Summary
Ex vivo-kulturen af knogleexplanter kan være et værdifuldt redskab til undersøgelse af knoglefysiologi og den potentielle evaluering af lægemidler i knogleremodellering og knoglesygdomme. Den præsenterede protokol beskriver forberedelse og kultur af calvarias isoleret fra nyfødte mus kranier, samt dens anvendelser.
Abstract
Bone er en bindevæv består af osteoblaster, osteocytter, og osteoklaster og en mineraliseret ekstracellulær matrix, som giver det sin styrke og fleksibilitet og gør det muligt at opfylde sine funktioner. Bone er konstant udsat for en række stimuli, som i patologiske forhold kan deregulere knogle remodeling. For at studere knoglebiologi og -sygdomme og evaluere potentielle terapeutiske midler har det været nødvendigt at udvikle in vitro- og in vivo-modeller.
Dette manuskript beskriver dissektionsprocessen og dyrkningsbetingelserne for calvarier isoleret fra neonatale mus for at studere knogledannelse og knogletumormikromiljøet. I modsætning til in vitro og in vivo modeller, denne ex vivo model giver bevarelse af de tre-dimensionelle miljø af vævet samt cellulære mangfoldighed af knoglen, mens dyrkning under definerede betingelser for at simulere den ønskede mikromiljø. Derfor er det muligt at undersøge knoglerremodellering og dens mekanismer samt samspillet med andre celletyper, såsom samspillet mellem kræftceller og knogler.
De analyser, der rapporteres her, bruger calvarias fra 5-7 dage gamle BALB/C mus. De opnåede hemi-calvarier dyrkes i nærværelse af insulin, brystkræftceller (MDA-MB-231), eller konditioneret medium fra brystkræft cellekulturer. Efter analyse blev det fastslået, at insulin induceret ny knogledannelse, mens kræftceller og deres konditionerede medium induceret knogle resorption. Den calvarial model er blevet anvendt med succes i grundforskning og anvendt forskning til at studere knogleudvikling og kræft-induceret knoglesygdomme. Samlet set er det en glimrende mulighed for en nem, informativ og billig analyse.
Introduction
Bone er en dynamisk bindevæv, der har flere funktioner, herunder støtte musklerne, beskytte de indre organer og knoglemarv, og lagring og frigivelse af calcium og vækstfaktorer1,2. For at bevare sin integritet og korrekte funktion, knoglevæv er løbende under processen med remodeling. Generelt kan en cyklus af knogleremodellering opdeles i knogleresorption og knogledannelse1. En ubalance mellem disse to faser af knogleremodellering kan føre til udvikling af knoglepatologier. Også, sygdomme som brystkræft ofte påvirker knogleintegritet; ca. 70 % af patienterne på fremskredne stadier har eller vil have knoglemetastaser. Når brystkræftceller kommer ind i knoglerne, påvirker de knoglestofskiftet, hvilket resulterer i overdreven resorption (osteoklastiske læsioner) og/eller dannelse (osteoblastiske læsioner)3.
For at forstå biologi knoglesygdomme og udvikle nye behandlinger, er det nødvendigt at forstå de mekanismer, der er involveret i knogle remodeling. I kræftforskning er det vigtigt at undersøge knoglemetastaseprocessen og dens relation til det metastatiske mikromiljø. I 1889, Stephen Paget hypotese, at metastaser opstår, når der er kompatibilitet mellem tumorceller og målvæv, og foreslog, at det metastatiske sted afhænger af affinitet af tumoren for mikromiljøet4. I 1997 introducerede Mundy og Guise begrebet "ond cirkel af knoglemetastaser" for at forklare, hvordan tumorceller ændrer knoglemikromiljøet for at opnå deres overlevelse og vækst, og hvordan knoglemikromiljøet fremmer deres vækst ved at give calcium og vækstfaktorer5,6,7.
For at karakterisere de mekanismer, der er involveret i knogleremodellering og knoglemetastase og til at evaluere molekyler med muligt terapeutisk potentiale, har det været nødvendigt at udvikle in vitro og in vivo modeller. Men disse modeller i øjeblikket præsenterer mange begrænsninger, såsom den forenklede repræsentation af knoglemikromiljø, og deres omkostninger8,9. Kulturen af knogle explants ex vivo har den fordel at opretholde den tre-dimensionelle organisation samt mangfoldigheden af knogleceller. Desuden kan forsøgsbetingelser styres. Den explant modeller omfatter kultur af metatarsal knogler, lårbenshoveder, calvarias, og mandibulære eller trabecular kerner10. Fordelene ved ex vivo-modellerne er blevet påvist i forskellige undersøgelser. I 2009 rapporterede Nordstrand og samarbejdspartnere etableringen af en coculture model baseret på samspillet mellem knogle-og prostatakræft celler11. Også, i 2012, Curtin og samarbejdspartnere rapporterede udviklingen af en tre-dimensionel model ved hjælp af ex vivo cocultures12. Formålet med sådanne ex vivo-modeller er at genskabe forholdene i knoglemikromiljøet så nøjagtigt som muligt for at kunne karakterisere de mekanismer, der er involveret i normal eller patologisk knoglersremodellering, og vurdere effekten af nye terapeutiske midler.
Denne protokol er baseret på de procedurer, der er offentliggjort af Garrett13 og Mohammad et al.14. Neonatal mus calvaria kulturer er blevet brugt som en eksperimentel model, da de bevarer de tre-dimensionelle arkitektur af knoglen under udvikling og knogleceller, herunder celler på alle stadier af differentiering (dvs. osteoblaster, osteoklaster, osteocytter, stromale celler), der fører til modne osteoklaster og osteoblaster, samt mineraliserede matrix14. Ex vivo-modellen repræsenterer ikke den patologiske proces med knoglesygdomme helt. Men, virkninger på knogle remodeling eller kræft-induceret knogleosteolyse kan måles nøjagtigt.
Kort sagt består denne protokol af følgende trin: dissektion af calvarier fra 5-7 dage gamle mus, calvariaprækultur, calvariakulturapplikationer (f.eks. kultur i nærvær af insulin, kræftceller eller konditioneret medium, og selv terapeutiske potentiale, i henhold til formålet med undersøgelsen), knoglefiksering og calvaria afkalkning, vævsbehandling, histologisk analyse, og resultatfortolkning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus, der anvendes i disse analyser, blev fremstillet af BALB/c musstammer, der anvendte han- og hunmus vilkårligt. Tidligere dyrkningsforsøg er også blevet udført ved hjælp af andre stammer, såsom FVB, schweiziske mus, CD-1, og CsA mus11,12,14. Alle mus blev opstaldet i henhold til National Institutes of Health (NIH) retningslinjer, tillæg Q. Procedurer, der involverer dyreforsøg er blevet godkendt af Institutional Animals Care and Use Committee (IACUC) ved Center for Videnskabelig Forskning og Videregående Uddannelse på Ensenada (CICESE).
1. Calvarial dissektion
- Steriliserdissektionsinstrumenter (f.eks. 1 x 2 tændervævspincet, lige kirurgiske sakse, dissekere saks, finttippede pincet, fine buede spidsdisseker pincet, dissekere pincet, skalpel). Sterilt destilleret vand kan bruges til at rengøre det kirurgiske værktøj mellem hver dissektion, og steril1x PBS kan bruges til rengøring af hver hemi-calvaria.
- De sterile dissektionsinstrumenter, vand, 1x PBS, og de nødvendige materialer skal udføre proceduren (f.eks. mikropipetter, bundfaldsglas, sterile petriskåle) i en laminarflowhætte.
BEMÆRK: Udfør hele proceduren under sterile forhold. - Der tilsættes 12 ml steril 1x PBS i to 10 cm petriskåle.
- Vælg hvalpene og placere dem i nærheden af hætten.
BEMÆRK: Dissekere calvarias fra 5-7 dage gamle hvalpe. - Pluk og hold musen forsigtigt ved hjælp af dissekere pincet.
- Tag musen med en dissekeret saks af og læg hovedet i en petriskål med PBS.
BEMÆRK: Halshugning er ikke egnet til ældre mus. Hvis forsøget skal udføres med ældre mus, bør metoden til aktiv dødshjælp ændres i henhold til reglerne for dyreforsøg. - Hold hovedet fast ved næseområdet med 1 x 2 tænder væv pincet og fjern huden over kraniet, indtil calvaria er synlig.
- Identificer suturerne (dvs. sagittal, koronar og lambdoid) af kraniet på den eksponerede calvaria.
- Trænge ind med spidsen af mikrosaks ca 2 mm bag lambdoid sutur og lave et lige snit ved siden af det.
- Sæt spidsen af mikrosaks på bagsiden af kraniet. Lav et lige snit langs den distale side af lambdoid sutur mod koronale sutur. Fortsæt på samme måde med den anden lambdoid sutur.
- Lav et andet snit (i en vinkel på 45°) for at forbinde enden af snittet, der er lavet med snittet af den forankteriorske fontanel.
- Gentag trin 1.10 og 1.11 med den anden lambdoid sutur.
BEMÆRK: Det er vigtigt at identificere suturerne for at foretage passende nedskæringer og være i stand til at udføre tilstrækkelig indlejring og dataanalyse. - Brug fine spids pincet til at fjerne calvaria og læg den i en petriskål. Med en skalpel, lave et lige snit fra den bageste fontanel langs sagittal sutur gennem koronale sutur og slutter i den anterior fontanel at opnå to hemi-calvarias.
- Saml hver af de hemi-calvarias med fine-tippet pincet og læg dem i en ny petriskål indeholdende PBS.
2. Calvaria kultur
- Der tilsættes 1 ml DMEM-medium med høj glukose suppleret med 0,1% bovinserumalbumin (BSA) og 1% antimyskotisk (dvs. penicillin og streptomycin) i brøndene på en 24 brøndplade. Med fine-tip pincet, afhente hver hemi-calvaria og placere den i en brønd.
BEMÆRK: Læg hemi-calvarias konkave side ned. - Hæmiskoier i 24 timer ved 37 °C med 5 % CO2.
- Kulturmediet fjernes fra hver brønd, og der tilsættes 1 ml friske medier, der indeholder forbindelsen, for at teste eller konditionere medier fra andre celler.
BEMÆRK: Brug mindst tre hemi-calvarier til hver behandlingsgruppe, og brug negative og positive kontroller. - Inkuber hemi-calvarias i 7 dage, ændre medierne hver 2-3 dage.
3. Kultur med kræftceller
- Vælg en petriskål med kræftceller ved 80-90% sammenløb og trypsinize dem. For at trypsinisere vaskes kræftcellerne 1x med PBS (5 ml pr. 75 cm2 kolbe) efterfulgt af inkubation i en HBSS-opløsning indeholdende 0,05% trypsin og 0,53 mM EDTA (2 ml pr. 75 cm2 kolbe).
- Cellesuspensionen overføres til et konisk 15 ml rør og centrifugeres ved 800 x g i 5 min ved stuetemperatur (RT).
- Fjern og kassér supernatanten.
- Resuspender pellet i 2 ml DMEM indeholdende 2% føtal kvæg serum (FBS) og 1% antimykotisk. Tæl levende celler.
- Tildel hemi-calvarier til hver studiegruppe (dvs. den negative kontrol- og samkulturgruppe til RNA- eller histologianalyse).
- Fjern kulturmedierne fra hemi-calvarias og tilsæt 1 ml DMEM indeholdende 2% FBS og 1% antimykotisk suppleret eller ikke suppleret med kræftceller.
BEMÆRK: Mængden af celler, der skal tilføjes, kan ændre sig afhængigt af den testede cellelinje. Med kræftceller som MDA-MB-231 eller PC-3, 500.000 celler pr godt arbejde korrekt. - Der inkuberes i 24 timer ved 37 °C med 5 % CO2. Pass hver hemi-calvaria til en ny brønd til at bevare kun kræftceller, der overholdt knoglevævet.
- Inkuber i 7 dage ved 37 °C med 5% CO2 og skift mediet hver 2-3 dage.
4. Fiksering
- Skær firkanter af silkepapir til wrap hemi-calvarias.
BEMÆRK: Biopsi skum puder eller stål kapsler til små biopsier kan også anvendes. - Brug lige fine-tip pincet til at afhente hver hemi-calvaria fra sagittal sutur, sted på et silkepapir, og wrap.
- Placer indpakket hemi-calvaria inde i en mærket indlejring kassette.
- Læg kassetten i en beholder med 10% fosfat-buffered formalin.
- Ihændehaver i 24 timer ved 4 °C.
5. Afkalkning
- Fjern formalin, tilsæt 1x PBS, og agitere væv i 30 min at skylle hemi-calvarias.
- Fjern PBS og tilsæt 10% EDTA (pH = 8, 0,34 M).
BEMÆRK: Kontroller, at opløsningen dækker vævet helt. - Afkalk eiblet vævet i 48 timer ved 4 °C.
- Edta-opløsningen kasseres, og 1x PBS tilsættes for at skylle vævet.
- Opbevar hemi-calvarias i 70% ethanol indtil histologiforarbejdningen.
6. Vævsbehandling
- Dehydrere råret med runder på 96% ethanol, 60 min (3x), efterfulgt af 100% ethanol, 60 min (3x).
- Reer ethanolen med 100% xylen, 60 min (3x).
- Inkuberkassetterne i paraffin, 60 min (2x).
7. Integrering
- Åbn kassetter, forsigtigt fjerne silkepapir, og pak calvariaen ud.
- Pick up hver calvaria omhyggeligt og stak alle hemi-calvarias fra samme gruppe i samme retning.
- Sæt nogle paraffin i en støbeform.
- Pick up alle hemi-calvarias med pincet og placere dem inde i formen med sagittal sutur ned mod bunden af formen.
BEMÆRK: Orientering af hemi-calvarias i formen under inklusion er afgørende for at opnå konsekvent histologiske sektioner og reproducerbare resultater, fordi denne orientering vil tillade bageste identifikation af de forreste og parietale knogler fra calvarias og koronalsuturen, der letter den kvantitative vurdering. - Slip pincet og kontrollere, at hemi-calvarias ophold på plads.
- Placer den mærkede kassette oven på formen og fyld den med mere paraffin til at dække hemi-calvarias.
- Flyt formene til den kolde overflade.
8.
- Trim 500-600 μm af sagittal sutur med mikrotom.
- Skær 4 μm tykke sektioner, og saml de nødvendige sektioner.
- Trim yderligere 300 μm.
- Skær og saml yderligere seks 4 μm tykke sektioner.
- Trim blokken 300 μm yderligere og indsamle flere sektioner.
- Monter sektionerne på glasmikroskopobjektglas.
- Tør objektglassene på RT.
9. Farvning
- Nedsænk sektionerne i 100% xylen i 3 min.
- Nedsænkes i 100% ethanol i 1 min.
- Flet i 96% ethanol i 1 min.
- Fordyb i 80% ethanol i 1 min.
- Nedsænkes i 70% ethanol i 1 min.
- Skyl i vand i 3 min.
- Nedsænkes i hæmatoxylin i 3 min.
- Skyl i vand, indtil sektionen er klar.
- Nedsænkes i en mættet lithiumcarbonatopløsning i 10 sek.
- Skyl i vand i 3 min.
- Nedsænkes i 96% ethanol i 1 min.
- Nedsænk i eosin i 3 min.
- Nedsænk i 96% ethanol i 1 min.
- Nedsænkes i 100% ethanol i 1 min.
- Neddykkes i 100% xylen i 3 min.
- Tilføj nogle pr monteringsmedium til diaset og beskyt den med en dækslæbe.
BEMÆRK: Du kan supplere hæmatoxylin og eosin (H & E) farvning med tartrat-resistentsyre phosphatase (TRAP) farvning til at evaluere osteoklast og osteolyse.
10. Kvantitativ vurdering: definition af analyseområde
- Undersøg sektionerne under lav effekt (dvs. 4x) for at identificere retningen og suturerne.
- Definer koronal sutur og identificere den lange knogle overflade på den ene side og den korte overflade på den anden.
- Identificer koronal sutur under 40x forstørrelse, og flytte to eller tre optiske felter væk fra suturen langs den lange overflade. Tag billeder af dette område til analyse.
- Definer det gamle knogleområde og det nye knogleområde. Den eosin Y med orange G pletter den gamle knogle mørkere og den nye knogle lysere.
- Mål det samlede knogleområde for den gamle og nye knogle med Billed J-software ved hjælp af farvetærskelværktøjet. Resultaterne udtrykkes som μm2.
11. Analyse af data
- Analysér resultaterne ved hjælp af statistisk software. Signifikante forskelle mellem grupperne kan bestemmes ved hjælp af passende test (f.eks. nonparametrisk Mann-Whitney U-test, som det gøres herel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at vurdere knogledannelsen i calvarialmodellen dyrkede vi hemi-calvarias i medier med eller uden 50 μg/ml insulin. Vævsektioner blev forberedt og plettet med H&E. Under disse omstændigheder viste histologien, at den strukturelle integritet af kalvarialknoglen blev opretholdt, hvilket gjorde det muligt at identificere dens forskellige komponenter (figur 1). De calvarier, der blev behandlet med insulin, viste en stigning i mængden af knoglevæv sammenlignet med kontrol (figur 2A). Kvantitativ histomorfometrisk analyse for tykkelse og knogleområde af hæmicalvari bekræftede en signifikant stigning for begge parametre i det insulinbehandlede væv sammenlignet med kontrol (figur 2B). Disse data viser, om ex vivo-modelprotokollen kan reproducere knogledannelsesbetingelser.
Derudover kan calvarial ex vivo-modellen bruges til at reproducere kræft og knogle mikromiljø betingelser. Protokollen blev brugt til at vurdere effekten af brystkræftcellerne MDA-MB-231 på murine calvarias. For at udføre dette, de calvarial knogler blev direkte cocultured med kræftceller eller kulturformeres kun med de betingede medier af kræftcellerne. Efter 7 dages kultur blev calvariaerne indlejret i paraffin, og H&E-farvning blev udført. Samkulturen med MDA-MB-231 brystkræftceller syntes at øge osteolyse, som det fremgår af faldet i knoglen og skaderne på calvarial struktur sammenlignet med kontrol calvarias dyrkes kun med medier (Figur 2A). Knogleområdekvantificering af calvarier viste et signifikant fald i det samlede knogleområde af calvariaerne dyrket med MDA-MB-231 kræftceller sammenlignet med kontrol (figur 2B). Disse resultater viste, at cocultures af kræftceller med kalvarialvæv kan genskabe kræft og knogle mikromiljø og kunne bruges til at undersøge mekanismerne i osteolytisk knogle metastase eller til at vurdere mulige hæmmere af denne proces.
Figur 1: Histologisk struktur af calvarial knoglen. Repræsentativ vævssektion af hemi-calvaria efter H&E-farvning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Insulin øget knoglen område og tykkelsen af hemi-calvarias ex vivo mens samkultur af hæmi-calvarias med MDA-MB-231 brystkræftceller induceret osteolyse. For knogledannelsesmodellen blev hæmi-calvarias dyrket i tilstedeværelse eller fravær af insulin (50 μg/ml), mens hemi-calvarias dyrkede i nærvær eller fravær af 5 x 105 MDA-MB-231 celler i 7 dage, og histomorfrisk analyse blev udført på H&E-farvede sektioner. AA) Repræsentative vævssektioner. bB) Histomorfometrisk analyse af knogleområdet. Resultaterne er repræsenteret som den gennemsnitlige ± SEM (n = 3). * P < 0,05, nonparametrisk Mann-Whitney U test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi protokollen for en calvarial ex vivo model til at evaluere knogledannelse eller resorption og til at studere samspillet mellem kræftceller med calvarial museknogle. De kritiske trin i denne teknik er dissektion, kultur, indlejring, og histomorfeanalyse af calvarias. Under dissektion af calvarias, er det afgørende at skære hemi-calvarias i en trapez, da det kraftigt vil lette orientering under paraffin optagelse. Når man studerer kræft celle interaktioner med calvarias, Er det vigtigt at bruge multiwell plader, der ikke behandles for cellekultur for at forhindre kræftceller i at overholde og vokser på plast i stedet for knoglen. Under væv optagelse, er det vigtigt at omhyggeligt orientere hver hemi-calvaria. De skal placeres lodret med sagittalgrænsen på den ydre side af paraffinblokken. Retningen af knoglen er afgørende for at opnå konsekvent histologiske sektioner og reproducerbare resultater. På samme måde er det afgørende for konsistens under histomorfometrisk analyse at definere en bestemt region i calvaria til at måle knogle remodeling. Her identificerede vi først koronalsuturen og derefter den lange knogleoverflade, hvor billederne blev taget, og målingerne blev foretaget.
For at opnå standardisering og udvikle de beskrevne protokoller, har vi ændret nogle etablerede metoder lidt. Under dissektion af hemi-calvarias, PBS blev brugt til at skylle musehoveder i stedet for kultur medier. For at bestemme antallet af celler, der er nødvendige for at producere en effekt på calvarias, blev vævet inkuberet med forskellige antal brystkræftceller. Generelt, 5 x 105 kræftceller fungerer godt for en 7 dages analyse. Også, under fiksering, silkepapir blev brugt i stedet for svampe til at beskytte calvarias. Vævet var velbevaret i papiret.
Den beskrevne model har visse begrænsninger. Calvarias fra neonatal mus mangler nogle af de komponenter i knoglerne, der er modtageren af metastaser, hvad enten strukturelle (dvs. trabecular knogle) eller cellulære komponenter såsom immunceller eller andre celler i knoglemarven, herunder hæmatopoietiske stamceller, kræftceller interagerer med. Kulturen i calvarias in vitro kan ikke simulere hele fysiopatologien. Også, når det kommer til knogle metastaser, brystkræftceller sjældent metastaserer til calvaria, og har tendens til at favorisere knogler med mere aktive knogle remodeling, såsom ryghvirvler, hoften, eller de lange knogler i arme og ben. Udover, samkultur af hæmi-calvarier med kræftceller kun repræsenterer de seneste trin i den metastatiske kaskade: kolonisering af knoglen og væksten af metastase. Desuden er antallet af prøver begrænset af antallet af unger pr. kuld. Det anbefales at bruge et kuld pr. eksperiment og ikke blande kuld for at undgå variationer i resultaterne. Vi opnåede lignende resultater i knogleremodellering ved brug af calvarier fra BALB/c eller FVB-mus, men om stammen påvirker tidsreaktionen af knoglersommodellering i denne analyse, er endnu ikke fastlagt.
De vigtigste fordele ved calvarial ex vivo model i forhold til in vivo modeller omfatter lavere omkostninger, enkelhed af analysen, og kortere eksperimentel tid til at opnå en knogle remodeling svar. Coculture af kræftceller og calvarias giver mulighed for at studere celle-kontakt afhængige interaktioner samt effekten af udskillede faktorer på knogle remodeling, mens brugen af konditionerede medier tillader at fokusere på effekten af opløselige faktorer. Desuden kan den direkte kontakt model lette karakterisering af intercellulære interaktioner og molekylære mekanismer i knoglemetastase mikromiljø, samt undersøgelse og evaluering af nye lægemidler til behandling af skeletkomplikationer af maligniteter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne takker Mario Nomura, MD og Rodolfo Díaz for deres hjælp med histologi, og Pierrick Fournier, Ph.D. for hans værdifulde kommentarer til at forbedre kvaliteten af papiret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well cell culture | Corning | CLS3524 | |
| 24 well non tissue culture | Falcon | 15705-060 | |
| 2 mL cryovial | SSI | 2341-S0S | |
| Antibiotics-Antimycotic | Corning | 30-004-CI | |
| BSA | Biowest | P6154-100GR | |
| Centrifugue | Eppendorf | 22628188 | Centrifuge 5810R |
| Coverslips | Corning | 2935-24X50 | |
| Cytoseal resin | Richard Allen | 8310-10 | |
| DMSO | D2650-100ML | ||
| Dulbecco's Modification of Eagles Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate | Corning | 10-017-CV | |
| Dulbecco's PBS (10X) | Corning | 20-031-CV | |
| Ebedding Cassettes | Sigma | Z672122-500EA | |
| EDTA | Golden | 26400 | |
| Embedding Workstation | Thermo Scientific | A81000001 | |
| Eosin | Golden | 60600 | |
| Ethanol absolute | JALMEK | E5325-17P | |
| Fetal Bovine Serum | Biowest | BIO-S1650-500 | |
| Filters | Corning | CLS431229 | |
| Forceps and scissors | LANCETA HG | 74165 | |
| Formalin buffered 10% | Sigma | HT501320 | |
| Glass slides 25 x 75 mm | Premiere | 9105 | |
| Harris's Hematoxylin | Jalmek | SH025-13 | |
| High profile blades | Thermo Scientific | 1001259 | |
| Histoquinet | Thermo Scientific | 813150 | STP 120 |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma | 16634 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Scope.A1 | |
| Microtome | Thermo Scientific | 905200 | MICROM HM 355S |
| Mouse food, 18% prot, 2018S | Harlan | T.2018S.15 | |
| Neubauer | VWR | 631-0696 | |
| Orange G | Biobasic | OB0674-25G | |
| Paraffin | Paraplast | 39601006 | |
| Paraffin Section Flotation Bath | Electrothermal | MH8517X1 | |
| Petri dish | Corning | CLS430167 | |
| Phloxin B | Probiotek | 166-02072 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Trypsin-EDTA | Corning | 25-051-CI | |
| Wax dispenser | Electrothermal | MH8523BX1 | |
| Xylene | Golden | 534056-500ML |
References
- Boyce, B. Bone biology and pathology. Handbook of Cancer-Related Bone Disease. Coleman, R. E., Abrahamsson, P. A., Hadji, P. , 3-21 (2012).
- Clark, R. K. Anatomy and Physiology: Understanding the Human Body. 474, Jones & Bartlett Learning. (2005).
- Fournier, P. G. J., Juárez, P., Guise, T. A. Tumor-bone interactions: there is no place like bone. Bone Cancer: Primary Bone Cancers and Bone Metastases. Heymann, D. , 13-28 (2014).
- Ribatti, D., Mangialardi, G., Vacca, A. Stephen Paget and the "seed and soil" theory of metastatic dissemination. Clinical and Experimental Medicine. 6 (4), 145-149 (2006).
- Guise, T. A. The vicious cycle of bone metastases. Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 2 (6), 570-572 (2002).
- Mundy, G. R.
- Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 584-593 (2002).
- Chong, S. K. M. Experimental models of bone metastasis: Opportunities for the study of cancer dormancy. Advanced Drug Delivery Reviews. 94 (1), 141-150 (2015).
- Deguchi, T., et al. In vitro model of bone to facilitate measurement of adhesion forces and super-resolution imaging of osteoclasts. Scientific Reports. 6 (22585), 1-13 (2016).
- Marino, S., Staines, K. A., Brown, G., Howard-Jones, R. A., Adamczyk, M. Models of ex vivo explant cultures: applications in bone research. BoneKEY Reports. 5, 818 (2016).
- Nordstrand, A., et al. Establishment and validation of an in vitro coculture model to study the interactions between bone and prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 26 (8), 945-953 (2009).
- Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex vivo cocultures of live calvaria bones and cancer cells. Biomaterials. 33 (4), 1065-1078 (2012).
- Garret, R. Assessing bone formation using mouse calvarial organ cultures. Bone Research Protocols. Helfrich, M. H., Ralston, S. H. , Humana press. Totowa, New Jersey. 183-198 (2003).
- Mohammad, K. S., Chirgwin, J. M., Guise, T. A. Assessing new bone formation in neonatal calvarial organ cultures. Methods in Molecular Biology. 455 (1), 37-50 (2008).
