Summary
Le protocole actuel décrit une méthode intégrée sur le cancer cell migration et invasion sur une seule plateforme en temps réel, offrant une option facilement reproductible et plus économes en temps d’étudier la morphologie et la mobilité de la cellule.
Abstract
Cancer cellule mobilité est cruciale pour l’ouverture de la métastase. Enquête du mouvement cellulaire et la capacité invasive est donc d’une grande importance. Les essais de migration donnent une idée de base du mouvement cellulaire au niveau 2D, tandis que les analyses d’invasion sont plus physiologiquement pertinents, imitant le détachement cellulaire in vivo cancer du site original et envahir par l’intermédiaire de la matrice extracellulaire. Le protocole actuel prévoit un seul flux de travail pour les essais de migration et invasion. Avec la caméra intégrée de microscopique automatisée pour les images HD en temps réel et le module d’analyse intégré, il donne des chercheurs un temps-efficace, simple et reproductible option expérimentale. Ce protocole comprend également des substitutions pour les consommables et les méthodes d’analyse des choix pour les utilisateurs à choisir.
Introduction
La migration cellulaire et l’invasion sont des processus biologiques importants qui permettent les fonctions normales du corps humain, comme la fermeture de la plaie, invasion du placenta dans l’utérus et glandes mammaires morphogenèse1,2,3. Le corps humain a un contrôle rigoureux et précis de ces événements biologiques ; Cependant, il y a quelques exceptions près. Les tumeurs malignes, par exemple, sont en mesure d’échapper à cette sauvegarde, pièce prolifération anormale et envahir dans les tissus voisins, qu’on appelle des métastases. Métastase est la principale cause de mortalité liée au cancer4.
Le cancer du sein est le plus couramment diagnostiqué le cancer chez les femmes et est la deuxième cause de décès liés au cancer chez les femmes dans les pays développés dans le monde entier5. Le cancer provient de conduits ou lobules qui consistent en une ou plusieurs couches de cellules épithéliales. Dans le sein normal, les cellules épithéliales sont rattachés les uns et à la membrane de sous-sol par l’intermédiaire de protéines membranaires telles que E-cadhérine et les intégrines6. Cependant, les cellules du cancer du sein invasif ont perdu leur polarité et l’adhérence de cellules et classiquement subissent une transition mésenchymateuse épithéliale (EMT) et acquièrent la capacité de se déplacer. Après extravasation, ces cellules se déplacent sur la matrice extracellulaire (ECM) et entrer dans le vaisseau sanguin ou le système lymphatique, suivie ensuite d’intravasation et croissance métastatique7. La compréhension des mécanismes par lesquels ceci se produit est d’une grande importance, puisque les métastases est la cause la plus fréquente de mortalité liée au cancer et est étroitement lié au cancer cell migration/invasion. Afin de visualiser le mouvement des cellules cancéreuses, les essais de migration et invasion sont les modèles idéales pour étudier le mouvement cellulaire 2D et 3D, respectivement. Migration évalue directement le mouvement des cellules tandis qu’invasion implique une interaction avec le microenvironnement et la capacité à dégrader les barrières biologiques. Les deux processus ne sont pas totalement indépendants d’un de l’autre, que la migration est une exigence d’invasion.
Plusieurs méthodes ont été développées pour étudier les migrations et l’invasion. Tel que revu par Kramer et al., des tests de migration comme la cicatrisation, clôture et analyses micro-transporteur génèrent une zone acellulaire pour permettre les cellules habitable, à évaluer le changement de zone ; considérant que, essais transwell et capillaire sont basés sur le nombre de cellules qui se déplacent vers un attractant8. Pour les analyses d’invasion, un environnement ECM doit être mis en place avec du gel de l’ECM ou collagène par exemple, et le mouvement 3D peut être évaluée en surveillant les comtes invasion de zone, de distance et de cellule (p. ex. transwell dosage, dosage de l’ornithorynque)8. Un autre type de test de l’invasion est de combiner les cellules invasives avec les cellules non invasif et évaluer le comportement des cellules envahissantes (p. ex. sphéroïde dosages). Les méthodes ci-dessus ont leurs avantages et inconvénients et une manière facile d’approche, facile à répéter et à combiner le test de migration et invasion dans un flux de travail similaire est préférentiel dans une conception expérimentale.
Ce protocole décrit la mesure de la migration cellulaire et l’invasion à l’aide d’un imageur de cellules vivantes. C’est une cellule en temps réel système installé dans un incubateur de culture cellulaire standard de surveillance. Il prend des images haute définition avec le jeu de numérisation des intervalles et des mesures en appliquant des masques appropriés pour les cellules ou les cibles fluorescents. Le module de test de migration/invasion inclut à l’aide d’un outil de grattage 96 broches, qui est adapté pour la fabrication des plaies gratter homogènes sur une monocouche de cellules dans une plaque à 96 puits. Le mécanisme est basé sur une plaie in vitro tests de guérison, de surveillance des mouvements de cellules 2D sur un plastique ou revêtement. Invasion ou mouvement 3D à travers un ECM supplémentaire dans le scratch enroulé également peut être évaluée. Un flux de travail bref est illustrée à la Figure 1.
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Protocol
Remarque : Deux lignées de cellules doivent être traitées séparément. Les procédures suivantes devraient être appliquées à une ligne de cellules du même si n’est pas spécifiées.
1. optimiser la densité cellulaire avant blessant
- La culture des cellules adhérentes dans des flacons de culture de tissus2 T75 cm à environ 80 % confluent dans de Dulbecco gratuit-rouge de phénol modifié Eagle (DMEM) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 200 mM de L-glutamine et 2 µg/mL d’insuline à 37 ° C, avec 5 % CO2 ( conditions d’incubation standard pour la plupart lignées de cellules cancéreuses, les formulations de culture sont cellule dépendante de ligne).
- Retirez le support de culture en pipettant également éteint dans un conteneur à déchets. Pipette de 2 mL de préchauffé 0,1 % trypsine-EDTA brièvement rince les monocouches de cellules et la pipette. Ajouter un autre 2 mL de 0,1 % trypsine-EDTA et placer le ballon dans des conditions standard d’incubation à 37 ° C pendant 5 min.
- Tapotez doucement le flacon pour s’assurer que le détachement des cellules, puis ajouter 10 mL de milieux de culture pré chauffé pour arrêter la réaction protéolytique.
- Transférer la suspension de cellules dans un tube à centrifuger de 15 mL et la centrifuger à 200 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Retirer le surnageant sans agiter le culot cellulaire soigneusement et remettre en suspension avec un autre média de culture pré chauffé 10 mL.
2. compter le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées (ou des méthodes de comptage)
- Dilué à 200 µL de la suspension cellulaire remises en suspension avec 800 µL de 1 x Phosphate de Dulbecco buffered Saline (SPD) dans un tube à centrifuger 1,5 mL.
- Attacher un capteur de comptage de cellule 60 µm pour le compteur de cellules, maintenez la bascule et fusionner la pointe de la suspension cellulaire. Relâcher lentement la bascule jusqu'à ce que la suspension cellulaire est aspirée avec succès par le capteur. La concentration cellulaire est affichée dans les cellules/mL.
- Calculer le nombre de cellules dans la suspension cellulaire de 10 mL.
3. cellule électrodéposition
- Cellules de la plaque à une gamme de densité des cellules (40 000-90 000 cellules/puits) en trois exemplaires, une plaque à 96 puits.
-
Placer la plaque dans l’imagerie de cellules vivantes et planifier l’analyse toutes les 2 h pendant 24 h.
- Dans le logiciel, cliquez sur calendrier scanne de la liste des tâches. Dans le volet de configuration de tiroir, déterminer la position de la plaque, cliquez sur Add bateau et choisissez le type de plaque. Dans le volet de Configuration Scan , choisir ou modifier la méthode de balayage selon le paramétrage de la plaque expérimentale et définissez Type de Scan en tant que norme.
- Faites un clic droit sur la chronologie , puis sélectionnez Définir des intervalles. Valeur Ajouter scanne chaque 2 h à un horaire de 24 h. Cliquez sur appliquer.
4. déterminer la cellule optimale l’ensemencement de densité pour l’analyse de la Migration
- Stop balayage après 24 h, appliquer la confluence traitement outil d’analyse pour les images de contraste de phase HD automatiquement collectés et générer une courbe de prolifération cellulaire contre le temps.
- Déterminer les images représentatives de 3-6 et les placer dans une nouvelle Collection d’images.
- Déterminer un masque approprié comme Définition de la transformation.
- Lancer une tâche d’analyse.
- Déterminer la densité cellulaire optimisée selon confluence contre le temps (environ 100 % confluent dans 6-18 h selon où commence le test de migration).
Remarque : La quantité de temps qu’il faut augmenter les cellules à confluence varie en fonction de la dilution de semis.
5. les jours 1 et 2 : préparation à la Migration et les analyses d’Invasion
-
Le jour 1, enduire la plaque pour l’analyse de l’invasion.
Remarque : gel ECM doit toujours être manipulé sur la glace et des conseils qui ont été placés dans le réfrigérateur pendant la nuit.- Diluer le gel de l’ECM avec des milieux de culture glacée à 100 µg/mL et ajouter 50 µL de gel dilué ECM et des médias dans les puits désignés.
- Place la plaque à conditions standard d’incubation pour la nuit.
- Jour 2, aspirez doucement les médias excédentaires. Plaque de cellules avec des densités de cellule optimisée en 2 plaques de 96 puits, désignés pour le test de migration (non enrobé) et le dosage d’invasion (enduites) dans réanalysés après les chapitres 1 à 3 en fin d’après-midi (dans le protocole actuel, les densités de semis optimisés pour ZR75-1 et MDA-MB-231 ont été 90 000/puits et 50 000/puits, respectivement).
- Placer les plaques à conditions standard d’incubation du jour au lendemain.
6. jour 3 : Blessure Scratch
- Vaporiser et essuyer l’outil de grattage et 2 bateaux avec l’éthanol à 70 % à laver avant de les placer dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet. Remplir le bateau de lavage 1 et 2 avec exactement 45 mL de stérile (autoclave) éthanol distillé eau et 70 % respectivement.
- Pour la stérilisation, placez le bloc outil de grattage de la tige (en haut) sur LAVAGE bateau 1 et 2 de 5 min chacun.
-
Commencez par la plaque de test de migration.
- Déplacez le plateau contenant des cellules de l’incubateur et assurez-vous qu’aucun puits n’est sec pour éviter tout endommagement de l’outil de grattage. Enlevez la plaque et insérer dans le support de plaque de base de l’outil de grattage et placer soigneusement la partie supérieure sur la pièce de base en guidant les chevilles. Maintenez la manette noire et pendant ce temps, soulevez le bloc de la tige. Lacunes dans chaque puits sont généralement visibles à le œil nu et au microscope.
- Tremper rapidement les tiges dans l’eau ; Cela suffit nettoyer l’outil gratter avant de rayer la plaque de test invasion si l’installation de la plaque est identique. Sinon, répétez les étapes de stérilisation avec l’eau distillée stérile, puis de l’éthanol à 70 % de 5 min chacun.
- Lavage des temps de plaque 1 ou 2 avec les milieux de culture pré chauffé afin d’éviter des cellules individuelles ou cellule feuilles de reconnexion dans le puits.
- Ajouter 100 µL de médias chauds frais dans les puits désignés avec ou sans traitements.
-
Étapes supplémentaires pour l’analyse de l’invasion.
- Placer la plaque de test invasion à 4 ° C pendant 5 min à équilibrer, aspirer soigneusement les médias froids.
- Diluer le gel de l’ECM avec des milieux de culture glacée à 5 mg/mL, ajouter 50 µL de gel d’ECM dilué dans les puits désignés et placer sous standard d’incubation pendant 30 min.
- Ajouter 100 µL de médias réchauffé avec ou sans test composés.
- Placer la plaque dans l’imagerie de cellules vivantes et laisser équilibrer pendant 5 min. choisissez Type de navire comme plaque d’imagelock. Définissez Type de Scan comme Scratch enroulés, choisir ou modifier le Modèle de numérisation selon le paramétrage de la plaque expérimentale (1 image/puits et mode "wide") et planifier 24 h répétition analyse toutes les 1-2 h pendant 72 h jusqu'à ce que les plaies sont cicatrisées.
- Pour nettoyer l’outil de grattage, mettre le bloc haut pin dans chacune des solutions suivantes (45 mL de lavage des bateaux) pour 5 min : 0,5 % de détergent 1 détergent de 1 % (voir Table des matières), 2 (voir la Table des matières), stérile distillée eau et 70 % d’éthanol. Placez l’outil de grattage sur son socle et le magasin dans un environnement sans poussière.
7. analyse de données
- Arrêter le balayage de la plaque désignée après que toutes les blessures ont guéri en choisissant la plaque expérimentale sur le Tiroir d’installation en cliquant sur Supprimer navire.
- Recueillir les images représentatives 3-6, qui couvrent un éventail de pourcentages sonores, y compris le droit d’images après que la blessure a été faite, fermeture de plaie par 10 % et 50 %.
- Pour déterminer une définition d’un traitement convenable, utilisez Le réglage de Segmentation, nettoyage et filtres à appliquer appropriée Scratch enroulés et Confluence photomasque. Aperçu courant/all permet d’afficher la précision des masques.
- Lancer la tâche d’analyse.
- Données peuvent être analysées dans le logiciel ou exportées pour une analyse ultérieure. Trois paramètres fournis par le logiciel peuvent être utilisés pour évaluer les images HD-phase : la confluence (%) de la largeur (µm), blessure et densité plaie relative (%). Comparaisons nous le verrons dans la section suivante.
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Representative Results
Ce test de migration/invasion repose sur le dosage de guérison de blessure, qui évalue le taux des cellules se déplaçant dans une zone acellulaire, créée par l’outil de grattage 96 broches. La différence entre les essais de migration et invasion sont que migration des analyses des cellules de mesure se déplaçant sur les culture de tissus traitée en plastique surface invasion mesures des cellules et se déplaçant à travers le gel de l’ECM.
L’outil de grattage est conçu pour rendre compatibles plaies gratter la plaque désigné et l’imagerie de cellules vivantes est conçu pour prendre des images haute résolution en temps réel avec les blessures de gratter au milieu. Les deux seins cellule cancéreuse lignes utilisées dans le protocole actuel sont ZR75-1 et MDA-MB-231, classés en tant que B Luminale et triple négatif des sous-types respectivement9. Les plaies de grattage générés par l’outil de grattage 96 broches sont généralement entre 700-900 µm, mais peuvent varier entre les différentes lignées cellulaires (Figure 2).
Pour l’analyse de la migration, trois paramètres sont fournis : (1) largeur de la plaie (µm) est la distance moyenne entre les feuilles de la cellule à côté de la plaie (Figure 3). (2) confluence (%) de la plaie est le confluent dans la zone de blessure (Figure 3). La confluence de la blessure initiale idéal devrait être proche de 0 %. (3) densité de plaie relative (%) est un algorithme de fond-soustrait [% Relative plaie densité = 100 * (w(t) - w(0)) / (c(t) - w(0)), t = au temps t, w = masse volumique de la région de la plaie c = masse volumique de la région cellulaire], mesurant la densité de la région de la plaie par rapport à la densité de la région de la cellule.
Trois paramètres admissibles peuvent être réalisés selon les besoins. La densité relative de blessure et plaie confluence impliquent la vitesse des cellules occupant la région de la plaie gratter, et ils se chevauchent presque dans les deux lignées cellulaires. Mais les deux lignées ont montré très différente la cicatrisation des capacités, où à la fin (environ 50 h) de la plaie, processus des cellules MDA-MB-231, ZR75-1 cellules de guérison avaient environ 50 % plaie couverture (les deux paramètres ci-dessus) et plus de 400 µm restant enroulé largeur, de cellules ce qui indique une plus faible capacité de migration des cellules ZR75-1 (Figure 4).
Le comportement migrateur des deux types cellulaires était différent et peut être comparé basées sur les images enregistrées. Lamellipodia (saillies blebbing) ont été observés dans les cellules MDA-MB-231 à l’avant de la migration au début de la migration, qui était un signe typique de réarrangement du cytosquelette, diriger le mouvement cellulaire vers la région acellulaire10 (Figure 5 ). Cellules ZR75-1 ne présentés aucun signe de migration cellulaire dans le même temps-point (Figure 5).
La densité Relative de plaie métrique est recommandée par le fabricant pour l’invasion des cellules, comme c’est un test 3D et analyse axée sur la confluence n’est pas applicable. Moins de 50 heures, la densité relative de plaie des cellules MDA-MB-231 était saturée (100 %), alors que la densité relative de plaie des cellules ZR75-1 n’a pas changé au fil du temps, indiquant le phénotype très envahissant des cellules MDA-MB-231 et le caractère non invasif des cellules () ZR75-1 La figure 6).
Les cellules MDA-MB-231 aussi se sont comportés différemment tout en envahissant par gel ECM (Figure 7). Comparativement aux cellules cloque à l’avant de la migration, envahir les cellules montre une morphologie allongée avec des protubérances.
Figure 1 : Flux de travail de test de migration et invasion dans le protocole actuel. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Exécution de l’outil de grattage sur la cellule cancéreuse du sein lignes ZR75-1 et MDA-MB-231 (panneau du haut) avec la largeur de la blessure initiale mesurée et la plaie initiale confluence (panneau inférieur). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Test de migration, illustrée par des images HD de contraste de phase et le mode mixte avec des masques dans MDA-MB-231. Bleu, zéro blessure ; cellules jaunes, entourant le zéro blessure ; cellules roses, qui se déplaçait dans le scratch enroulés à 24 h après le zéro. Barreaux de l’échelle = 300 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Comparaison de trois algorithmes (largeur de la plaie, plaie relative densité et plaie confluence des lignées de cellules cancéreuses du sein ZR75-1 (à gauche) et MDA-MB-231 (à droite). Toutes les expériences représentent la moyenne des trois expériences indépendantes, ± les barres d’échelle S.D. = 300 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Avant de migration du ZR75-1 et MDA-MB-231 cellules 4 h après zéro. Flèches, lamellipodia à l’avant de la migration. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Quantification de l’invasion à l’aide de métriques densité de plaie Relative (%) de la lignée cellulaire de cancer du sein ZR75-1 (à gauche) et MDA-MB-231 (à droite). Toutes les expériences représentent la moyenne des trois expériences indépendantes, ± le S.D. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Différentes caractéristiques cellulaires des cellules MDA-MB-231 en migration (à gauche) et invasion (à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Un exemple d’une rayure plaie qui ne peuvent pas être analysé par le module intégré de migration d’une plaque de 96 puits. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Migration et invasion sont des paramètres importants pour évaluer la mobilité des cellules cancéreuses. En utilisant l’outil de grattage 96 broches, il est possible de procéder à la guérison des dosages en 2D et 3D en même temps. En dehors de faciliter la numérisation automatique, offrant un milieu de culture des variétés de cellule stables avec le minimum de perturbations, la gratter essai effectué à l’aide de l’outil de grattage 96 broches fournit des plaies gratter cohérentes, permettant des expériences qui sont plus robustes et reproductible. Le format de la plaque à 96 puits donne des options supplémentaires de soit en augmentant le nombre de lignées cellulaires ou des traitements différents. En outre, les changements de morphologie de cellules et un mouvement dynamique peuvent être enregistrées pour une analyse ultérieure.
Le test de migration/invasion est conçu pour être facile à appliquer avec quelques conditions préalables. Une monocouche de cellules confluentes est essentielle avant blessant pour assurer un mouvement cellulaire dirigée vers le fossé. Il est donc fortement recommandé pour optimiser la densité de semis de cellule, et un délai de 6 à 18 h est généralement idéal. La capacité des cellules expérimentales attachés à la surface et le taux de prolifération aura une incidence sur cette période. Prolongée d’incubation temps peut entraîner adhésion forte cellule-cellule et générer des fronts de crooked cellule bilatérale en raison de la suppression des feuilles de la cellule. Un revêtement biomatrix sera utile avec moins de lignées de cellules adhésives, de diminuer le temps d’attente. Les cellules peuvent être affamés avant blessant. Calendrier de la famine est similaire à rayer le timing qui est lorsque la confluence atteint près de 100 %, et les médias de la famine et la durée sont de type cellulaire dépendant. Cellules peuvent également être transfectées, mais la densité de semis doit être déterminée pendant une période prolongée avant blessant, considérant le temps d’incubation de la procédure de transfection. Blessant est possible en quelques secondes à l’aide de l’outil de grattage 96 broches. Broches de taille définie garantissent une ligne de départ précis de migration/invasion et la distance. Ce qui est important, les sections supérieures et inférieures doivent être bien alignées pour compléter une égratignure complet dans les puits, afin que soit terminal des plaies gratter n’incluent pas les images de cellules vivantes. Les plaies de grattage peuvent être facilement observées grâce à l’oeil nu sur la monocouche de cellules confluentes et peuvent être rapidement vérifiés sous un microscope à champ lumineux. Lavage des puits doit être effectué immédiatement et délicatement pour éviter le rattachement de délogé les cellules et l’élimination des cellules bilatéraux. Si un lavage suffit nettoyer la zone acellulaire souhaitée, il n’y a pas besoin d’un lavage supplémentaire.
Les essais de migration peuvent être finalisées en ajoutant des milieux de culture, avec ou sans traitements et sont prêts à numériser, tandis que quelques étapes supplémentaires sont nécessaires pour être pris en compte pour un dosage de l’invasion. Contrairement à la migration cellulaire, cellules invasion traverser les ECM, qui reflète plus fidèlement en vivo les mouvement de la cellule mieux. L’entité de sécurité du protocole actuel consiste à générer un environnement ECM-encerclé à l’aide de gel de l’ECM. Les cellules sont ensemencées sur les puits d’enduit gélifié ECM et après la blessure, gel de l’ECM est superposée sur les cellules et la plaie de grattage. Lorsque vous manipulez le gel de l’ECM, il est préférable de tout garder au froid pour éviter la gélification. Inégalement répartie gel ECM peut causer des problèmes lorsqu’on se concentre au microscope. En raison de la nature visqueuse du gel de l’ECM, il est possible de générer des bulles, mais les bulles peuvent être facilement enlevées par aspiration éthanol à 70 % grâce à un flacon pulvérisateur. Pour générer une pulvérisation fine mais pas trop, simplement dévisser le bouchon du flacon pulvérisateur et vaporiser au large de l’éthanol à 70 % excès dans la paille pointant ailleurs. Par pulvérisation à une distance au-dessus et horizontale sur la plaque, la pulvérisation de l’éthanol 70 % fine est suffisante pour éliminer les bulles.
La première analyse devrait commencer dès que possible après blessure, pour capturer la zone initiale de plaie acellulaire, et c’est important pour établir les critères pour l’analyse. Les intervalles de balayage dépendent du type de cellule, comme plusieurs lignées de cellules envahissantes ont un taux plus rapide de fermeture des plaies.
Cette demande de migration/invasion est relativement simple, et en utilisant le module d’analyse intégré, mouvement cellulaire peut être représentées graphiquement cinétiquement avec 3 paramètres : la largeur de la plaie, plaie confluence et la densité relative de plaie (Figure 3). Tous les trois peuvent servir à évaluer la migration. Largeur de la plaie décrit la distance moyenne en µm quand les feuilles de cellule bilatérale se déplacent relativement parallèle et est indépendant de la limite de la blessure initiale. Confluence de la plaie et la densité relative de plaie, au contraire, exigent la limite de la blessure initiale dans le calcul et décrivent la confluence au sein de la région de la plaie et la densité des cellules par rapport à la zone non blessée, respectivement. Pour le dosage de l’invasion, la densité relative de plaie est recommandée, car il calcule la surface de la plaie en ce qui concerne les feuilles de cellule bilatérale. Les lecteurs peuvent choisir celui qui représente le mieux leurs besoins.
Ce test de migration/invasion zéro blessure peut s’avérer pratique, mais il requiert l’outil de grattage 96 broches, plaques désignés et l’imageur de cellules vivantes avec le module intégré migration/invasion de reproduire les résultats typiques présentés dans le présent protocole, et ceux-ci peuvent être coûteux. Des substitutions rentables comme un fond plat plaque multipuit 96 puits peuvent être utilisées et peuvent générer des plaies de grattage décents (données non présentées). Toutefois, les performances de l’outil de grattage n’était pas aussi bon que lorsque la plaque désignée a été utilisée, et certaines plaies ne pouvaient pas être captés par le mode de balayage (Figure 8), donc impossible de définir correctement la zone de la blessure initiale. En outre, l’outil de grattage peut servir à créer des plaies de grattage, avec analyse manuellement, par les programmes de traitement d’image, ou à l’aide d’autres outils de visualisation et d’analyse de point final. Ils offrent plus de flexibilité pour localiser les plaies initiales et se limitent donc pas aux plaques désignés. En revanche, le test de migration/invasion combiné avec l’imagerie de cellules vivantes dans le protocole actuel est moins long et moins sujette aux erreurs. Cela pourrait être particulièrement utile pour experimental cohérence et une efficacité accrue.
En conclusion, ce test de migration/invasion est rapide, simple et robuste. Les utilisateurs peuvent choisir de notre protocole et d’autres selon leur besoin et budget.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Nous tenons à souligner notre soutien financier de la fondation du groupe Bloomfield à travers le Hunter Medical Research Institute (HMRI 13-02). X.Z est soutenu par une bourse d’études de l’APA par le biais de l’Université de Newcastle et la bourse de doctorat HCRA biomarqueurs phare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | Dilute to 2x in DPBS |
| Countess II FL Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Detergent 1 (Alconox) | Sigma-Aldrich | 242985 | 0.5% working concentration |
| Detergent 2 (Virkon S) | VetProduct DIRECT | 1% working concentration | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplimented with 10% FBS, 200 mM L-glutamine, 2 μg/ml insulin |
| ECM Gel (matrigel) | Sigma-Aldrich | E6909 | Growth-factor reduced, phenol red free |
| Essen ImageLock 96-well plate, flat bottom | Essen | 4379 | |
| EVE Counting slides | BioTools | EVS-50 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| IncuCyte 96-well scratch wound cell invasion accessories | Essen | 4444 | Including CoolBox, 2x CoolSink |
| IncuCyte Cell migration kit | Essen | 4493 | Including the 96-well pin block, 2x wash boats and the software |
| IncuCyte ZOOM | Essen | Live cell analysis system | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | 19278-5ML | |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-091 | |
| Tissue culture flask, 75 cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 |
References
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