Un protocollo di acciaio inox per l'isolamento di RNA di alta qualità da Laser catturare cellule Microdissected Purkinje nel cervelletto umano Post-Mortem

Summary

Questo protocollo utilizza un approccio privo di mordente di visualizzare e di isolare le cellule di Purkinje nel tessuto fresco congelato dal cervelletto umano post mortem tramite laser capture microdissection. Lo scopo del presente protocollo è quello di generare una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per la sequenza di RNA.

Abstract

Microdissezione laser (LCM) è uno strumento vantaggioso che consente la raccolta di cellule citologicamente e/o fenotipico pertinenti o regioni da tessuti eterogenei. Prodotto acquisito può essere utilizzato in una varietà di metodi molecolari per le proteine, DNA o RNA isolamento. Tuttavia, la conservazione di RNA dal tessuto post mortem del cervello umano è particolarmente impegnativi. Tecniche di visualizzazione standard per LCM richiedono istologico o procedure di macchiatura immunohistochemical che possono ulteriormente degradano il mRNA. Pertanto, abbiamo progettato un protocollo inox per visualizzazione in LCM con lo scopo di preservare l'integrità di RNA nel tessuto cerebrale umano post mortem. Delle cellule di Purkinje del cervelletto è un buon candidato per la visualizzazione di acciaio inox, grazie alla sua dimensione e la posizione caratteristica. La corteccia cerebellare ha livelli distinti che differiscono nella densità delle cellule, che li rende un buono archetipo per identificare al microscopio ad alto ingrandimento. Cellule di Purkinje sono grandi neuroni situati tra lo strato delle cellule del granello, che è una rete densamente cellulare dei neuroni piccoli, e lo strato molecolare, che è sparso in corpi cellulari. A causa di questa architettura, l'utilizzo di acciaio inox visualizzazione è fattibile. Altri sistemi dell'organo o cellula che imitano questo fenotipo sarebbe anche adatti. Il protocollo di acciaio inossidabile è progettato per fissare il tessuto fresco congelato con etanolo e rimuovere i lipidi con xilene per migliorare la visualizzazione morfologica nell'ambito di microscopia ad alto ingrandimento. Questo protocollo non tiene conto di altri metodi di fissazione ed è specificamente progettato per campioni di tessuto fresco congelato acquisiti utilizzando un ultravioletto (UV)-sistema di LCM. Qui, presentiamo un protocollo completo per sezionamento e fissare tessuto cerebellare umano fresco congelato post mortem e purificazione di RNA da cellule di Purkinje isolate di UV-LCM, preservando la qualità di RNA per RNA-ordinamento successivo. Nelle nostre mani, questo protocollo produce eccezionali livelli di visualizzazione cellulare senza la necessità di reagenti di colorazione e produce RNA con alti numeri di integrità di RNA (≥ 8) come necessario per gli esperimenti di profilatura trascrizionali.

Introduction

Microdissezione laser (LCM) è uno strumento di ricerca di valore che consente la separazione delle cellule patologicamente rilevanti per la valutazione molecolare guidata successiva. L'uso delle analisi molecolari in questi campioni di tessuto eterogeneo e la correlazione con dati clinici e patologici è un passo necessario nel valutare l'importanza traslazionale della ricerca biologica¹. Quando si analizzano i dati di espressione genica da RNA, l'uso di sezioni di tessuto congelato è altamente consigliato in quanto consente di eccellente qualità di RNA così come ingrandita quantità². È stata ben stabilita che alta qualità e la quantità di RNA sono essenziali per dati significativi da RNA sequenza³. Tuttavia, quando si utilizza RNA dal tessuto fresco congelato post mortem per LCM, degradazione del RNA è una sfida importante, come si verifica immediatamente dopo la morte e la sua estensione è mediata da vari fattori connessi con il tessuto collezione metodo^4,5 . Inoltre, degradazione del RNA è aggravata quando tecniche di colorazione sono necessari per riconoscere dettagli istologici e l'identificazione delle cellule. Specializzata macchiatura tecniche come l'ematossilina ed eosina, di Nissl, immunofluorescenza e immunoistochimica sono utili nella differenziazione delle cellule dallo stroma circostante ma hanno dimostrati di degradare il mRNA e alterare l'espressione di trascrizione profili⁶. Di conseguenza, il nostro laboratorio ha creato un protocollo inox specificamente progettato per preservare il RNA in cervelletto umano post mortem ai fini del sequenziamento di RNA dopo l'isolamento di LCM di neuroni di Purkinje.

Nell'elaborazione di tessuto congelato fresco per LCM, il metodo di fissazione variabilmente può influenzare l'integrità del tessuto e del RNA. Fissazione in formalina è standard per conservazione morfologica, ma cause cross-linking che possono frammentare RNA e interferire con l'amplificazione di RNA⁷. Fissazione dell'etanolo è un'alternativa migliore per l'isolamento di RNA, come è un fissativo coagulante che non induce la reticolazione¹. Per migliorare la visualizzazione della morfologia del tessuto, xilene è la scelta migliore, in quanto rimuove i lipidi dal tessuto. Tuttavia, ci sono note alcune limitazioni quando si utilizza xilene in LCM, come i tessuti possono asciugarsi e diventare fragili che causano frammentazione del tessuto su laser capture⁷. Xilene è anche una tossina volatile e deve essere gestito correttamente in una cappa aspirante. Tuttavia, xilene è stato indicato per migliorare la visualizzazione del tessuto preservando anche RNA integrità⁸. Di conseguenza, il nostro protocollo centri intorno all'uso della fissazione dell'etanolo 70% ed etanolo disidratazione, seguita da incubazione di xilene per chiarezza morfologica.

È importante notare i diversi tipi di sistemi basati sul laser microdissection, come essi hanno dimostrati di differiscono in velocità, precisione e qualità di RNA. Il laser infrarosso (IR) capture microdissection e i sistemi di raggi ultravioletti (UV) laser microbeam microdissection erano entrambe le piattaforme LCM romanzo emerse quasi contemporaneamente⁸. Il sistema IR-LCM si avvale di un "sistema di contatto" utilizzando una pellicola termoplastica trasparente collocata direttamente sulla sezione di tessuto, e celle di interesse selettivamente aderiscano la pellicola da impulsi focalizzati da un laser a infrarossi. In alternativa, il sistema UV-LCM è un sistema"senza contatto", per cui un raggio laser focalizzato taglia via le cellule o le regioni di interesse nel tessuto; a seconda della configurazione in due piattaforme commerciali attualmente disponibili che utilizzano entrambi un design microscopio invertito o in posizione verticale, tessuto viene acquisito in un dispositivo di raccolta da un'onda di pressione indotta da laser che si catapulta contro la gravità o il tessuto è raccolti dalla forza di gravità, rispettivamente. Vantaggi del sistema UV-LCM includono acquisizione delle cellule più veloce, privo di contaminazione insieme con l'approccio di non-contatto e più precisa dissezione dovuto un molto più piccolo laser fascio diametro⁹. Questo protocollo è stato specificamente progettato per un sistema UV-LCM e non è stato testato in un sistema di IR-LCM. Nella progettazione di sistema o UV-LCM, quando cellule accumula nella PAC raccolta, l'uso di un vetrino coprioggetto che migliora la chiarezza cellulare durante la microscopia non è adatto, come le cellule sarebbe in grado di entrare nella PAC collezione. Di conseguenza, per migliorare la visualizzazione del tessuto, abbiamo testato l'uso di tappi insieme opaco, che sono progettati per fungere da un vetrino coprioggetto per visualizzazione microscopica in sistemi UV-LCM, contro tappi di raccolta del liquido riempito. Tappi di raccolta del liquido riempito possono essere difficile, come il liquido è soggetta a evaporazione e dovrà essere sostituito frequentemente mentre si lavora al microscopio. Tempo diventa un fattore importante per la stabilità del RNA, mentre il tessuto catturato si dissolve immediatamente⁷.

Il nostro laboratorio studia i cambiamenti neuropathologic post mortem nel cervelletto dei pazienti con tremore essenziale (ET) e disordini neurodegenerative correlate del cervelletto. Abbiamo dimostrato i cambiamenti morfologici centrati sulle cellule di Purkinje che distinguono ET casi contro i comandi, tra cui un numero ridotto di cellule di Purkinje, aumentato dendritiche regressione e una varietà di cambiamenti axonal, che ci porta a postulare che Purkinje degenerazione delle cellule è una caratteristica biologica di core ET patogenesi^10,11,12,13. Profiling trascrizionale è stato utilizzato in molte malattie neurologiche per esplorare la base molecolare sottostante dei cambiamenti cellulari degeneranti. Tuttavia, profili trascrizionali da campioni eterogenei, quali regioni del tessuto di cervello, efficacemente possono mascherare l'espressione delle trascrizioni di abbondanza bassa e/o diminuire la rilevazione dei cambiamenti molecolari che si verificano solo in una piccola popolazione di interessati cellule, come le cellule di Purkinje nella corteccia cerebellare. Per esempio, cellule di Purkinje sono grave inferiorità numerica da parte delle cellule del granello abbondante nella corteccia cerebellare di circa 1: 3000; così, efficacemente destinazione loro transcriptome richiede l'isolamento specifico di questi neuroni. La corteccia cerebellare è delineata da strati distinti che differiscono nella densità delle cellule e la dimensione della cella. Questa architettura cellulare è ideale per visualizzare in un campione di tessuto fresco congelato senza tintura-contenente i reagenti di colorazione. In teoria, questo protocollo potrebbe essere applicato anche ad altri tipi di tessuto che hanno tessuto distintivo simile organizzazione.

Questo protocollo è stato progettato per lavorare in modo specifico per la visualizzazione delle cellule di Purkinje nel cervelletto umano post mortem. Esistono numerosi protocolli per la fissazione, colorazione, visualizzazione e conservazione di RNA di molti tipi di tessuti ai fini di entrambi LCM IR e UV. Quando contemplando un disegno sperimentale per UV-LCM, gli individui dovrebbero adattare loro protocollo per adattarsi al meglio le esigenze e i requisiti di inizio e fine di materiali. Qui, uniamo molti aspetti dei diversi protocolli di LCM per fornire un metodo avanzato per la visualizzazione di cellule di Purkinje nel cervelletto umano post mortem senza dover preparare il RNA di alta qualità per il trascrittoma di colorante contenente i reagenti di colorazione sequenziamento.

Protocol

Tutti i campioni umani utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti con il consenso informato e sono stati approvati da interno Review Board (IRB) alla Columbia University e Università di Yale.

Nota: La totalità del presente protocollo deve seguire RNA rigoroso gestione delle linee guida, per cui una mano guantata viene sempre utilizzata, tutte le superfici vengono pulite con una decontaminazione di RNAsi e tutti i materiali di lavoro sono RNA/DNA/nucleasi gratis.

1. test RNA l'integrità del tessuto prima del LCM a partire

Nota: Test di qualità di RNA può essere fatto da molti metodi. Garantire che RNA dall'intera sezione è testato per fornire un numero rappresentativo di integrità RNA (RIN) per il campione.

1. Selezionare con attenzione i campioni di tessuto per l'inclusione che corrispondono all'interno del parametro di disegno sperimentale. Se tagliare al criostato, spostare al punto 1.2. In caso contrario, elaborare di conseguenza il tessuto e passare al punto 1.11.
2. Ottenere due contenitori di ghiaccio secco. La dimensione dipenderà il numero di campioni.
   1. Nel primo contenitore del ghiaccio secco, posizionare un tubo 2ml vuota, con etichetta con il codice del tessuto.
      Nota: Ci vogliono 10 minuti per i tubi di congelare. Tubi devono essere congelate prima di posizionare il tessuto in loro; in caso contrario, il tessuto si scioglierà sulla superficie del tubo.
   2. In un secondo contenitore di ghiaccio secco, posizionare il tessuto da un congelatore-80 ° C che richiede controllo di RNA.
3. Pulire il criostato. Vedere passaggio 4.7 per una dettagliata procedura di pulizia.
4. Rimuovere il tessuto da ghiaccio secco e tagliare una piccola sezione del tessuto con una lama di rasoio di RNAsi decontaminata. Il tessuto dovrebbe essere circa 1 cm x 1 cm nel formato.
5. Posizionare un tumulo alto di circa 3 mm di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto un criostato 'chuck' e farlo congelare parzialmente. Quindi, posizionare il tessuto in cima l'OCT — non spingere in OCT, semplicemente lasciare riposare sulla parte superiore.
6. Una volta che si indurisce OCT, posizionare il mandrino con il tessuto montato nel braccio di taglio del criostato e posizione di fronte la lama del criostato.
7. Trim a 30 μm sezioni fino a quando il tessuto è ancora.
8. Tagliare 300 μm del tessuto e posto in un tubo 2ml congelati. Inserire il tubo di ghiaccio secco.
9. Rimuovere il tessuto dal 'mandrino' e mettete in ghiaccio secco fino al momento di mettere via.
10. Ripetere i passaggi da 1.4-1.9 per tutti i tessuti.
11. Una volta completati tutti i campioni, estrarre RNA usando il kit di estrazione RNA fornito (Tabella materiali #15). Un protocollo dettagliato è fornito con il kit di estrazione di RNA. Seguire tutte le istruzioni comprese il passaggio facoltativo per asciugare la membrana del tubo di raccolta e il passaggio facoltativo per la digestione della dnasi (Tabella materiali #16).
12. Verificare l'integrità del RNA estratto tramite una valutazione di qualità bioanalyzer¹⁴.

2. preparare prima del sezionamento a partire per LCM

1. Pulire i possessori di diapositive prima di ogni turno di taglio del tessuto di LCM. Eseguire la procedura di pulizia il giorno prima dell'uso per permettere completa asciugatura durante la notte.
   Nota: portavetrini sono utilizzati per il fissaggio del tessuto sezione in etanolo e schiarimento in xilene.
   1. Far scorrere supporto procedura di pulizia: lavare con decontaminazione RNasi seguita da dietil pirocarbonato trattato (DEPC) acqua. Lasciar asciugare durante la notte capovolta su una superficie libera di RNA/DNA/nucleasi, evitando eventuali tracce di polvere o altri contaminanti aerei.
      Attenzione: DEPC è altamente tossico e dovrebbe essere maneggiato ed eliminato utilizzando il protocollo standard sostanze chimiche pericolose EH & S.
2. Pulire le spazzole per il sezionamento con RNAsi decontaminator e lasciar asciugare durante la notte. Evitare eventuali tracce di polvere e altri contaminanti.
3. Posto la membrana scivola sotto luce UV per 30 min a temperatura ambiente. Fare non esporre che le diapositive ai raggi UV più di 1 – 2 giorni prima di utilizzano. Questo migliora l'associazione del tessuto alla diapositiva di membrana.
   Nota: Passo 2.3 può essere combinato con passo 4, che consente per diapositiva il trattamento UV si verificano nello stesso giorno come tessuto sezionamento (Vedi punto 4.4).

3. preparare soluzioni di fissaggio con RNAsi libera acqua ed etanolo di alta qualità

Nota: Tutte le soluzioni sono preparate freschi per ogni esperimento. Assicurarsi che il supporto per diapositive pulizia procedura dal passo 1.1 è completato. Tutte le soluzioni vengono preparate nel portavetrini.

1. Posto 30 mL di etanolo al 100% in un portavetrini.
2. Etanolo diluito con acqua gratuita RNasi/dnasi/nucleasi. Posto 30 mL di etanolo al 95% in una diapositiva titolare e mettere il ghiaccio.
3. Etanolo diluito con acqua gratuita RNasi/dnasi/nucleasi. Posto 30 mL di etanolo al 70% in una diapositiva titolare e mettere il ghiaccio.
4. Posto 30 mL di xilene 100% in due separate portavetrini ed etichettarli come #1 e #2.

4. preparare il criostato per il taglio di tessuto

1. Prendi un secchio di ghiaccio per soluzioni di etanolo e un contenitore con ghiaccio secco per il tessuto.
   Attenzione: Il ghiaccio secco è estremamente freddo, quindi utilizzare guanti protettivi. Non collocare nello stesso contenitore di ghiaccio e ghiaccio secco. Temperature diverse nel ghiaccio e ghiaccio secco li farà a forma insieme a una temperatura indeterminata.
2. Rimuovere il tessuto dal congelatore a-80 ° C e posto il ghiaccio secco per il trasporto al criostato.
3. Impostazioni di criostato:
   1. Impostare lo spessore di sezione a 14 μm.
   2. Impostare lo spessore di taglio a 30 μm per conservare la quantità di tessuto.
   3. Per criostati con doppia camera ed esemplare che tiene le temperature, impostare la temperatura della camera (CT) a-18 ° C. Per criostati con una sola impostazione, impostare la temperatura a-17 ° C.
   4. Per criostati con doppia camera ed esemplare che tiene la temperatura, regolare la temperatura dell'oggetto (OT)-16 ° C.
      Nota: L'OT ha bisogno di essere più caldo che il CT per garantire anche un taglio. Se il tessuto è ancora triturazione, l'OT può essere aumentata a-15 ° C e il CT può essere aumentato a-18 ° C.
4. Posizionare il tessuto nel criostato per almeno 20 min consentire a temperatura ottima.
   Nota: Se il tessuto non è a temperatura ottima, esso verrà tagliuzzare al momento del taglio. Non collocare il tessuto a-20 ° C la sera prima per preservare l'integrità del RNA e per prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio. Consentire il tessuto come molto tempo come necessario stabilizzare a temperatura ottimale per tagliare senza problemi. Implementazione facoltativa di incubazione diapositiva sotto UV può verificarsi qui (Vedi punto 1.3).
5. Posizionare il mandrino di' ' del criostato per almeno 20 min consentire di venire giù per la temperatura del criostato.
6. Posizionare le spazzole pulite nel criostato per almeno 20 min consentire di venire giù per la temperatura del criostato.
7. Pulire il criostato
   1. Pulire il palco con una miscela 1:1 di RNAsi decontaminazione e 70% di etanolo diluito con acqua gratuita di RNA/DNA/Nuclease per evitare il congelamento sul palco.
   2. Pulire una nuova lama monouso criostato con decontaminazione RNasi e posto del portalama sul palco. Consentire almeno 20 min per la lama di criostato a temperatura del criostato.
   3. Pulire la piastra stendi-fetta con decontaminazione RNasi e allo stage. Consentire almeno 20 min per la piastra a temperatura del criostato.
      Nota: Una piastra non è necessaria per il taglio, ma è altamente consigliata. Se non è disponibile una piastra, un pennello pulito funziona come un'alternativa. Se la piastra non è alla giusta temperatura, il tessuto sarà sciogliere o bastone su taglio.

5. taglio tessuto

1. Tagliare un piccolo pezzo di tessuto (~ 1 cm x 1 cm) per il sezionamento. Tornare il tessuto restante del congelatore di ghiaccio secco /-80 ° C.
   Nota: Assicurarsi che la sezione di tessuto corteccia cerebellare ~ 95%, dove si trovano le cellule di Purkinje.
2. Posto un tumulo alto di circa 3 mm di OCT per coprire il 'mandrino'. Iniziare con la costruzione degli strati in cima in un movimento circolare, lento, fino a quando c'è un piccolo tumulo.
3. Una volta OCT è parzialmente congelato, ma c'è ancora un po' di liquido nel centro, posizionare il tessuto in cima OCT. Non spingere il tessuto profondamente in ott. Consenti il tessuto per sedersi in cima OCT fino a quando completamente congelato. Questo richiederà 1 – 2 min.
4. Inserire il braccio di taglio criostato 'mandrino' con OCT congelati e il tessuto. Regolare il tessuto in modo che sia allineato con lama di taglio.
5. Consentire al tessuto di sedersi in braccio di taglio per 15 – 20 min di adattarsi alla nuova temperatura.
   Nota: A seconda dello spessore del tessuto, il tempo necessario per acclimatazione di temperatura. Consentire al tessuto di sedersi come necessaria per tagliare in modo pulito. Regolare OT e CT per assistere con acclimatazione di temperatura dei tessuti.
6. Spostare lentamente il tessuto più vicino alla lama. Una volta che il tessuto ha raggiunto la lama, avviare il processo di finitura. Spessore di taglio deve essere impostato su 30 μm.
7. Tagliare 2 – 3 volte fino a quando gli strati di corteccia sono visibili.
8. Posizionare e allineare la piastra stendi-fetta appena sopra la lama del criostato.
   Nota: Verrà visualizzata una riga d'argento dalla luce nella criostato all'interfaccia della lama e della piastra stendi-fetta. Questo indica che la piastra è direttamente sopra il bordo della lama.
9. Iniziare a tagliare le sezioni a 14 μm. Sezioni tagliate correttamente sarà piatta sotto la piastra stendi-fetta.
   Nota: Se il tessuto è bloccato, è necessario assicurarsi che la piastra sia abbastanza fredda. Se necessario, mettendo un pezzo di a secco di ghiaccio sulla volontà esterna (lato non toccando la fase) rapidamente raffreddare la piastra stendi-fetta.
10. Tagliare 4 – 6 sezioni e allinearle orizzontalmente in tutta la fase del criostato.
11. Pesca la diapositiva, raccogliere tutti i pezzi del tessuto in una sola volta.
    Nota: Utilizzando i pennelli, sollevare l'estremità del tessuto per essere più facilmente disponibili per la diapositiva al momento del prelevamento. Non aspirare una sezione alla volta. L'esposizione all'aria a temperatura ambiente si degrada l'integrità di RNA.
    Attenzione: La membrana non devono toccare la fase del criostato. Se la membrana tocca la fase, esso inizierà a staccarsi dal vetrino e causerà errori quando si tenta di LCM.
12. Immediatamente spostare al passaggio 6. Non ritardare la fissazione.

6. fissaggio del tessuto/macchia meno visualizzazione

1. Spostare immediatamente il protocollo di fissazione dell'etanolo
2. Porre il vetrino nel supporto per diapositive con etanolo al 70% per 2 min — sul ghiaccio.
3. Porre il vetrino nel supporto per diapositive con etanolo al 95% per 45 s — sul ghiaccio.
4. Porre il vetrino nel supporto per diapositive con etanolo al 100% per 2 min — a TA.
5. Immergere il vetrino 3 volte nel supporto per diapositive con xilene 1 — a TA.
6. Porre il vetrino nel supporto per diapositive con xilene 2 per 5 min — a TA.
7. Lasciare per asciugare in una zona pulita per almeno 30 min più lunghi tempi di asciugatura sono ottimali, fino a 60 min.
   Attenzione: Alzarsi diapositive per l'essiccazione in una cappa aspirante. Xilene è volatile. Diapositive posa piatto causerà xilene al pool nella sezione del tessuto, che causerà il tessuto essere troppo scuro.

7. opzionale — Slide Storage

1. Mettere i vetrini essiccati in provette individuali da 50 mL (una diapositiva per tubo) e mettere in congelatore-80 ° C fino a 7 giorni.
   Nota: Diapositive devono essere asciutti prima di mettere nel congelatore-80 ° C. Non utilizzare essiccante all'interno del tubo come particolato verrà incorporato nel tessuto e membrana. Assicurarsi che il cappuccio del tubo è stretto; in caso contrario, condensazione si verificherà sulla diapositiva quando si scioglie per l'uso.
   Attenzione: Integrità di RNA diminuisce dopo 7 giorni, così come la qualità di visualizzazione del tessuto.

8. lo scongelamento memorizzati scivoli per l'uso

1. Rimuovere il tubo con una singola diapositiva dal congelatore-80 ° C 1 h prima dell'uso previsto.
2. Non aprire immediatamente il tubo. Lasciare il tubo a temperatura ambiente. Si verificherà la condensa sulla parte esterna del tubo solo.
3. Una volta che il tubo è venuto a temperatura ambiente e condensa tutto è andata (circa 30 – 40 min), togliere il tappo ed esporre il vetrino all'aria a temperatura ambiente.
4. Lasciar acclimatare a temperatura ambiente per 15 – 20 min. congedo rimosso il vetrino all'interno del tubo con il tappo.
   Nota: Diapositiva è ora pronto per LCM.

9. laser Capture Microdissection delle cellule di Purkinje:

Nota: In questa sezione del protocollo discuterà solo specifiche legate alla cattura di cellule di Purkinje per la successiva sequenza di RNA. Questa sezione si presuppone che l'utente abbia familiarità con il microscopio di acquisizione laser UV e il software affiliato.

1. Pulire il tavolino del microscopio e la raccolta di tappo braccio con decontaminazione RNasi.
2. Con le mani guantate, posizionare il vetrino sul microscopio e 500 μL opaco tappo nel braccio insieme.
   Nota: Sempre garantire la corretta tecnica di RNA di pulizia dell'area di lavoro con decontaminazione RNasi e utilizzare mani inguantate mentre si tocca la diapositiva o il cappuccio di colore opaco. Guanti possono essere rimossa dopo lo scivolo e il cappuccio sono in atto e laser capture ha avviato.
3. A basso ingrandimento, allineare il cappuccio opaco con il tessuto cerebellare, assicurando che il tappo copre tutta l'area visualizzata dell'oculare.
   Nota: Solo l'oculare del microscopio mostrerà se il cappuccio opaco è centrato. La fotocamera non mostrerà se il tappo è centrato sopra il tessuto. Secondo il disegno di ambito di acquisizione laser, la visualizzazione attraverso il tappo opaco sarà nel pezzo occhio solo o visualizzato nella parte dell'occhio e macchina fotografica.
4. Visualizzare gli strati cerebellari con 5x - 10x diametro obiettivo e posizionare il cursore sopra la sezione intersezione tra strato molecolare e strato delle cellule del granello (lo strato delle cellule di Purkinje).
5. Spostare a 40x e visualizzare le cellule di Purkinje.
   Nota: Per effetti grafici di esempio, vedere Figura 1 e Figura 2 .
6. Iniziare a catturare le cellule di Purkinje.
   Nota: Per eseguire la sequenza di RNA, almeno 5 ng di RNA è necessaria. Circa 1600 – 2000 Purkinje cellule causare abbastanza materiale di RNA per il sequenziamento. RNA sarà stabile per fino a 8 h al microscopio. Test di energia UV e UV concentrazione prima della raccolta che i livelli siano corretti. Nel corso del tempo, il tessuto continuerà ad asciugare e l'energia UV e UV potrebbe essere necessario essere modificato.

10. RNA collezione post LCM

1. Preparare il tampone di lisi delle cellule (preparare fresco ogni volta)
   1. Diluire 2-mercaptoetanolo in tampone di Lisi a 1: 100 (10 mL di μL:1, rispettivamente). Buffer di lisi (RLT) è fornito in Tabella materiali (#14 e #15).
2. Aggiungere 50 μL di tampone di lisi delle cellule al tappo opaco, con il tappo rivolto verso l'alto. Chiudere accuratamente il tubo sopra il tappo.
3. Lasciare il tubo capovolto per 1 min.
4. Vortice del tubo per 30 s e ruota velocemente il buffer di lisi alla parte inferiore del tubo.
5. Riaprire il tubo e ripetere i passaggi da 10.2-10.4.
6. Collocare la provetta contenente 100 μL di tampone di lisi e RNA dal congelatore-80 ° C fino a quando tutti i campioni sono finito e pronto per l'estrazione di RNA (Tabella materiali #14).

Representative Results

Questo protocollo dettaglia i passaggi per la preparazione del tessuto di cervello umano fresco congelato post mortem per UV-LCM. Le annotazioni e le specifiche approfondite sono riportate per il taglio di criostato, come può essere difficile da tagliare del tessuto di cervello congelato fresco con un elevato grado di precisione. Il punto più importante da considerare è che il tessuto congelato fresco è estremamente freddo e richiede una notevole quantità di tempo per ambientarsi alla temperatura più calda di un criostato. Questo passaggio non può essere affrettato e non può essere sopravvalutata come centrale questo passaggio è il successo o il fallimento di questo protocollo. Se il tessuto non è preparato correttamente al criostato, tutti i tentativi successivi all'individuazione di cellule o regioni di interesse sarà molto difficili, se non impossibile.

A seguito di sezionamento del criostato e tempo di asciugatura assegnato, il tessuto è pronto per LCM. Quando visualizzare il tessuto sotto il microscopio, gli strati cellulari del cervelletto sono facilmente visibili con 5 X 10 X lenti dell'obiettivo. La figura 1 Mostra immagini rappresentative del tessuto fissati in etanolo unica (Figura 1A) e tessuto incubati in xilene seguendo la fissazione dell'etanolo (Figura 1B). Abbiamo rigorosamente testato vari tempi di incubazione di etanolo e xilene / temperature sulla capacità di entrambi difficoltà e visualizzare il tessuto. Se il tessuto non viene incubato abbastanza a lungo in xilene, l'immagine risultante assomiglierà più strettamente nella figura 1A, piuttosto che Figura 1B. Cause di incubazione di xilene delinea il tessuto a diventare più scura e più strati cellulari che fa etanolo da solo. Quando si tagliano al microscopio laser capture, la lente dell'obiettivo 40 X è necessaria per assicurarsi di catturare solo le cellule di Purkinje e non il tessuto circostante. Incubazione in xilene produce una qualità elevata, immagine morfologicamente intatto (Figura 1D) rispetto alla sola fissazione dell'etanolo (Figura 1C).

Per migliorare ulteriormente la visualizzazione del nostro tessuto, abbiamo verificato la capacità di coprire i vetrini di un cappuccio di colore opaco. Altri protocolli di UV-LCM utilizzano un liquido tappo riempito di un tubo di 200 – 500 μL che dissolve il tessuto a contatto. Tappi riempiti liquidi possono ridurre la visualizzazione del tessuto, causando l'immagine risultante sia granulari e iridescente al microscopio (Figura 2A). Visualizzazione di tessuto attraverso i risultati di cappuccio opaco (Figura 2B) in un aspetto levigato tessuto che è più morbido e più nitide in forma. In particolare, il cappuccio opaco permette di collezione fino a 8 h senza la necessità di sostituzione. Immagini rappresentative delle cellule di Purkinje asportate a bassa potenza (Figura 2C) e ad alta potenza (Figura 2D, E) mostrano rimozione precisa del proprio corpo delle cellule di Purkinje. Figura 2F viene mostrata per riferimento, un Luxol Fast blu / ematossilina ed eosina (LH & E) tinto corteccia cerebellare, che in particolare mette in evidenza i diversi strati del cervelletto e il posizionamento delle cellule del Purkinje alle molecolare strato e delle cellule del granello strato giustapposizione.

Lo scopo del presente protocollo è di ottenere alta qualità RNA per la successiva sequenza di RNA. Abbiamo testato il nostro protocollo su sei campioni di diversi post mortem del cervello umano, che ha subito tre giorni di LCM per raccogliere le cellule di 1500 – 2000 per l'estrazione di RNA. Circa 6 – 8 h al microscopio prodotto 500 – 700 cellule, che sono state quindi combinate con i prodotti di LCM giorni precedenti prima dell'estrazione di RNA. I campioni hanno subito l'estrazione di RNA e sono stati risospesi in 14 μL di acqua RNAsi-libera (Tabella materiali #14). Tutti e sei i campioni prodotto RNA di alta qualità, con RNA integrità numeri (RINs) ≥ 8 (Figura 3A-F). Questa procedura ha provocato la quantità di RNA di 11.5 ng (Figura 3A), 8,3 ng (Figura 3B), 13,6 ng (Figura 3C), 11.5 ng (Figura 3D), 14,9 ng (Figura 3E) e 26,9 ng (Figura 3F). Di nota è che tutti i campioni di cervello umano post mortem sono stati testati per la qualità di RNA prima del LCM (tabella 1). Se il campione di origine ha degradazione del RNA, LCM peggioreranno solo ulteriormente l'integrità.

Figura 1 : Strati cerebellari e visualizzazione delle cellule di Purkinje con e senza trattamento di xilene. Immagini rappresentative con e senza xilene seguendo la fissazione dell'etanolo e la disidratazione. Lo strato molecolare (ML) e strato delle cellule del granello (GCL) sono etichettati. Cellule di Purkinje sono contrassegnate con le frecce. (A), 5 X rappresentazione di visualizzazione livello cerebellare senza xilene. Barra della scala: 10 µm. (B) 5 X rappresentazione di visualizzazione livello cerebellare con xilene. Barra della scala: 10 µm. (C) 40 X rappresentanza di visualizzazione livello cerebellare senza xilene. Barra della scala: 1 µm. (D) rappresentazione X 40 di visualizzazione livello cerebellare con xilene. Barra della scala: 1 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Visualizzazione delle cellule di Purkinje prima e dopo il LCM. Immagini rappresentative a 40x con xilene seguendo la fissazione dell'etanolo e la disidratazione. Il ML e GCL sono etichettati. Cellule di Purkinje sono contrassegnate con le frecce. (A) visualizzazione al microscopio sotto liquido riempito tappo a 40x. Barra della scala: 1 µm. (B) visualizzazione al microscopio sotto insieme opaco tappo a 40x. Barra della scala: 1 µm. (C), 5 X visualizzazione della corteccia cerebellare mostrando le cellule di Purkinje asportate tra ML e GCL. Barra della scala: 10 µm. (D) 40 X visualizzazione di una cellula di Purkinje prima dell'asportazione. Barra della scala: 1 µm. (E) visualizzazione X 40 di cattura di successo delle cellule di Purkinje. Barra della scala: 1 µm. (F), 20 X rappresentante LH & la E macchiate corpi di cellule di Purkinje nel cervelletto visualizzando con frecce contrassegnate. Barra della scala: 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Campioni di RNA controllo qualità Bioanalyzer risultati di LCM. Pannelli A-F Visualizza rappresentante letture di controllo di qualità di RNA. Ogni pannello è un esempio diverso che ha subito lo stesso processo di LCM di fissazione e visualizzazione con etanolo e xilene solo. Numeri di RNA integrità (RINs) sono tutti > 8.0. Risultato di [] concentrazioni rappresentative in una resa di almeno 5 ng di RNA totale. Tutti i campioni sono stati eluiti in 14 µ l di acqua RNAsi-libera. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Campione	RIN - sezione Prep	RIN - LCM	[RNA] - LCM	PMI-congelato
A	9.2	8.6	822 pg / µ l	min 450
B	9,8	8	598 pg / µ l	550 min
C	9.1	8.5	976 pg / µ l	455 min
D	9,8	8.2	823 pg / µ l	463 min
E	9,8	9.1	1069 pg / µ l	1139 min
F	9.6	8.3	1923 pg / µ l	1080 min

Tabella 1: Sintesi di RNA integrità . Esempio numeri corrispondono ai risultati bioanalyzer presentati in Figura 3. Preparazioni di sezione vengono eseguite prima del LCM per garantire che a partire del tessuto è di buona qualità. Mostrati sono il tessuto originale RINs da sezione preps, LCM RINs e la concentrazione di RNA da LCM, come pure gli intervalli post mortem per congelati (PMI-congelati) per i tessuti.

Discussion

Il protocollo presentato qui è specificamente modificato per essere un approccio inox nel visualizzare tessuti morfologicamente distinte per UV-LCM. Questo metodo è progettato per massimizzare l'integrità di RNA per successivo sequenziamento diretto di RNA, pur mantenendo un livello avanzato di visualizzazione del tessuto. La capacità di distinguere diversi tipi di cellule per la cattura, per creare la popolazione più pura delle cellule possibili, è essenziale per la comprensione di diversi profili molecolari in tessuti umani¹⁵. Nell'ambito del presente protocollo, selezione del tessuto è di primaria importanza, come l'uso dell'antigene o tintura reagenti specifici non vengono utilizzati e pertanto non è adatti per gli studi che richiedono tale differenziazione. Mentre questa è una limitazione di questo protocollo, la visualizzazione del tessuto risultante e l'integrità del RNA sono abbastanza superiore e mantenere la pertinenza in altri disegni sperimentali. Molti altri protocolli esistano che utilizzano anche metodi alternativi di colorazione specificamente per UV - e IR-LCM con l'intento di preservare RNA. Tuttavia, la maggior parte dei altre metodi contengono almeno una macchiatura o antigene specifico reagente^6,16,17, sono progettati per un tipo di cellula o organo (che non sono tessuto di autopsia umana)^{18,19, 20}, o richiedono specializzati RNA-seq kit per migliorare l'integritಹ. Macchiatura di cresyl violet (Nissl) è un colorante popolare contenente il reagente utilizzato in molti protocolli, in quanto le macchie di nuclei di neuroni nel cervello e causa la minor quantità di RNA degradazione⁶. Tuttavia, il più grande nucleo della cellula di Purkinje non è ben macchiato di viola di cresyl, non fornire alcun beneficio significativo per la visualizzazione di cellule di Purkinje. D'importanza, abbiamo identificato un solo studio di LCM nella letteratura descritto l'insieme delle cellule di Purkinje umane, che sono di notevole interesse per lo studio delle malattie degenerative e dello sviluppo cerebellare. Questo studio tinto tessuti congelati con la viola di cresyl e isolato le cellule di Purkinje con un sistema di IR-LCM; campione RINs basse come 5 sono stati utilizzati ma giudicate accettabili per microarray analisi²². Pertanto, questo è il primo studio di protocollo che è stato progettato specificamente per l'alta qualità RNA da cellule di Purkinje nel cervelletto umano post mortem asportato via UV-LCM.

La stabilità del RNA nel tessuto umano post mortem è un ostacolo ben noto, come molecole di RNA all'interno delle cellule sono piuttosto soggetti a decadimento naturale dopo la morte. In particolare, il mRNA ha dimostrato di essere i più sensibili alla degradazione di nucleolitico⁵. Tempo di congelazione (PMI-congelate) è una metrica che ha mostrato qualche correlazione alla degradazione del RNA in alcuni studi^23,24,25, controllare l'intervallo post mortem (PMI). Tuttavia, la tabella 1 Mostra i nostri intervalli PMI-congelati per i sei campioni illustrati nella Figura 3, che non indica nessuna relativa correlazione con PMI valori e qualità di RNA. Pertanto, è necessario eseguire dovuta diligenza nel controllo dell'integrità di RNA prima di iniziare un progetto di acquisizione laser. Se l'integrità del RNA del campione iniziale è di bassa qualità, il RNA risultante da un prodotto di LCM sarà di qualità ancora più bassa. Quando bassa integrità di RNA non può essere evitato, potrebbero essere utilizzati altri metodi per migliora RNA per il sequenziamento oltre questo protocollo²¹. In particolare, RNA basso input o degradato può portare a complessità tenui e risultati non ottimali che spesso richiedono passaggi di amplificazione aggiuntiva. L'aggiunta di cicli PCR per l'amplificazione ha dimostrato di amplificare sequenze diversamente, come pure di creare duplicati di lettura su sequenziamento^26,27. Pertanto, l'utilizzo di alta qualità RNA dai campioni di LCM per il sequenziamento è molto vantaggioso.

Il metodo di visualizzazione impiegato pesantemente in questo protocollo si basa sull'utente di competenza quando taglio fresco congelato del tessuto su un criostato. Il protocollo entra in dettagli esaurienti su come prepararsi al meglio il tessuto per il sezionamento e posizionare il tessuto sulla diapositiva. Queste sono senza dubbio le due fasi più critiche del presente protocollo. Se il tessuto non è acclimatato alla temperatura criostato, triturazione si verificherà, che ostacola in modo significativo la qualità morfologica del tessuto. La triturazione è il risultato di alcuni problemi potenziali; risoluzione dei problemi le possibilità includono attesa più lungo per il tessuto a temperatura o alterare il criostato OT e/o CT a una gamma più calda. Una volta che il tessuto è stato tagliato con successo e disposto sulla fase, è importante orientare il tessuto e la diapositiva correttamente per garantire tutto il tessuto si inserisce all'interno della membrana e possa essere prelevata con precisione dal palco. Quando si tenta di raccogliere il tessuto dal palco criostato, il tessuto deve essere freddo, e la diapositiva dovrebbe essere calda. Protocolli alternativi esistono che consigliamo per raffreddare la diapositiva prima raccogliendo il tessuto e riscaldato con un dito sopra la zona di tessuto posizionamento²⁸; Tuttavia, nelle nostre mani, questo non fornisce alcun beneficio e spesso causa difficoltà nel far salire il tessuto e le pieghe del tessuto in eccesso. Con una diapositiva a temperatura ambiente, il tessuto si scioglie immediatamente a contatto con la diapositiva. Per garantire un pulito pick-up, è necessario di angolo della diapositiva in modo che entra in contatto con il tessuto presso l'area della membrana, ma non andare così lontano da toccare lo stesso palcoscenico. La membrana inizierà a staccarsi dal vetrino se tocca la fase, che danneggia la membrana e rende difficile cattura del laser. In questo caso, sarà evidente una volta LCM è iniziata e non può essere annullata. Opzioni di risoluzione dei problemi sono limitati; Se in qualsiasi momento si pensa la membrana o la diapositiva sono stati compromessi, è saggio di disfarsi. Si raccomanda di pratica tessuto congelato fresco sezionamento prima dell'avvio di un progetto o con un nucleo di patologia che può produrre alta qualità tessuto sezionamento. Tuttavia, se si utilizza un servizio di base, assicurarsi che la tecnica corretta di RNA sia seguita per prevenire la contaminazione RNasi. Degradazione del RNA prontamente può verificarsi quando viene utilizzata la tecnica impropria.

Abbiamo presentato qui un metodo completo per inox visualizzazione delle cellule di Purkinje nel cervelletto umano post mortem ai fini della UV-LCM. Abbiamo inserito anche i metodi di conservazione corretta di RNA e tecniche per garantire alti livelli di integrità di RNA. Questo protocollo non è necessariamente specifico per ogni cellula o tessuto tipo ma non mantenere il requisito che la regione/cella di interesse è morfologicamente distinguibile dallo stroma circostante senza l'esigenza di riconoscimento specifico antigene o tintura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MembraneSlide NF 1.0 PEN	Zeiss	415190-9081-000	Membrane slides for tissue. We do not recommend using glass slides.
AdhesiveCap 500 Opaque	Zeiss	415190-9201-000	Opaque caps are used to enhance visualization on inverted scopes only
RNase Away	Molecular BioProducts	7005-11	Other RNase decontamination products are also suitable. Use to clean all surfaces prior to work.
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	If using alternative Ethanol, ensure high quality. Essential for tissue fixation.
Xylenes (Certified ACS)	Fisher Scientific	X5P-1GAL	If using alternative xylene, ensure high quality. Essential for tissue visualization.
UltraPure Distilled Water	Invitrogen	10977-015	Other RNA/DNA/Nuclease free water also suitable. Utilized in ethanol dilution only.
Slide-Fix Slide Jars	Evergreen	240-5440-G8K	Any slide holder/jar is also suitable. Must be cleaned prior to use. Used for fixation following sectioning.
Anti-Roll Plate, Assy. 70 mm 100 μm	Leica Biosystems	14041933980	Anti-roll plate type is determined by type of cryostat and attachment location on stage. All cryostats have differing requirements.
Diethyl pyrocarbonate (DEPC)	Sigma Aldrich	D5758-50mL	DEPC from any vendor will do. Follow directions for water treatment.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Kimwipes can be ordered from any vendor and used at any size. Kimwipes are to be used to clean microscope and cryostat.
Tissue-Plus O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Any brand of OCT is acceptable. No tissue will be embedded in the OCT, it is strickly to attach tissue to 'chuck'.
Edge-Rite Low-Profile Microtome Blades	Thermo Scientific	4280L	Blade type is determined by type of cryostat. All cryostats have differing requirements.
Leica Microsystems 3P 25 + 30MM CRYOSTAT CHUCKS	Fisher Scientific	NC0558768	Chuck type is determined by type of cryostat. All cryostats have different requirements. Either size is suitable.
RNeasy Micro Kit (50)	Qiagen	74004	Required for RNA extraction post LCM. RLT Lysis buffer essential to gather captured cells from opaque cap.
RNeasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104	Required for RNA extraction of section preps, which are performed prior to LCM to test RNA integrity of starting tissues.
RNase-Free DNase Set	Qiagen	79254	Dnase will remove any DNA to allow for a pure RNA population. Ensure Dnase is made fresh.
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250-100ML	Purchased volume at user discretion. Necessary for addition to RLT buffer for cell lysis. Prevents RNase activity.
Globe Scientific Lot Certified Graduated Microcentrifuge Tube (2 mL)	Fisher Scientific	22-010-092	Any 2 mL tube that is RNase free, DNase free, human DNA free, and Pyrogen free will do.