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Extensión de esteras de nanofibras Electrospun de dos dimensiones en tres dimensiones andamios

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DOI:

10.3791/58918

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7 de enero de 2019

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1Department of Surgery-Transplant and Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center

En este artículo

Resumen

Este artículo demuestra la técnica de expansión de una estera de nanofibras electrospun (2D) tradicional, dos dimensiones en un andamio de tres dimensiones (3D) a través de la despresurización de subcritical CO2 líquido. Estos andamios aumentados son 3D, cerca mímica celular nanotopographic señales y preservar las funciones de las moléculas biológicas encapsuladas dentro de las nanofibras.

Resumen

Electrospinning ha sido la tecnología preferida en la producción de un andamio sintético, funcional debido a la biomimética matriz extracelular y el control de la facilidad de la composición, estructura y diámetro de las fibras. Sin embargo, a pesar de estas ventajas, nanofibras electrospun tradicionales andamios vienen con limitaciones incluyendo desorganizan orientación de nanofibras, baja porosidad, tamaño de poro pequeño y tapetes principalmente dos dimensiones. Como tal, hay una gran necesidad para el desarrollo de un nuevo proceso para la fabricación de andamios de nanofibras electrospun que pueden superar las limitaciones. En este documento, se describe un método novedoso y simple. Una estera de nanofibras 2D tradicional se transforma en un andamio 3D con el espesor deseado, distancia de brecha, porosidad y señales nanotopographic para permitir la siembra de células y la proliferación a través de la despresurización de subcritical CO2 líquido. Además de proporcionar un andamio para la regeneración de los tejidos que se produzca, este método también ofrece la posibilidad de encapsular moléculas bioactivas como péptidos antimicrobianos para la entrega local de la droga. El CO2 ampliado nanofibras andamios tienen gran potencial en la regeneración de los tejidos, la cicatrización de heridas, tejido 3D modelado y administración de fármacos tópicos.

Introducción

El concepto de desarrollar un andamio sintético que puede ser implantado a pacientes para ayudar en la regeneración y reparación del tejido es uno que ha calado en el campo de la medicina regenerativa durante décadas. El andamio sintético ideal sirve para inducir la migración de células de tejido sano circundante, proporciona una arquitectura de vascularización de soportes siembra, adherencia, señalización, proliferación y diferenciación celular, permite la oxigenación adecuada y entrega de nutrición y promueve la actividad inmune del host para asegurar el éxito después de la implantación1. Además, puede utilizarse como un portador para incrustar las moléculas antimicrobianas para ayudar en la cicatrización1,3,6,7,8,9. La capacidad para controlar la liberación temporal de estas moléculas biológicas desde el andamio sintético es otro atributo deseable que se considera cuando ingeniería andamios1.

Electrospinning ha sido una técnica bien utilizada para la producción de nanofibras andamios1,2,3,4,5,6. Intentos anteriores de crear un andamio de nanofibras como el que aquí se han realizado en diversos grados de éxito. Sin embargo, andamios tradicionales nanofibras tienen limitadas habilidades para lograr estas metas. Andamios de nanofibras tradicionales han sido principalmente dos dimensiones esteras1,3. Estos andamios no expandidos se embalan denso con tamaños de poro pequeño; Esto limita la infiltración de la célula, la migración y la diferenciación como no promueve un ambiente bastante similar a las encontradas en vivo1,7,8,9. Por esta razón, se han establecido nuevas técnicas de preparación de andamio de nanofibras electrospun 3D para enmendar los defectos inherentes que vienen con esteras de nanofibras 2D. Estas técnicas resultan en andamios 3D; sin embargo, ha limitado aplicabilidad debido a los métodos de producción que requieren de soluciones acuosas y procedimientos de la liofilización. Este proceso da como resultado la distribución aleatoria de las nanofibras sin organización restringida, grosor adecuado o porosidad deseada para proporcionar las señales de nanotopographic adecuados que son necesarias para la proliferación y migración celular. Estos factores dan como resultado en los andamios de nanofibras electrospun 3D anteriores que carecen de adecuada mímica de la vida los tejidos1,7,8,9.

Se han realizado más recientes intentos de desarrollar un andamio 3D, ampliado con mejor biomimética de matriz extracelular (ECM) con un tratamiento de solución acuosa de Sodio borohidruro (NaBH4) y moldes prediseñados para ayudar en mejor control de la forma de la que resulte del andamio7,8. Sin embargo, este método no es ideal ya que requiere el uso de soluciones acuosas, las reacciones químicas y la liofilización que puede interferir con polímeros y cualquier biomoléculas encapsuladas que son solubles en agua. Los aditivos utilizados también pueden causar efectos secundarios durante la regeneración de tejido8,9. El método de expansión de2 CO descrito en este artículo mucho reduce el tiempo de procesamiento, elimina la necesidad de soluciones acuosas y preserva la cantidad y funcionalidad de moléculas biológicamente activas en mayor medida que los anteriormente métodos establecidos9.

En estudios previos, antibióticos, plata, 1α, 25 dihidroxivitamina D3y péptido antimicrobiano LL-37 fueron cargados en los andamios de nanofibras individualmente y en combinación para investigar el potencial de estos andamios para liberar agentes más ayuda en la cicatrización de9,10,12,13. Con el fin de demostrar que este método de expansión de andamio de nanofibras, Coumarine 6, un colorante fluorescente, se cargarán en el andamio para demostrar el potencial de incrustación del andamio con varios compuestos deseados. Este método de fabricación de andamio de nanofibras ampliado junto con moléculas bioactivas encapsuladas tiene gran potencial en la regeneración de los tejidos, la cicatrización de heridas, la creación de modelos 3D del tejido y la entrega tópica de fármacos.

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Protocolo

Todo en vivo los procedimientos descritos a continuación fueron aprobados por el Comité de IACUC en la Universidad de Nebraska Medical Center.

1. preparar las soluciones estándar Electrospinning

  1. En un tubo de vidrio de 20 mL, se disuelven 2 g de poly(ε-caprolactone) (PCL, Mw = 80 kDa) en una solvente mezcla de diclorometano (DCM) y N, N-dimetilformamida (DMF) con una ración de 4:1 (v/v) a una concentración de 10% (p/v).
    PRECAUCIÓN: Mango DCM y DMF en una campana bien ventilada para evitar la exposición a vapores. No exponga el DCM a los materiales plásticos.
  2. Coloque el tubo de vidrio en un agitador de laboratorio hasta que la solución llega a estar clara. Durante la noche puede mezclar la solución.
  3. Si con la intención de incorporar materiales bioactivos como péptidos o las drogas en el andamio, crear una solución separada y almacenar a 4 ° C hasta que esté listo para usar.
    1. Preparar la solución colorante fluorescente (50 mg/mL) con 20 mL de solución PCL.

2. configurar el aparato de Electrospinning (Figura 1A)

  1. Añadir la solución PCL a una jeringa de 20 mL con una aguja Roma de 21 calibre adjuntada. Asegúrese de que no hay aire en la jeringa y tubos asociados.
  2. Coloque un tambor de acero giratorio con el colector de tierra 12 cm desde la punta de la aguja.
  3. Utilizando pinzas, conecte la fuente de alimentación de alto voltaje de corriente directa (DC) a la aguja y asegurarse de que el colector está conectado a tierra.
    PRECAUCIÓN: Siempre apague la alimentación antes de manipular cualquier material conectado.

3. Electrospinning

  1. Para los 20 mL de solución de PCL, establecer los parámetros de la bomba de jeringa como sigue: diámetro = 20,27 mm, velocidad de flujo = 0,5 mL/h. comprobar si las gotitas se forman en la punta de la aguja.
  2. Si se desea la incorporación de moléculas bioactivas, configurar el aparato para permitir el electrospinning co-axial (Figura 1B). Crear un inyector coaxial modificado para requisitos particulares usando agujas hipodérmicas.
    Nota: Estas boquillas están también disponibles comercialmente. Tenga en cuenta que se prepara una solución de tinte para simular la adición de estas moléculas.
    1. Preparar una solución de 1% de colorante fluorescente 6 de cumarina en el agua. Añadir 3 mL de la tintura de 1% a una pequeña jeringa. Conectar la jeringa a la misma boquilla coaxial como la solución PCL. Una vez más, asegúrese de que no hay ninguna burbuja de aire.
    2. Para esta solución de 3 mL, ajustar los parámetros de la bomba de jeringa como sigue: diámetro = 9,49 mm, velocidad de flujo = 0,02 mL/h. comprobar si las gotitas se forman en la punta de la aguja.
  3. Aplicar un potencial eléctrico de 20 kV entre la hilera (aguja de calibre 22) y un colector de tierra situado a 20 cm de la hilera. Recoger las esteras de nanofibras alineados en un tambor que gira a 2.000 rpm. Recoger las esteras de nanofibras PCL, una vez que alcanzan un espesor de ~ 1 mm.

4. generación de nanofibras PCL de alfombras con agujeros vestidos.

  1. Fabricar esteras de nanofibras PCL.
    1. Disolver los granos PCL en una mezcla solvente de DCM y DMF con una relación de 4:1(v/v) a una concentración de 10% (PCL) (w/v). La solución PCL la bomba con un caudal de 0,7 mL/h mediante una bomba de jeringa mientras un potencial de 20 kV se aplica entre la hilera (una aguja de calibre 22) y un colector de tierra situado 12 cm aparte de la hilera.
    2. Recoger la membrana nanofibras usando un tambor que gira con una velocidad de rotación superior a 500 rpm.
  2. Sumerja las esteras de nanofibras PCL en líquido N2 durante 5 minutos (es decir., endurecerán). Mantenga las esteras de nanofibras PCL en líquido N2 y PCL nanofibras esteras del sacador con un punzón de diámetro mm 0,5.

5. expansión de nanofibras 2D de esteras con o sin agujeros vestida por subcríticos CO2 líquido (Figura 2).

  1. Coloque las esteras de nanofibras PCL en nitrógeno líquido durante 5 minutos y cortar en cuadrados de 1 cm x 1 cm con afiladas tijeras quirúrgicas mientras sumergido en nitrógeno líquido para evitar la deformación de los bordes.
  2. Coloque la almohadilla de corte en un tubo de centrífuga de 30 mL con ~ 1 g de hielo seco. Firmemente la tapa del casquillo y deje que el hielo seco en líquido de CO2.
  3. Una vez que se ha formado líquido en el tubo, rápidamente liberar la presión abriendo la tapa.
    PRECAUCIÓN: Use equipo de protección térmica adecuada cuando trabaje con nitrógeno líquido y hielo seco. No abra el tubo a presión hacia la cara. El tubo de la centrífuga no debe utilizarse repetidamente.
  4. Retirar y observar el andamio sopló por el tubo. Colocar el andamio en un nuevo tubo de centrífuga con hielo seco y repetir hasta logra el espesor deseado. Esterilizar los andamios de nanofibras ampliado en óxido de etileno antes de la incubación con las células.

6. Caracterización de nanofibras ampliado andamios

  1. Caracterizar la morfología y estructura de los andamios de nanofibras ampliado mediante microscopía electrónica (SEM).
    1. Coloque las muestras con cinta de doble cara conductora para el perno metálico y la capa de platino de 40 s mediante un recubridor sputter a 40 mA.
    2. Examinar las fibras utilizando SEM según anteriores estudios9. Recoger las imágenes en un voltaje de aceleración de 15 kV.
  2. Caracterizar perfiles de liberación in vitro y bioactividad de péptidos liberados.
    1. Peso 10 mg de nanofibras membranas antes y después de la expansión en CO2.
    2. Sumergir las muestras en tampón PBS y recoger 10 μL del sobrenadante en momentos diferentes (0-28 días).
    3. Utilice el kit de genitals inmuno Sorbent ensayo (ELISA) para cuantificar la concentración de péptido LL-37 en el sobrenadante recogido.
  3. Examinar la respuesta en vivo y a anfitrión de infiltración celular.
    1. El 9 - semana de edad las ratas de Sprague-Dawley (SD) en una cámara de anestesia, conectar al vapor de isoflurano y anestesiar las ratas. Transferencia de las ratas a una mesa de operaciones después de que las ratas se convierten en anestesia completa sin sentimientos. Continuamente anestesiar las ratas con un cono de nariz de isoflurano vaporizador durante la cirugía. Afeitar el pelo de la espalda de rata por máquina de afeitar de un animal y esterilizar con yodo y alcohol exfoliante de la piel. Crear bolsillos subcutáneos a través de incisiones de 1,5 cm en sitios supraspinal en el dorso con un bisturí.
    2. Inserte un andamio de nanofibras ampliado (1.5 mm de espesor) en el bolsillo subcutáneo con unas pinzas para cada incisión. Cerrar la incisión con una grapadora.
    3. En 1, 2 y 4 semanas, eutanasia a las ratas con 95% CO2. Disecan suavemente el explante y el tejido circundante con tijeras quirúrgicas. Antes del análisis histológico, sumergir el tejido en formol durante al menos 3 días y luego incrustar con parafina. Sección del tejido con un micrótomo, luego realizar la hematoxilina y eosina (H & E), tinción tricrómica de Masson.

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Resultados

La eficacia de la expansión de esteras de nanofibras electrospun 2D tradicional en 3D andamios por despresurización de subcritical CO2 líquido fue demostrada en diferentes capacidades: el grueso de los andamios se incrementó de 1 mm cuando no se trata de 2,5 mm y 19,2 mm con CO2 tratamientos uno y dos, respectivamente (Figura 3A-C). La porosidad, una característica de la arquitectura fundamental para la siembra de célula...

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Discusión

Transformación de esteras de nanofibras electrospun 2D tradicional en andamios 3D ampliados fue investigado por CO2 despresurización. Nanofibras 2D tradicionales esteras son exitosamente ampliado vía subcritical CO2 líquido. Son los pasos críticos fabricar nanofibras 2D esteras bajo una condición optimizada y cortar las esteras sin deformar los bordes (por ej., usando afiladas tijeras quirúrgicas). Este CO2-nanofibras ampliado andamios tienen muchos beneficios s...

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Divulgaciones

Autores declaran que no existe ningún conflicto de interés.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por donaciones desde el Instituto Nacional de General médica ciencia (NIGMS) en el NIH (2P 20 GM103480-06 y 1R01GM123081 a losa), los fondos Fundación de investigación médica de Otis Glebe, NE LB606 y puesta en marcha de la Universidad de Nebraska Medical Centro.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
PolicaprolactonaSigma-Aldrich440744
N,N-DimetliformamidaFisher ChemicalD-199-1
DiclorometanoFisher ChemicalAC61093-1000
Coumarina 6Sigma-Aldrich546283
Tambor de acero giratoriopersonalizadoEsto sirve como colector durante el electrohilado.
Bomba de jeringaFisher Scientific14-831-200La hilatura coaxial requiere dos bombas de jeringa simples.
RevólverLab Net InternationalH5600Rotador de laboratorio ajustable para soluciones
de mezcla Aguja hipodérmica (27G x 1 1/2")EXCELINT International Co26426Esto es parte del ejemplo de boquilla coaxial personalizada que se muestra.
Aguja hipodérmica (21G x 1 1/2")EXCELINT International Co26416Esto es parte del ejemplo de boquilla coaxial personalizada que se muestra.
Fuente de alimentación de CCde alto voltaje Gamma Investigación de alto voltajeES30
Microscopio electrónico de barridoFEINova 2300
Microscopio de fluorescenciaZeissAxio Imager 2
LL 37 ELISA KitHycult BiotechHK321-02

Referencias

  1. Chen, S., et al. Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing. Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).
  2. Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization. Journal of Visualized Experiments. (98), e52626(2015).
  3. Xie, J., Li, X., Xia, Y. Put electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).
  4. Xie, J., et al. Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks. Small. 7 (3), 293-297 (2011).
  5. Xie, J., et al. Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications. ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).
  6. Xie, J., et al. "Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
  7. Jiang, J., et al. Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration. Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).
  8. Jiang, J., et al. Expanding Two-Dimensional Electrospun Nanofiber Membranes in the Third Dimension by a Modified Gas-Foaming Technique. ACS Biomaterials Science & Engineering. 10 (1), 991-1001 (2015).
  9. Jiang, J., et al. CO2-expanded nanofiber scaffolds maintain activity of encapsulated bioactive materials and promote cellular infiltration and positive host response. Acta Biomaterialia. 68, 237-248 (2018).
  10. Chen, S., et al. Nanofiber-based sutures induce endogenous antimicrobial peptide. Nanomedicine. 12 (10), 2597-2609 (2017).
  11. Dhand, C., et al. Bio-inspired crosslinking and matrix-drug interactions for advanced wound dressings with long-term antimicrobial activity. Biomaterials. 138, 153-168 (2017).
  12. Jiang, J., et al. Local sustained delivery of 25-hydroxyvitamin D3 for production of antimicrobial peptides. Pharmaceutical Research. 32 (9), 2851-2862 (2015).
  13. Jiang, J., et al. 1α, 25-dihydroxyvitamin D3-eluting nanofibrous dressings induce endogenous antimicrobial peptide expression. Nanomedicine (Lond). 13 (12), 1417-1432 (2018).
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