Artículo de método

Escherichia coli-base libres de células síntesis de la proteína: protocolos para una tecnología de plataforma robusta, flexible y accesible

DOI:

10.3791/58882

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25 de febrero de 2019

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1Department of Biological Sciences, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology, Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program, Northwestern University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalla los pasos, costos y equipamiento necesario para generar e. coli-basado en extractos celulares e implementar en vitro reacciones de la síntesis de proteína dentro de 4 días o menos. Para aprovechar la naturaleza flexible de esta plataforma para aplicaciones generales, se discuten las condiciones de reacción que pueden ser adaptadas y optimizadas.

Resumen

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En los últimos 50 años, síntesis de proteínas libres de células (CFPA) ha emergido como una potente tecnología para aprovechar la capacidad transcripcional y traduccional de células dentro de un tubo de ensayo. Obviando la necesidad de mantener la viabilidad de la célula y eliminando la barrera celular, PFC ha sido fundamental para aplicaciones emergentes en biofabricación de proteínas tradicionalmente difíciles, así como aplicaciones de prototipado rápido para Ingeniería Metabólica y genómica funcional. Nuestros métodos para la implementación de un e. coli-basado PFC plataforma permiten a los usuarios nuevos para acceder a muchas de estas aplicaciones. Aquí, se describen métodos para preparar extracto mediante el uso de medios enriquecidos, frascos desconcertados y un método reproducible de lisis celular armonioso basado en baño de ultrasonidos. Este extracto puede utilizarse para expresión de proteínas capaces de producir 900 μg/mL o más de proteína fluorescente verde super carpeta (sfGFP) en apenas 5 h de la disposición experimental para análisis de datos, dado que las existencias de reactivos apropiados han sido preparadas de antemano. El costo estimado de inicio de obtención de reactivos es de $4.500 que se sostienen miles de reacciones a un costo estimado de $0,021 por μg de proteína producida o $0,019 por μl de reacción. Además, los métodos de expresión de la proteína reflejan la facilidad de la instalación de reacción en sistemas comercialmente disponibles debido a la optimización de reactivos Premezclados, a una fracción del costo. Con el fin de que el usuario pueda aprovechar la naturaleza flexible de la plataforma de PFC para aplicaciones generales, hemos identificado una gran variedad de aspectos de la plataforma que puede ser afinado y optimizado dependiendo de los recursos disponibles y los resultados de la expresión de la proteína deseada.

Introducción

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Síntesis de proteína sin células (PFC) ha emergido como una tecnología que ha abierto un número de nuevas oportunidades para la producción de proteínas, genómica funcional, ingeniería metabólica y más en los últimos 50 años1,2. En comparación con el estándar en vivo plataformas de expresión de la proteína, PFC proporciona tres ventajas fundamentales: 1) la naturaleza libre de la plataforma permite la producción de proteínas que serían potencialmente tóxicas o ajenas a la célula3,4 ,5,6; 2) inactivación de la DNA genomic y la introducción de una plantilla de DNA que codifican los genes de interés canalizar toda la energía sistémica dentro de la reacción a la producción de la proteína de interés; y 3) el carácter abierto de la plataforma permite al usuario modificar y supervisar las condiciones de reacción y composición en tiempo real7,8. Este acceso directo a la reacción es compatible con el aumento de los sistemas biológicos químicos ampliados y condiciones redox para la producción de nuevas proteínas y la afinación de procesos metabólicos2,9, 10. directa acceso también permite al usuario combinar la reacción de PFC con ensayos de actividad en un sistema del solo-pot para ciclos de diseño-construcción-prueba más rápida11. La capacidad para realizar la reacción de PFC en gotas de pequeño volumen o en los dispositivos basados en papel más apoya esfuerzos de descubrimiento de alto rendimiento y prototipado rápido12,13,14,15 ,16. Como resultado de estas ventajas y la naturaleza de listo del sistema, PFC únicamente ha permitido una variedad de aplicaciones de la biotecnología como la producción de proteínas que son difíciles de expresar soluble en vivo17, 18,19,20, detección de la enfermedad21,22,23, en demanda de biofabricación de18,24 ,25,26,27y educación28,29, todos los cuales muestran la flexibilidad y la utilidad de la plataforma libre de células.

Sistemas de PFC pueden ser generados desde una gran variedad de lisados crudos de ambas variedades de células procariotas y eucariotas. Esto permite diversas opciones en el sistema de elección, cada uno de los cuales tiene ventajas y desventajas dependiendo de la aplicación de interés. Sistemas de PFC también varían mucho en productividad, costo y tiempo de preparación. Los más comúnmente utilizan celular se producen extractos de germen de trigo, reticulocitos de conejo, células de los insectos y células de Escherichia coli , siendo esta última la más rentable hasta la fecha mientras que produce los mayores rendimientos volumétricos de la proteína30 . Mientras otros sistemas de PFC pueden ser ventajosos para su maquinaria de modificación poste-de translación innata, surgiendo aplicaciones utilizando e. coli-maquinaria base son capaces de cerrar la brecha mediante la generación de site-specifically fosforilada y proteínas glicosiladas en demanda31,32,33,34,35.

Reacciones de PFC se pueden ejecutar en cualquier lote, continuo intercambio sin células (CECF) o flujo continuo sin células (CFCF) formatos. El formato por lotes es un sistema cerrado cuya reacción es limitada debido a la disminución de cantidades de reactivos y la acumulación de subproductos inhibitorios de la reacción. Métodos CECF y CFCF aumentan la vida útil de la reacción y así dar lugar a rendimientos volumétricos creciente de la proteína en comparación con la reacción de lote. Esto se logra permitiendo que los subproductos de la síntesis de la proteína debe sacar el recipiente de la reacción mientras que nuevos reactivos se suministran en el transcurso de la reacción2. En el caso de CFCF, la proteína de interés también puede removerse de la cámara de reacción, mientras que en la CECF, la proteína de interés permanece en la cámara de reacción compuesta por una membrana semipermeable36,37. Estos métodos son especialmente valiosos para superar los bajos rendimientos volumétricos de difícil-a-expresan proteínas de interés38,39,40,41,42, 43. Los desafíos en la implementación de los enfoques CECF y CFCF son 1) mientras que resultan en un uso más eficiente de la maquinaria de la bio responsable de la transcripción y traducción, que requieren en particular grandes cantidades de reactivos que aumenta el costo general y 2) requieren más complejas configuraciones de reacción y equipo especializado en comparación con el formato de lote44. Con el fin de garantizar la accesibilidad para los nuevos usuarios, los protocolos describen foco en el formato por lotes en volúmenes de reacción de 15 μl con recomendaciones específicas para aumentar el volumen de reacción a la escala de mililitro.

Los métodos presentados en este documento permiten no expertos con habilidades básicas de laboratorio (como estudiantes) para implementar el crecimiento celular, preparación del extracto y formato reacción configuración de lote para una e. coli-basado sistema de PFC. Este enfoque es rentable en comparación con los kits disponibles en el mercado sin sacrificar la facilidad de la instalación de reacción basado en el kit. Además, este enfoque permite a las aplicaciones en el laboratorio y en el campo. Cuando se decide implementar PFC, nuevos usuarios completamente deben evaluar la eficacia de los sistemas de expresión de la proteína convencional para la inversión de arranque, como PFC no puede ser superior en todos los casos. Los métodos de PFC aquí descritos permiten al usuario aplicar directamente una variedad de aplicaciones, incluyendo la genómica funcional, la producción de proteínas que son insuperables para expresión en vivo , así como campo de prueba de alto rendimiento aplicaciones como biosensores y kits educativos para la biología sintética. Aplicaciones adicionales tales como la ingeniería metabólica, de las condiciones de expresión de la proteína, detección de enfermedades y escalado utilizando métodos CECF o CFCF siguen siendo posibles pero pueden requerir experiencia con la plataforma de PFC más modificación de la reacción condiciones. Nuestros métodos de combinan crecimiento en medios enriquecidos y el desconcertado, con métodos relativamente rápidos y reproducibles de lisis celular mediante sonicación, seguido por una configuración simplificada de reacción de PFC que utiliza mezclas optimizadas45. Mientras que los métodos de crecimiento celular han convertido en algo estandarizados dentro de este campo, métodos de lisis celular varían ampliamente. Además de sonicación, métodos de lisis comunes incluyen la utilización de una prensa francesa, un homogeneizador, batidores de grano, o lisozima y otras perturbaciones bioquímicas y físicas métodos46,47,48, 49. nuestros métodos, se obtienen aproximadamente 2 mL de extracto crudo de la célula por 1 L de las células. Esta cantidad de extracto celular puede soportar 400 15 μl PFC reacciones, cada producción ~ 900 μg/mL de proteína de sfGFP de reportero de la plantilla de plásmido pJL1-sfGFP. Este método cuesta $ 0,021/μg de sfGFP producido ($.019/μl de reacción), excluyendo el costo de mano de obra y equipo (suplementario Figura 1). A partir de cero, este método puede aplicarse en 4 días por una sola persona y repetir reacciones PFC pueden completarse dentro de las horas (figura 1). Además, el protocolo puede ser aumentado en volumen para lotes más grandes de preparación de los reactivos para satisfacer las necesidades del usuario. Lo importante es el protocolo que presentamos se puede implementar laboratorio entrenado no expertos como estudiantes, ya que sólo requiere conocimientos básicos de laboratorio. Los procedimientos descritos a continuación y el video que lo acompaña han sido desarrollados específicamente para mejorar la accesibilidad de la plataforma de PFC de e. coli de amplio uso.

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Protocolo

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1. los medios preparación y crecimiento de la célula

  1. Día 1
    1. Las células de e. coli BL21*(DE3) racha de un glicerol acción sobre una placa de agar LB e incuban durante al menos 18 h a 37 ° C.
    2. Preparar 50 mL de medio LB y autoclave la solución en un ciclo líquido durante 30 min a 121 ° C. Almacenar a temperatura ambiente.
  2. Día 2
    1. Preparar 750 mL de 2 medios de x YTP y 250 mL de solución 0,4 de M D-glucosa como se describe en la información complementaria.
    2. Verter los 2 medios de x YTP en un autoclave frasco desconcertado de 2,5 L y la solución de D-glucosa en una botella de vidrio de 500 mL esterilizado. Autoclave de ambas soluciones en un ciclo líquido durante 30 min a 121 ° C.
    3. Asegúrese de que ambas soluciones estériles se almacenan a 37 ° C, si el crecimiento celular se realiza en el día siguiente, para maximizar las tasas de crecimiento a la inoculación. No combine soluciones hasta la inoculación.
      Nota: Las soluciones pueden almacenarse a 4 ° C durante 1-2 d si es necesario, aunque los medios de x YTP 2 es propenso a la contaminación.
    4. Iniciar una cultura de la noche de BL21(DE3) al inocular 50 mL de medio LB con una sola Colonia de BL21(DE3) utilizando un bucle esterilizada y técnica estéril para evitar la contaminación.
    5. Coloque 50 mL de la cultura BL21*(DE3) LB a 37 ° C 250 rpm de agitación incubadora y crecer durante la noche para 15-18 h.
    6. Preparar y esterilizar todos los materiales necesarios para los días 3 y 4, incluyendo: dos botellas de centrífuga de 1 L, 4 x 50 mL frío tubos cónicos (pesaje y registro masas de tres) y muchos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
  3. Día 3
    1. Extraiga la cultura noche de 50 mL de BL21*(DE3) en LB de la incubadora agitación y mida OD600 en un espectrofotómetro usando un 1:10 dilución con los medios LB. Calcular el volumen de la cultura durante la noche es necesario añadir a 1 L de media para una partida de OD600 de 0.1 (por ejemplo, si un OD600 de un 1:10 dilución se lee como 0.4, inocular 25 mL del OD sin diluir600 = 4.0 cultura durante la noche en 1 L de 2 x YTP G).
    2. Retire el calentado 2 x YTP los medios de comunicación y soluciones de D-glucosa de la incubadora de 37 ° C junto con los 50 mL de LB cultura. Utilizando una técnica estéril, vierta cuidadosamente la solución de D-glucosa en el medio de x YTP 2 (evitando las partes de la mufla desconcertada).
      Nota: Además de D-glucosa completa la receta para 1 L de 2 x YTPG.
    3. Mantener una técnica estéril, inocular el 1 L de solución de x YTPG 2 con la cantidad apropiada de la cultura de 50 mL para empezar la cultura de 1 L en un 0.1 OD600. Inmediatamente Coloque el cultivo inoculados de 1 L a 37 ° C Incubadora de agitación a 200 rpm.
    4. Tomar el primer OD600 lectura después de la primera hora de crecimiento (fase lag típico dura 1 h). No diluir la cultura. Continúe tomando OD600 mediciones aproximadamente cada 20-30 min hasta OD600 0.6.
    5. Al llegar a OD600 = 0.6, añadir 1 mL de 1 M IPTG (concentración final en la cultura L 1 = 1 mM) a la cultura de x YTPG 2.
      Nota: Inducción Ideal OD600 es 0,6; sin embargo, es aceptable un rango de 0.6-0.8. Inducción por IPTG es de producción endógena de la T7 ARN polimerasa (T7RNAP).
    6. Después de la inducción, medir el OD600 aproximadamente cada 20-30 min hasta llegar a 3.0.
      Nota: Enfriar el centrifugar a 4 ° C durante este tiempo. Preparar el tampón frío de S30 como se detalla en la información complementaria. Si el búfer de S30 es preparado por adelantado, asegúrese de que la TDT no se agrega hasta el día de uso.
    7. Una vez que el OD600 alcanza 3.0 (figura 2A), vierta la cultura en una fría botella de centrífuga de 1 L en un baño de agua helada. Preparar una botella de centrífuga 1 L lleno de agua de igual peso para ser utilizado como un equilibrio en la centrifugadora.
      Nota: Los valores de extinción varían de instrumento a instrumento. Mientras que la OD600 de cosecha de BL21(DE3) no es una variable sensible, se recomienda que el usuario evaluar y optimizar esta variable como medida de solución de problemas. Espectrofotómetros más grandes pueden producir relativamente más bajos OD600 lecturas en comparación con los espectrofotómetros más pequeños basados en la cubeta.
    8. Centrifugue las botellas de 1 L por 10 min a 5.000 x g y 10 ° C para que sedimenten las células.
    9. Lentamente Vierta el sobrenadante y deséchelo según procedimientos residuos biológicos de la institución. Coloque el balín en el hielo.
    10. Con una espátula estéril, raspar el precipitado de células de la botella de centrífuga y transferirlo a un tubo cónico de 50 mL frío.
    11. Añadir 30 mL del tampón frío de la S30 con el tubo cónico y resuspender el precipitado de células con un vórtex con ráfagas cortas (20-30 s) y períodos de descanso (1 min) en el hielo hasta que completamente se resuspendió con no trozos.
    12. Una vez que el pellet se resuspendió completamente, utilizar otro tubo cónico de 50 mL con agua como un equilibrio y centrifugar durante 10 min a 5000 x g y 10 ° C (previamente enfriado a 4 ° C).
      Nota: Esto completa la 1st de 3 lavados requerido cuando la recolección de las células.
    13. Vierta el sobrenadante y deséchelo según procedimientos residuos biológicos de la institución. Resuspender el precipitado con 20-25 mL de frío S30 tampón y centrifugar durante 10 minutos a 5000 x g y 10 ° C (previamente enfriado a 4 ° C).
      Nota: Esto completa la 2nd de 3 lavados.
    14. De nuevo, vierta el sobrenadante y deséchelo según procedimientos residuos biológicos de la institución. Añadir exactamente 30 mL de tampón de S30 y de vortex para Resuspender el precipitado.
    15. Utilizando los 3 tubos cónicos de 50 mL previamente pesado, frío y un llenador de la pipeta serológica con una pipeta estéril, alícuota 10 mL de sedimento resuspendido/S30 buffer mezcla en cada uno de los 3 tubos cónicos.
      Nota: Dividir las células en 3 tubos no es necesario, pero este paso produce pellets celulares más pequeños (~ 1 g) para mayor comodidad en pasos posteriores.
    16. Centrifugue todos los tubos, utilizando Balanzas apropiadas según sea necesario, durante 10 minutos a 5000 x g y 10 ° C (previamente enfriado a 4 ° C).
      Nota: En esta forma concluye la etapa de lavado final.
    17. Vierta el sobrenadante y deséchelo según procedimientos residuos biológicos de la institución. Quitar el exceso de tampón S30 limpiando cuidadosamente el interior del tubo cónico y tapa con un paño limpio; Evite tocar el sedimento.
    18. Repesar los tubos con una balanza analítica y registre el peso del pellet final en cada tubo.
      Nota: El protocolo puede ser una pausa en este punto. Los pellets pueden ser flashes congelado en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C por hasta un año hasta que se necesite para la preparación del extracto.

2. preparación de extracto celular crudo - día 4

  1. Para la preparación del extracto, mantener las células frías sobre hielo durante cada paso. Añadir 1 mL de tampón de S30 frío por 1 g de masa de la célula de la pelotilla. Asegúrese de que dithiothreitol (DTT) se ha complementado en el búfer de S30 a una concentración final de 2 mM.
    Nota: Enfriar la microcentrífuga a 4 ° C durante este tiempo.
  2. Resuspender el precipitado de células con un vórtex con ráfagas cortas (20-30 s) y períodos de descanso (1 min) en el hielo hasta que completamente suspendidas. Si la resuspensión es difícil, deje las pastillas en hielo durante 30 minutos descongelar.
  3. Transferir 1,4 mL de células resuspendidas a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  4. Coloque un tubo de 1,5 mL que contiene 1,4 mL de células resuspendidas en un baño de agua helada en un vaso de precipitados. Someter a ultrasonidos para 45 s en seguida 59 s apagado para los 3 ciclos total, con una amplitud fija en 50%. Cerrar e invertir los tubos suavemente la mezcla durante los periodos de inactividad. En total, entregar 900 800 J de energía a cada tubo de microcentrífuga de 1,5 mL que contenga 1,4 mL de células resuspendidas (Figura 3A y 3B).
    Nota: Este paso es sensible al tipo de sonicador y modelo utilizado y debe ser optimizado si el equipo es diferente al que aparece para este procedimiento. Dos enfoques complementarios se pueden utilizar para ampliar la cantidad de extracto preparado durante este paso: tubos de microcentrífuga de 1.5 mL 1) múltiples pueden ser sonicados en paralelo, o 2) mayores volúmenes pueden ser sonicados en tubos cónicos (hasta 15 mL de resuspensión de células por el tubo) , ampliar la cantidad de energía entregada como describió anteriormente 29,45.
  5. Inmediatamente después de sonicación es completa, agregar 4.5 μl de TDT (que complementa un TDT adicional de 2 mM) de 1 M en el 1,4 mL de lisado e invertir varias veces para mezclar. Coloque el tubo en hielo. Repita los pasos del 2.4 y 2.5 para cualquier tubo adicional de células resuspendidas antes de proceder a centrifugación.
  6. Muestras de microcentrífuga en 18.000 x g y 4 ° C durante 10 minutos (figura 3).
  7. Pipetear el sobrenadante en un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL. No molestar el sedimento; es preferible dejar algunos sobrenadante para mantener la pureza de to interrumpir el sedimento en los esfuerzos para maximizar el rendimiento.
  8. Incubar el sobrenadante del paso anterior en 250 rpm y 37 ° C durante 60 min con cinta adhesiva los tubos a la plataforma de agitación de la incubadora (ésta es la reacción de escurrimiento).
  9. Muestras de microcentrífuga a 10.000 x g y 4 ° C durante 10 minutos.
  10. Quite el sobrenadante sin perturbar el pellet y transferirlo a un tubo nuevo. Crear muchas partes alícuotas de 100 μl del extracto para el almacenamiento de.
    Nota: El protocolo puede ser una pausa aquí, y el extracto puede ser flash congelado en nitrógeno líquido y almacenados a-80 ° C por hasta un año hasta que se necesite para las reacciones de PFC. Al menos 5 ciclos de congelación y descongelación pueden experimentados sin detrimento para extraer productividad (figura 4).

3. sin células proteína síntesis lote formato reacciones

  1. Descongelar las soluciones A y B, DNA plantilla, BL21(DE3) extracto (si es congelado), T7RNAP y una alícuota de agua grado molecular.
    Nota: La plantilla de reacción PFC puede encontrarse en la Información complementaria. Recetas de soluciones A y B se encuentran en la Información complementaria y corresponden a concentraciones específicas para numerosos reactivos apoyar el sistema de energía basado PANOx-SP para PFC. El papel de cada reactivo y la variación aceptable en estas concentraciones de reactivo que puede apoyar PFC han sido determinado50. Un protocolo de purificación de T7RNAP se puede encontrar en la información suplementaria de51. T7RNAP suplementario puede aumentar el rendimiento volumétrico, pero no es necesario si T7RNAP es inducida durante el crecimiento de la célula. Plantilla de la DNA del plásmido (pJL1-sfGFP) puede ser preparado con un kit de maxiprep de dos lavados con el tampón de lavado en el kit, seguido de una tratamiento posterior limpieza de ADN usando un kit de potabilización de PCR (figura 2B). Plantillas de la DNA lineares pueden utilizarse también en reacciones de PFC.
  2. La etiqueta la cantidad necesaria de tubos del microfuge necesarios para reacciones de PFC.
    Nota: Las reacciones se pueden realizar en varios tamaños de vasos, pero un vaso más pequeño puede disminuir los rendimientos volumétricos de la proteína (figura 2). Escalado de una reacción en el mismo recipiente de tamaño también puede reducir los rendimientos volumétricos, en función de disminuir el intercambio de oxígeno, debido a una disminución en el área superficial al cociente del volumen. Al aumentar el volumen por encima de 100 μL de la reacción, se recomienda utilizar placas de pozos de fondo plano 31,37,52.
  3. Añadir 2,2 μl de la solución A, 2.1 μl de la solución B, 5 μl de BL21*(DE3) extracto, 0.24 μg de T7RNAP (16 μg/mL concentración final), 0,24 ng de DNA plantilla (concentración final de 16 ng/mL) y agua para hacer el volumen final de 15 μl.
    Nota: Vórtice soluciones A y B con frecuencia durante la instalación de reacción para evitar la sedimentación de los componentes y asegurarse de que cada reacción recibe una parte alícuota de cada solución una homogénea. Evitar Vortex el extracto, en lugar de ello invertir el tubo para mezclar.
  4. Después de todos los reactivos se han agregado a la reacción, mezclar cada tubo pipetear arriba y abajo o suavemente Vortex asegurándose que la mezcla de reacción final se combina en una sola tira de 15 μl en la parte inferior del tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  5. Coloque cada reacción en la incubadora de 37 ° C sin agitación durante 4 horas, o 30 ° C durante la noche.
    Nota: Reacciones exitosas pueden ser cualitativamente evaluadas visualmente basado en el color verde del producto sfGFP dentro de la mezcla de reacción de PFC (figura 3D). Expresión de la proteína de interés se puede confirmar también por SDS-PAGE (suplementario Figura 2).

4. cuantificación de la proteína reportera, [sfGFP]

  1. Carga 48 μl de 0,05 M HEPES, pH 8, en cada bien es necesario para la cuantificación (generalmente realizada por triplicado por el tubo de reacción).
  2. Retire las reacciones de la incubadora. Pipeta hacia arriba y hacia abajo para cada reacción de la mezcla, luego transferir 2 μl de la reacción a las 48 μl de 0,05 M HEPES, pH 8. Pipeta hacia arriba y hacia abajo otra vez en el pozo para mezclar.
  3. Una vez que todas las reacciones son cargadas y mezcladas, coloque la placa de la pozo 96 en el fluorómetro y medir la fluorescencia de extremo de sfGFP.
    Nota: Longitudes de onda de excitación y emisión para la cuantificación de la fluorescencia de sfGFP son 485 nm y 510 nm, respectivamente.
  4. Usando una curva estándar previamente generada, determinar [sfGFP] de las lecturas obtenidas de la fluorescencia.
    Nota: Instrucciones para generar una curva estándar de concentración de sfGFP versus intensidad de fluorescencia se encuentran en información adicional (suplementario Figura 3). Los usuarios tendrán que establecer una curva estándar para su instrumento, ya que puede variar la sensibilidad del instrumento.

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Resultados

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Hemos presentado una sonicación basado en e. coli extracto protocolo de preparación que puede completarse en un lapso de cuatro días, con la figura 1 demuestra la ruptura procesal más cada día. Hay maleabilidad a los pasos que se pueden realizar en cada día con varios puntos de pausa, pero hemos encontrado este flujo de trabajo para ser el más eficaz ejecutar. Además, los gránulos de la célula (paso 1.3.18) y extracto completamente preparado (paso 2....

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Discusión

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Síntesis de proteínas libres de células se ha convertido en una tecnología potente y propicia para una gran variedad de aplicaciones que van desde comercializa para prototipado rápido de sistemas bioquímicos. La amplitud de aplicaciones es compatible con la capacidad para controlar, manipular y aumentar la maquinaria celular en tiempo real. A pesar del creciente impacto de esta tecnología de plataforma, adaptación amplia ha sido lento debido a matices técnicos en la aplicación de los métodos. A través de este esfuerzo, n...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que tienen ninguna competencia intereses financieros u otros conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autores desean reconocer la Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher y Tony Turretto para soporte técnico, Wesley Kao, Layne Williams y Christopher Hight para discusiones útiles. Autores también reconocen apoyo de la Bill y Linda helada fondo, centro para aplicaciones en biotecnología Chevron Biotecnología aplicada investigación dotación beca investigación de Cal Poly, estudiante y programa de actividades creativas (RSCA 2017), la financiación y la National Science Foundation (NSF-1708919). MZL reconoce la subvención graduado del Universidad del estado de California. MCJ reconoce el ejército investigación oficina W911NF-16-1-0372, National Science Foundation otorga MCB-1413563 y MCB-1716766, la fuerza aérea de investigación laboratorio de centro de excelencia Grant FA8650-15-2-5518, la concesión de la Agencia de defensa amenaza reducción HDTRA1-15-10052/P00001, el David y Lucile Packard Foundation, el programa del erudito profesor Camille Dreyfus, el Departamento de energía BER Grant DE-SC0018249, el programa científico de fronteras humanas (RGP0015/2017), la concesión ETOP DOE Instituto genoma, y el consorcio biomédico de Chicago con el apoyo de los fondos de Searle en Chicago Community Trust para apoyo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Caldo LuriaThermoFisher12795027
TriptonaBiorreactivos Fisher73049-73-7
Extracto de LevaduraFisher Biorreactivos1/2/8013
NaClSigma-AldrichS3014-1KG
Fosfato de Potasio DibásicoSigma-Aldrich60353-250G
Fosfato de Potasio MonobásicoSigma-AldrichP9791-500G
D-GlucosaSigma-AldrichG8270-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
DTTThermoFisher15508013
ARNtSigma-Aldrich10109541001
Ácido folínicoSigma-AldrichF7878-100MG
NTPsThermoFisherR0481
Ácido oxálicoSigma-AldrichP0963-100G
NADSigma-AldrichN8535-15VL
CoASigma-AldrichC3144-25MG
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
NH4(Glu)MP Biomedicals02180595.1
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
EspermidinaSigma-AldrichS0266-5G
PutrescinaSigma-AldrichD13208-25G
HEPESThermoFisher11344041
Agua de Grado MolecularSigma-Aldrich7732-18-5
Ácido L-AspárticoSigma-AldrichA7219-100G
L-ValinaSigma-AldrichV0500-25G
L-TriptófanoSigma-AldrichT0254-25G
L-fenilalaninaSigma-AldrichP2126-100G
L-isoleucinaSigma-AldrichI2752-25G
L-LeucinaSigma-AldrichL8000-25G
L-cisteínaSigma-AldrichC7352-25G
L-metioninaSigma-AldrichM9625-25G
L-AlaninaSigma-AldrichA7627-100G
L-ArgininaSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparaginaSigma-AldrichA0884-25G
GlicinaSigma-AldrichG7126-100G
L-GlutaminaSigma-AldrichG3126-250G
L-HistadinaSigma-AldrichH8000-25G
L-LisinaSigma-AldrichL5501-25G
L-ProlinaSigma-AldrichP0380-100G
L-SerinaSigma-AldrichS4500-100G
L-TreoninaSigma-AldrichT8625-25G
L-TirosinaSigma-AldrichT3754-100G
Fisherbrand Premium Tubos de microcentrífuga: 2,0 mLFisher Scientific05-408-138
Tubos de microcentrífuga Fisherbrand Premium: 1,5 mLFisher Scientific05-408-129
Tubos de microcentrífuga Fisherbrand Premium: 0,6 mLFisher Scientific05-408-120
Kit de preparación de plásmidos PureLink HiPure
Sonda QSonicaQ125-230V/50Hzde 3.175 mm de diámetro
Centrífuga Avanti J-ERotor Beckman Coulter369001
JLA-8.1000 BeckmanCoulter366754
1L Tubo de centrífugaBeckman CoulterA99028
Tunair 2.5L Matraz de batido con baffeledSigma-AldrichZ710822
Microfuge 20Beckman CoulterB30134
New Brunswick Innova 42/42R IncubadoraEppendorfM1335-0000
Cytation 5BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit IBA2-4998-000
pJL1-sfGFPAddgene69496
BL21(DE3)New England BioLabs
Procesador ultrasónico ThermoFisher K210007

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