Identificación de marcadores de superficie celular de células madre neuronales primarias y células progenitoras por etiquetado metabólico de sialoglicano

Resumen

Aquí se presenta un protocolo que combina un sistema de cocultivo endotelial neuronal in vitro e incorporación metabólica de sialoglicano con grupos funcionales bioortogonales para expandir las células primarias del tallo neural y del progenitor y etiquetar su superficie sialoglycoproteínas para el análisis de imágenes o espectrometría de masas de marcadores de superficie celular.

Resumen

Las células neurales del tallo y del progenitor (SSPC) son la base celular de las complejas estructuras y funciones del cerebro. Se encuentran en nichos especializados in vivo y pueden ser aislados y ampliados in vitro,sirviendo como un recurso importante para el trasplante de células para reparar el daño cerebral. Sin embargo, los SSPCE son heterogéneos y no están claramente definidos a nivel molecular o purificados debido a la falta de marcadores específicos de la superficie celular. El protocolo presentado, que se ha informado previamente, combina un sistema de cocultivo endotelial endotelial con un método de etiquetado de glicano metabólico para identificar el sialoglycoproteome superficial de los SSPCE primarios. El sistema de cocultura Endotelial NSPC permite la auto-renovación y expansión de los SCP primarios in vitro,generando un número suficiente de SSPCs. grupos funcionales bioortogonales. Al comparar el sialoglycoproteome de los SSPN autorenovadores expandidos en un cocultivo endotelial con el cultivo neural diferenciador, identificamos una lista de proteínas de membrana que se enriquecen en los SSP. En detalle, el protocolo implica: 1) la configuración de una cocultura endotelial NSPC y una cultura diferenciadora de la NSPC; 2) etiquetado con azidosugar per-O-acetilado N-azidoacetylmannosamine (Ac₄ManNAz); y 3) conjugación de biotina a sialoglycan modificado para la toma de imágenes después de la fijación del cultivo neural o extracción de proteínas del cultivo neural para el análisis de espectrometría de masas. A continuación, los candidatos de marcadores de superficie enriquecidos con NSPC se seleccionan mediante el análisis comparativo de datos de espectrometría de masas tanto de la NSPC expandida como de los cultivos neuronales diferenciados. Este protocolo es altamente sensible para identificar proteínas de membrana de baja abundancia en los materiales de partida, y se puede aplicar al descubrimiento de marcadores en otros sistemas con modificaciones apropiadas

Introducción

Las células madre neuronales se definen como una población celular multipotente que puede renovarse para mantener una piscina de células madre y diferenciarse en neuronas y glia. Son los principales tipos de células en el sistema nervioso y pueden ofrecer un gran potencial terapéutico en medicina regenerativa a través del trasplante celular en cerebros enfermos y lesionados^1,2. A medida que avanza el desarrollo, la población de células madre neurales se vuelve heterogénea^3,4, y la proporción de células madre neurales en el cerebro disminuye gradualment....

Protocolo

Todos los protocolos animales utilizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso Animal (IACUC) de la Universidad de Tsinghua y realizados de acuerdo con las directrices de la IACUC. La instalación de animales de laboratorio en la Universidad de Tsinghua ha sido acreditada por la AAALAC (Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International). Para la puesta en escena de embriones, a mediados del día del tapón vaginal identificado se calculó como el día embrionario 0.5 (E0.5).

NOTA: Todas las células se cultivan en la incubadora celular en condiciones de 3....

Resultados

Todo el procedimiento para la expansión in vitro y el etiquetado metabólico de los SSPCC embrionarios primarios toma 6 días(Figura 1A). La calidad de la línea celular BEND3 y los SSCCP primarios recién aislados son clave para un experimento exitoso. Las células BEND3 son la fuente de factores solubles que estimulan la autorenovación y proliferación de los SSP. Debe asegurarse de que las células BEND3 estén libres de contaminación y se dividan activamente con .......

Discusión

Los marcadores de superficie se utilizan comúnmente para etiquetar y purificar tipos de células específicas in vitro e in vivo^17,18. El descubrimiento de marcadores superficiales contribuye en gran medida a la medicina regenerativa y las investigaciones de células madre proporcionando herramientas moleculares para enriquecer selectivamente una población de células madre a partir de tejidos normales o patológicos y platos de cultivo, ofreciendo una célula purifica.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamina	Gibco	25030081	1%
Piruvato de sodio	Sigma	P5280	1%
N2 suplemento	Gibco	17502048	1 a 100
N-acetil-L-cisteína	Sigma	A7250	1 mM
Papaína	Worthington	LS003726	10 U/mL
Suplemento B27	Gibco	17504044	1 a 50
Poly-L-lisina		Sigma P4707
Factor de crecimiento básico de fibroblastos	Gibco	PHG0261	10 ng/mL
Penicilina-Estreptomicina	Gibco	15140122	1%
Suero fetal bovino	Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0.25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehído	Sigma	158127	4%
Sacarosa	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
Tampón RIPA	Thermo Scientific	89900
SDS-PAGE tampón de carga 2x	Solarbio	P1018
placa de 6 pocillos	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
anti-nestina monoclonal para ratones	Banco de hibridomas	Rat-401	1 a 20
Monoclonal de ratón anti-beta-tubulina III	Sigma	T8860	1 a 1.000
Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón IgG1	invitrogen	A-21121	1 a 1.000 Alexa
Fluor 546 cabra anti-ratón IgG2b	invitrogen	A-21143	1 a 1.000
Albúmina Bovino V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA kit de ensayo	Thermo Scientific	23225
Dimetilsulfóxido Sigma		D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
Alquino-biotina	Click Herramientas químicas	TA105
BTTAA	Click Herramientas químicas	1236
Ac4ManNAz	Herramientas de química de clic	1084	100 µ M
9AzSia	sintetizado en laboratorio
Ascorbato de sodio	Sigma	A4034
Metanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Alexa Harina 647 estreptavidina	conjugadainvitrogen	S21374	1 a 1.000
Trietanolamina	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Estreptavidina	invitrogen	60210
Bicarbonato de amonio	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurano	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNasa I	Sigma	DN25	12 µ g/mL
de urea	Sigma	U5378