Selecione microeletrodos (única linha ou coluna associada com disco) para análise e defina o valor de limite de deteção do espigão (fase positiva ou negativa) em 6 vezes o desvio padrão (SD) do ruído do sinal. Clique em Ler dados para aplicar o detector de evento e obter as sequências de propagação identificados.
Nota: Se os critérios forem atendidos, uma lista de sequências de propagação detectado preencherá o painel de análise. O usuário pode então Visualizar e interagir com várias ferramentas de análise para a sequência de propagação, incluindo traços de tensão, correlações cruzadas inter microeletrodas, velocidades de propagação da sequência de single, um kymograph e uma ferramenta de reprodução de áudio. Embora a estimativa de velocidade de propagação pode ser obtida para qualquer par de microeletrodos ou como a média das estimativas para todos os pares, esta estimativa é mais confiável se o par mais distante é selecionado. - Repita a etapa anterior para os conjuntos de microeletrodos de interesse. Cada vez clique em Salvar todos os eventos para salvar o tempo e a amplitude de espinhos (em cada um dos microeletrodos) para todas as sequências de propagação identificados para um arquivo CSV.
- Importe os arquivos CSV para ambientes de análise de dados para posterior análise dos padrões de actividade da cultura (por exemplo, disparar taxa, intervalos de pico inter).
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Representative Results
Usando o protocolo descrito aqui, rato de E-18 de neurônios cortical semeado na µEF é capaz de desenvolver e manter-se saudável nestas condições de cultura para mais de um mês. Logo que 3 a 5 dias na cultura, os neurônios corticais crescem seus axônios através de microgrooves em direção ao compartimento axonal de µEF (Figura 1). Após 15 dias em cultura, esperam-se que apresentam níveis estáveis de atividade corticais neurônios cultivados na µEF e propagação dos potenciais de ação ao longo do microgrooves é esperada. Culturas mais velhas (> 14 DIV) tendem a ser dominado por atividade como no convencional MEA gravações18,19a rebentar.
Gravações e análise de dados
Análise de dados brutos com µSpikeHunter (Figura 2) permitiu a detecção e extração de propagação de ondas de pico ao longo de conjuntos de 4 microeletrodos (dentro microgrooves). A Figura 3 mostra um desses eventos. µSpikeHunter permitido para a estimativa das velocidades de propagação, baseado no Cruz-correlações entre as formas de onda de tensão de pares selecionados de microeletrodos (fornecendo um tempo de atraso) e a distância de eletrodo inter conhecida associada.
Os dados extraídos mais foi analisados usando código personalizado projetado em MATLAB. Uma parcela representativa raster da propagação spike ondas ao longo de 11 (dos 16) microgrooves é mostrado na figura 4a. A taxa de disparo instantâneo para um alto - e um disco de baixa atividade é mostrada na figura 4b.
Gravações de µEF exibem diferentes níveis de actividade por microeletrodos. Frequentemente, vários microeletrodos no compartimento somal são "silenciosos". No entanto, a maioria dos microeletrodos dentro microgrooves tendem a ser ativo (Figura 5a). É bem descrito que o microgrooves funcionam como amplificadores de sinal8. A amplitude do sinal gravado depende não só do tamanho das correntes de fonte, mas também a resistividade da mídia circundante. A resistência ao longo de um disco é particularmente elevada, que aumenta a amplitude dos sinais medidos em comparação com as dos microeletrodos no compartimento somal (Figura 5b).
Figura 1 . Neurônios corticais de rato embrionárias cultivados na µEF. (a) foto de µEF. Barra de escala: 1 cm. (b) representante imagem de neurônios corticais, cultivadas no µEF por 5 dias, mostrando vários axônios atravessando o microgrooves e atingindo o compartimento axonal (setas). Barra de escala: 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Tela de captura da interface gráfica do usuário principal µSpikeHunter. O usuário pode carregar os dados registrados com µEF, identificar a propagação de ondas de pico, determinar sua direção (anterógrada ou retrógrada) e estimar a velocidade de propagação. Uma ferramenta de kymograph permite que o usuário manualmente estimar a velocidade de propagação, com base em uma linha que o kymograph. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Onda de pico anterógrada propagação detetada por 4 microeletrodos (E8-E11) dentro de um disco. Cada traço representa um microeléctrodo cru gravação para o MS. 3 após análise com µSpikeHunter, a correlação cruzada entre os microeletrodos mais distantes (E8 e E11) permitiu o cálculo de uma velocidade de propagação de 0,52 m/s. por favor, clique aqui Ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Barragem de informações através da microgrooves. (a) representante raster plot de 2 minutos de atividade espontânea gravado ao longo de 11 microgrooves. Cada ponto representa uma onda de pico propagação (unidade) detetada por 4 microeletrodos e identificados através da análise com µSpikeHunter. Um alto - e um disco de baixa atividade são destacadas em amarelo e vermelho, respectivamente. (b) evolução da taxa de queima instantânea (como codificação de taxa) para os dois microgrooves destaque ao longo de 10 minutos. Únicas unidades de propagação foram consideradas para o cálculo da taxa de disparo. Nota a sincronização de atividade, apesar dos diferentes níveis de taxa a disparar. A taxa de disparo instantâneo foi calculada convolving os eventos de pico com um kernel Gaussian com um desvio padrão de 100 ms. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Qualidade das gravações extracelulares em µEF. (a) janela de tempo (1 segundo) de uma gravação de µEF (neurônios corticais rato em 15 dias em vitro) com uma taxa de amostragem de 20 kHz e um filtro passa-alta em 300 Hz. linhas de eletrodo correspondem a somal compartimento e linhas 8-11 para o microgrooves 1-7. (b) (picos detectados usando um método de limiar, com fase negativa apenas, fixado em 6 x desvio-padrão) caixa e whisker plot de toda a gama de amplitudes pico extraído as linhas especificadas (tempo total de gravação de 10 minutos). Amplitudes dos espinhos são significativamente maiores nos microeletrodos dentro microgrooves (linhas 8-11; 16 microgrooves), quando comparado com os microeletrodos do compartimento somal (linhas 1-7; 16 microeletrodos ativos). One-Way ANOVA, Dunn é testes de comparação múltipla, * * *p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo apresentado aqui mostra como montar um µEF, composto de um dispositivo microfluidic e um MEA com projetos padrão comercialmente disponíveis e como analisar os dados gravados.
Ao projetar um experimento, pesquisadores devem levar em conta que o modelo in vitro é limitado pela grade fixa de MEA, que restringe os arranjos do disco. O uso de um determinado microfluidic ou MEA design dependerá das necessidades específicas de experimentais, mas, em geral, as mesmas etapas do procedimento devem ser aplicadas às configurações de diferentes µEF.
Experiências de uma decisão crítica a ser feita antes de µEF assembly é se o usuário pretende reutilizar o µEF montados no futuro. Tratamento com plasma de oxigênio em ambas as superfícies pode ser feito para ligar covalentemente dispositivos microfluídicos MEAs20. No entanto, esta vedação muitas vezes faz os chips MEA inutilizável para novas experiências, como desmontar o dispositivo microfluidic irreversivelmente danifica a camada de passivação. Para contornar este problema, grupos de pesquisa tendem a reutilizar o µEF montado, apesar das possíveis desvantagens (por exemplo, os restos de experiências anteriores). Cuidadosamente, seguindo as etapas descritas no presente protocolo, de experimento para experimento, pode com segurança anexar e desanexar dispositivos microfluídicos sem danificar a MEA.
O uso de µEF permite o isolamento de um conjunto de axônios dentro do microgrooves. O tempo necessário para um razoável número de axônios para atravessar o microgrooves dependerá grandemente da célula de procedimento, ou seja a célula semeado densidade de semeadura. Usando a densidade especificada no presente protocolo, os neurônios utilizam para atravessar o disco inteiro dentro de 3 a 5 DIV.
Dependendo do ambiente de cultura (ou seja, incubadora e nível de umidade), pode ser necessário substituir a mídia a cada 2 a 3 dias de cultura. Quando renovar os meios de comunicação, remova a mídia de poços µEF, mantendo a mídia dentro dos canais principais. Em seguida, delicadamente adicione mídia nos poços µEF permitindo que flua lentamente os principais canais antes de encher os poços com volume final de mídia. Seguindo estas recomendações, somos capazes de manter essas culturas em condições saudáveis pelo menos um mês.
A principal vantagem desta plataforma é a capacidade de isolar, medir e controlar os sinais axonal. Embora a gravação do µEF é simples, a grande quantidade de dados que podem ser gerados é complicada lidar com e requer bons conhecimentos de análise de dados. O software de análise utilizado aqui, µSpikeHunter21, é um avançado ainda intuitiva ferramenta computacional, que permite a quantificação detalhada de vários relacionados com medidas (por exemplo, eventos de propagação, velocidade de propagação etc) em a poucos passos. Embora a análise dos dados não é o foco do presente protocolo, as informações aqui fornecidas já permitem a extração de dados significativos de uma gravação de µEF. No entanto, é importante notar que o isolamento confiável de um único axônio por disco continua a ser impraticável. Assim, formas de onda de pico muito complexa (devido a vários axônios passando através do disco) podem surgir e afetam os horários de pico e cálculos de velocidade de propagação. Esta limitação pode ser atenuada usando microgrooves muito estreita (abaixo de 5 µm)13 e/ou através de spike classificação técnicas21, que ajudam a distinguir fontes diferentes de sinais.
Mesmo que em vitro culturas não podem recapitular a complexidade cheia na vivo , sua combinação com µEF permite abordagens de pesquisa bem controlados de baixo para cima. Esperamos que este protocolo vai ajudar novatos e usuários MEA proficientes estabelecer modelos novos e confiáveis para o estudo eletrofisiológica comunicação em circuitos neuronais.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo FEDER - Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional fundos até 2020 o COMPETE - Programa Operacional para a competitividade e internacionalização (POCI), Portugal 2020 e pelos portugueses de fundos através da FCT - Fundação para uma Ciência e uma Tecnologia / Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior no âmbito do projecto PTDC/CTM-NAN/3146/2014 (POCI-01-0145-FEDER-016623). José C Mateus foi apoiado pela FCT (PD/BD/135491/2018). Paulo Aguiar foi apoiada pelo Programa Ciência - Programa Operacional Potencial Humano (POPH) - promoção do emprego científico, FSE e MCTES e programa Investigador FCT, POPH e Fundo Social Europeu. Os dispositivos microfluídicos foram fabricados no INESC - microsistemas e nanotecnologias, Portugal, sob a supervisão de João Pedro Conde e Virginia Chu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 Suplement (50X) | Thermo Fisher Scientific | LTI17504-044 | |
| Branched poly(ethylene imine) (PEI), 25 kDa | Sigma-Aldrich | 408727 | Purify branched PEI by dialysis using a 2.5 kDa cut-off membrane for 3 days at 4°C against a 5 mM HCl solution (renewed daily). Freeze-dry the purified PEI. |
| Cell strainer (40 µm) | Falcon | 352340 | |
| Conical microtubes (1.5 ml) | VWR | 211-0015 | |
| Disposable diaper, 60x40 cm | Bastos Viegas SA | 455-019 | |
| Forceps Dumont #5, straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Forceps Dumont #5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Forceps Dumont #7, curved | Fine Science Tools | 91197-00 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Premium | Biowest | S181BH-500ML | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm | Sigma-Aldrich | L2020-1MG | Prepare laminin stock solution at 1 mg/mL by dissolving the powder in the respective volume of non-supplemented medium. Store laminin solution at -20 °C in small aliquots (20 µL) to avoid repeated freeze/thaw cycles. |
| L-Glutamine 200mM | Thermo Fisher Scientific | LTID25030-024 | |
| Neubauer improved counting chamber (hemocytometer) | Marienfeld | 630010 | |
| Neurobasal Medium (1X) | Thermo Fisher Scientific | 21103-049 | Basal medium used for neuronal cultures |
| PDMS microfluidic devices | not applicable | not applicable | Composed of two cell seeding compartments interconnected by 20 microgrooves with 450 μm length × 10 μm height × 14 μm width dimensions and separated by 86 µm (total interspace of 100 μm). |
| Penicillin-streptomycin (P/S) solution (100X) | Biowest | L0022-100 | |
| PES syringe filter unit (Ø 30 mm), 0.22 µm | Frilabo | 1730012 | |
| Polypropylene conical tubes, 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Polypropylene conical tubes, 50 ml | Thermo Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 10 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Polystyrene disposabel serological pipets, 5 ml | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Standard Regenerated cellulose membrane (2 kDa) | Spectrum labs | 132107 | |
| Standard surgical scissor | Fine Science Tools | 91401-14 | |
| Substrate-integrated planar MEAs (256 microelectrodes) | Multi Channel Systems | 256MEA100/30iR-ITO | 252 titanium nitride (TiN) recording electrodes and 4 internal reference electrodes organized in a 16 by 16 square grid. Each recording electrode is 30 µm in diameter and interspaced by 100 µm. |
| Syringe luer-lock tip, 10 ml | Terumo Europe | 5100-X00V0 | |
| Syringe luer-lock tip, 50 ml | Terumo Europe | 8300006682 | |
| Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Enzyme-active powdered detergent used for MEAs cleaning |
| Tissue culture plates, 35 mm | StemCell Technologies | 27150 | |
| Tissue culture plates, 90 mm | Frilabo | 900095 | |
| Trypan Blue solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Trypsin (1:250) | Thermo Fisher Scientific | 27250018 | |
| Vinyl tape 471 | 3M | B40071909 |
References
- Scanziani, M., Hausser, M.
- Nam, Y., Wheeler, B. C. In vitro microelectrode array technology and neural recordings. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 39 (1), 45-61 (2011).
- Obien, M. E., Deligkaris, K., Bullmann, T., Bakkum, D. J., Frey, U. Revealing neuronal function through microelectrode array recordings. Frontiers in Neuroscience. 8, 423 (2014).
- Blau, A. Cell adhesion promotion strategies for signal transduction enhancement in microelectrode array in vitro electrophysiology: An introductory overview and critical discussion. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 18 (5), 481-492 (2013).
- Jones, I. L., et al. The potential of microelectrode arrays and microelectronics for biomedical research and diagnostics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (7), 2313-2329 (2011).
- Bakkum, D. J., et al. Tracking axonal action potential propagation on a high-density microelectrode array across hundreds of sites. Nature Communications. 4, 2181 (2013).
- Claverol-Tinture, E., Cabestany, J., Rosell, X. Multisite recording of extracellular potentials produced by microchannel-confined neurons in vitro. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 54 (2), 331-335 (2007).
- Fitzgerald, J. J., Lacour, S. P., McMahon, S. B., Fawcett, J. W.
- Dworak, B. J., Wheeler, B. C. Novel MEA platform with PDMS microtunnels enables the detection of action potential propagation from isolated axons in culture. Lab on a Chip. 9 (3), 404-410 (2009).
- Morin, F., et al. Constraining the connectivity of neuronal networks cultured on microelectrode arrays with microfluidic techniques: a step towards neuron-based functional chips. Biosensors and Bioelectronics. 21 (7), 1093-1100 (2006).
- Pan, L., et al. Large extracellular spikes recordable from axons in microtunnels. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 22 (3), 453-459 (2014).
- Lewandowska, M. K., Bakkum, D. J., Rompani, S. B., Hierlemann, A. Recording large extracellular spikes in microchannels along many axonal sites from individual neurons. PLoS One. 10 (3), e0118514 (2015).
- Narula, U., et al. Narrow microtunnel technology for the isolation and precise identification of axonal communication among distinct hippocampal subregion networks. PLoS One. 12 (5), e0176868 (2017).
- Forro, C., et al. Modular microstructure design to build neuronal networks of defined functional connectivity. Biosensors and Bioelectronics. 122, 75-87 (2018).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), (2017).
- Tukker, A. M., Wijnolts, F. M. J., de Groot, A., Westerink, R. H. S. Human iPSC-derived neuronal models for in vitro neurotoxicity assessment. Neurotoxicology. 67, 215-225 (2018).
- Hales, C. M., Rolston, J. D., Potter, S. M. How to culture, record and stimulate neuronal networks on micro-electrode arrays (MEAs). Journal of Visualized Experiments. (39), (2010).
- van Pelt, J., Wolters, P. S., Corner, M. A., Rutten, W. L., Ramakers, G. J. Long-term characterization of firing dynamics of spontaneous bursts in cultured neural networks. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 51 (11), 2051-2062 (2004).
- Wagenaar, D. A., Pine, J., Potter, S. M. An extremely rich repertoire of bursting patterns during the development of cortical cultures. BMC Neuroscience. 7, 11 (2006).
- Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxygen-plasma treatment and correlation with bond strength. Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).
- Heiney, K., et al. μSpikeHunter: An advanced computational tool for the analysis of neuronal communication and action potential propagation in microfluidic platforms. , (2018).
