Este protocolo describe la síntesis y caracterización de un transporte- cyclooctene (TCO)-modifica un radioligando de Lu-labeled tetrazina (Tz) 177para radioinmunoterapia pretargeted (PRIT) y el anticuerpo. Además, detalla el uso de estas dos construcciones en vivo biodistribución y estudios longitudinales de la terapia en un modelo murino de cáncer colorrectal.
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Artículo de método
Radioinmunoterapia pretargeted basada en la reacción de Diels-Alder de demanda electrónica inversa
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Resumen
Resumen
La radioinmunoterapia (RIT) es un enfoque prometedor para el tratamiento del cáncer, la vida media larga farmacocinética de anticuerpos radiactivos puede resultar en altas dosis de radiación a los tejidos sanos. Tal vez no es de extrañar varias estrategias diferentes se han desarrollado para eludir esta limitación preocupante. Uno de los más prometedores de estos enfoques es pretargeted radioinmunoterapia (PRIT). PRIT se basa en disociar el radionúclido de la inmunoglobulina, inyectarlas por separado y luego lo que les permite combinar en vivo en el tejido diana. Este enfoque aprovecha las propiedades excepcionales de tumor targeting de anticuerpos mientras que bordea sus inconvenientes farmacocinéticos, bajar las dosis de radiación a los tejidos no Diana y facilitar el uso de radionúclidos con vidas medias que son considerado demasiado corto para uso en radioimmunoconjugates tradicional. En los últimos cinco años, nuestro laboratorio y otros han desarrollado un enfoque en vivo pretargeting basa en la reacción de Diels-Alder (IEDDA) de demanda electrónica inversa entre transporte- cyclooctene (TCO) y tetrazina (Tz). Esta estrategia se ha aplicado con éxito a pretargeted tomografía por emisión de positrones (PET) y computarizada por emisión de fotón único tomografía (SPECT) proyección de imagen con una variedad de sistemas antígeno-anticuerpo. En un par de publicaciones recientes, hemos demostrado la eficacia de PRIT IEDDA basado en modelos murinos de adenocarcinoma ductal de páncreas y carcinoma colorrectal. En este protocolo, describimos protocolos por PRIT usando un radioligando de 177Lu-DOTA-labeled tetrazina (Lu-DOTA-PEG [177Lu]7- Tz) y una variante modificada de TCO del cáncer colorrectal a anticuerpo huA33 (huA33-TCO). Más concretamente, vamos a describir la construcción de huA33-TCO, la síntesis y de Lu-DOTA-PEG radiolabeling de [177Lu]7- Tz y el rendimiento de biodistribución en vivo y estudios longitudinales terapia en modelos murinos de carcinoma colorrectal.
Introducción
La radioinmunoterapia (RIT), el uso de anticuerpos para la entrega de los radionucleidos terapéuticos para tumores — ha sido un enfoque atractivo para el tratamiento de cáncer1,2. De hecho, esta promesa ha sido puesto de relieve por la aprobación de los Estados Unidos administración de alimentos y drogas de dos radioimmunoconjugates para el tratamiento de linfoma no-Hodgkin: 90Y-ibritumomab tiuxetan y 131-tositumomab3 , 4. sin embargo, incluso desde sus primeros días, las perspectivas clínicas de RIT han visto obstaculizadas por u....
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Protocolo
Todos en vivo animal los experimentos descritos en este trabajo fueron realizados según protocolos aprobados y ejecutados bajo los lineamientos éticos del Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center y Hunter College Cuidado institucional de los animales y los comités de uso (IACUC).
1. la preparación de huA33-TCO
Nota: La síntesis de huA33-TCO ha sido previamente reportado29. Sin embargo, para facilidad del lector, que es replicado aquí con ajustes para las condiciones óptimas.
- En un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL, prepare una solución de 125 ....
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Resultados
La conjugación de TCO a huA33 se basa en el acoplamiento entre el amina reactiva TCO-NHS y los residuos de lisina en la superficie de la inmunoglobulina. Este método es altamente robusta y reproducible y fiable produce un grado de-etiquetas de 2-4 TCO/mAb. En este caso, espectrometría de masas MALDI-ToF se empleó para confirmar un grado de etiquetado de aproximadamente 4.0 TCO/mAb; se obtuvo un valor similar utilizando un tetrazina fluoróforo modificado como un reportero.......
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Discusión
Uno de los puntos fuertes de este enfoque en vivo pretargeting — especialmente en lo referente a estrategias basadas en anticuerpos tienen y radiactiva haptenos, es su modularidad: transporte- cyclooctene fracciones pueden ser añadidos a cualquier anticuerpo, y tetrazina radioligands puede ser radiactiva con una extraordinaria variedad de radionucleidos sin deteriorar su capacidad de reaccionar con sus socios de clic. Sin embargo la adaptación de este enfoque a otros sistema de antígeno anticuerpo no es.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Dr. Jacob Houghton para conversaciones útiles. Los autores quisieran agradecer a los NIH para su financiación generosa (R00CA178205 y U01CA221046).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| (E)-Ciclooct-4-enil 2,5-dioxo-1-pirrolidinilo carbonato (TCO-NHS) | Sigma-Aldrich | 764523 | Tienda a -80 ° C |
| 2,5-Dioxo-1-pirrolidinil 5-[4-(1,2,4,5-tetrazin-3-il)bencilamino]-5-oxopentanoato (Tz-NHS) | Sigma-Aldrich | 764701 | Almacenar a -80 &0 grados; C |
| Acetonitrilo (MeCN) | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Acetato de amonio (NH4OAc) | Fisher Scientific | A639-500 | |
| Boc-PEG7-amina (O-(2-aminoetil)-O′-[2-(Boc-amino)etil]hexaetilenglicol) | Sigma-Aldrich | 70023 | Almacenar en -20 ° C |
| Diclorometano (DCM) | Fisher Scientific | D143-1 | |
| Dimetilsulfóxido (DMSO), anhidro | Fisher Scientific | D12345 | |
| EMD Millipore Amicon Ultra-2 Unidad de filtro centrífugo | Fisher Scientific | UFC205024 | |
| GE Healthcare Columnas de desalinización desechables PD-10 | Fisher Scientific | 45-000-148 | |
| N, N-dimetilformamida (DMF), anhidra | Fisher Scientific | AC610941000 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Fisher Scientific | 70-011-044 | 10x |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocíclicos | B-205 | Almacene a -20 & grados; C |
| Trietilamina (TEA) | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Ácido trifluoroacético (TFA) | Fisher Scientific | A116-50 | |
| Dispositivo de medición de tumores | Peira TM900 | Peira TM900 |
Referencias
- Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
- Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Anti....
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Reimpresiones y permisos
