Artículo de método

Analizando la tasa de consumo de oxígeno en los cardiomiocitos neonatales primario de ratón cultivadas utilizando un analizador de flujo extracelular

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DOI:

10.3791/59052

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13 de febrero de 2019

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1Division of Cardiology, Department of Medicine, University of California San Diego, 2Department of Pharmacology, University of California San Diego, 3Cardiology Section, Department of Medicine, Veterans Administration Healthcare, San Diego

En este artículo

Resumen

El objetivo de este protocolo es ilustrar cómo utilizar cardiomiocitos neonatales de ratón como modelo para analizar cómo diversos factores pueden alterar el consumo de oxígeno en el corazón.

Resumen

Mitocondrias y metabolismo oxidativo son críticos para mantener la función del músculo cardiaco. Investigaciones han demostrado que la disfunción mitocondrial es un factor importante que contribuye al deterioro de la función cardiaco en insuficiencia cardíaca. Por el contrario, la restauración de la función mitocondrial defectuosa puede tener efectos beneficiosos para mejorar la función cardiaca en el corazón de la falla. Por lo tanto, estudiar los mecanismos de regulación y la identificación de nuevos reguladores de la función mitocondrial pueden proporcionar la penetración que podría utilizarse para desarrollar nuevos blancos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades del corazón. Aquí, la respiración mitocondrial del miocito cardiaco se analiza mediante un sistema de cultivo de célula única. En primer lugar, se ha optimizado un protocolo para aislar rápidamente y cultura alta viabilidad neonatal ratón cardiomiocitos. Entonces, un analizador de flujo extracelular de formato de 96 pozos se utiliza para evaluar la tasa de consumo de oxígeno de estos cardiomiocitos. De este protocolo, optimizar las condiciones de siembra y demostró que tasa de consumo de oxígeno de cardiomiocitos de ratón neonatal puede evaluarse fácilmente en un analizador de flujo extracelular. Por último, observamos que nuestro protocolo se puede aplicar a un tamaño más grande de la cultura y análisis de la función de otros estudios, como la señalización intracelular y contráctil.

Introducción

Para mantener una función contráctil cardiaca continua, cardiomiocitos deben mantener un suministro constante de energía celular principalmente en forma de ATP1. En el corazón, se genera aproximadamente el 95% de ATP por las mitocondrias, principalmente a través de la fosforilación oxidativa, mostrando que las mitocondrias desempeñan un papel crucial de la bioenergético en la función cardiaca2,3. Apoyo a esta noción es que la desregulación de la función mitocondrial puede conducir a cardiomiopatía e insuficiencia cardíaca4,5. Por el contrario, restauración de la función mitocondrial se ha demostrado para mejorar la función cardiaca de la falla del corazón6,7. Por lo tanto, estudiar el mecanismo de la bioenergética mitocondrial y la identificación de nuevos reguladores de la función mitocondrial en los cardiomiocitos no sólo revela ideas mecanicistas de la producción energética cardiaca pero también pueden proporcionar la penetración que desarrollo de nuevas dianas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades del corazón6,8.

Comparado con el corazón entero, que contiene una mezcla de miocitos y miocitos no9, cultivos de cardiomiocitos son extremadamente puro, con la mínima contaminación de no miocitos del corazón, tales como fibroblastos y células endoteliales10. Además, aislar los cardiomiocitos de los cachorros neonatales permite cultivar un gran número de células en una pequeña cantidad de tiempo, comparado con el aislamiento de las células de corazones adulto10,11. Lo más importante, ratón adulto culto primario cardiomiocitos tienen supervivencia corta veces (p. ej. 24 h) y en tiempo de puntos de diferencian. Cardiomiocitos neonatales ratón pueden sobrevivir y ser manipulada por más de 7 días en cultivo, lo que es ideal para probar los efectos de los compuestos de drogas y manipulación de genes en la función de la mitocondria en cardiomiocitos10. Por supuesto, existen diferencias biológicas importantes entre las células de adulto y neonatales, pero la duración más larga disponible para el cultivo de células neonatales los hace apropiados para diferentes tipos de estudios, los de la función mitocondrial incluidos.

Hasta la fecha, cardiomiocitos neonatales cultivados primarias de la rata y ratón se han utilizado como modelos para estudiar bioenergética cardíaca12,13. En los últimos años, estudios utilizan un analizador de flujo extracelular para medir la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y evaluar la capacidad oxidativa en ratón y rata cardiomiocitos neonatales14,15. Mientras que en comparación con las ratas, la viabilidad celular de cardiomiocitos neonatales de ratón es menor y tiene una mayor variabilidad16. Además, la capacidad para el estudio de células a partir de modelos de ratón modificados genéticamente hace muy importante el modelo de célula de ratón. Dado que estudios de OCR son tan sensibles a la célula número y densidad de siembra, es necesario el desarrollo de un protocolo simple, reproducible y confiable para lograr la viabilidad y rendimiento constante de la célula.

Aquí, Divulgamos un protocolo optimizado que se ha desarrollado que utiliza ratón cultivados cardiomiocitos neonatales junto con un analizador de flujo extracelular 96-bien-formato para el análisis de OCR. Este protocolo aumenta la reproducibilidad del ensayo. Además, el Protocolo no sólo proporciona un método reproducible para el análisis de OCR y novela, sino que también podría adaptarse a una cultura más grande de tamaño para propósitos experimentales, como la que puede ser necesario estudiar las funciones miofibrilar e intracelular vías de señalización.

En particular, este protocolo describe un procedimiento de un día para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón en una placa de cultivo celular de 96 pozos. Además, describe el procedimiento para medir el consumo de oxígeno usando un analizador de flujo extracelular. Todas las soluciones utilizadas son estériles o filtrado estéril. Todas las herramientas son esterilizadas por el etanol del 75%. Le ofrecemos una Tabla de materiales para diferentes partes del procedimiento. Para el cultivo de cardiomiocitos, todos los procedimientos y pasos se llevan a cabo en una campana de la cultura de célula estándar. Este protocolo está desarrollado para el aislamiento de corazones de ratón neonatal de una camada (aproximadamente 8-10 crías). Sin embargo, el protocolo también puede adaptarse para aislar cardiomiocitos de camadas múltiples.

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Protocolo

Para el trabajo con ratones neonatales, se refieren al conjunto de pautas locales Instituto adelante por los programas de cuidado de los animales y se adhieren a la institucional y otras regulaciones apropiadas. Todos los métodos descritos en este protocolo han sido aprobados por la UC San Diego Animal cuidado institucional y el Comité uso (IACUC) y adhieran a regulaciones federales y estatales.

1. preparación de reactivos

  1. Preparar 25 mL de solución de digestión previa: HBSS (sin Ca2 + y Mg2 +) complementada con tripsina (0.5 mg/mL). Esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,22 μm y mantener en hielo hasta su uso. Hacer solución de digestión previa en el día del experimento.
    Nota: Es fundamental utilizar HBSS sin Ca2 + y Mg2 +, Ca2 + y Mg2 + hará que la contracción del miocito y la muerte subsecuente de la célula durante el aislamiento.
  2. Preparar 30 mL de tampón de digestión colagenasa: colagenasa (0,8 mg/mL, aproximadamente 350 U/mL) disuelto en tampón HBSS (sin Ca2 + y Mg2 +). Esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,22 μm y mantener en hielo hasta su uso. Hacer solución de digestión de colagenasa en el día del experimento.
  3. Preparar 500 mL de medio de cultivo de cardiomiocitos (medios de cultivo): se mezclan 375 mL de DMEM, 125 mL de M-199, 25 mL de suero de caballo y 12,5 mL de SBF. Suplemento con penicilina de 1% y 1% solución de estreptomicina.
  4. Preparación de medio de prueba de estrés mitocondrial: hacer 200 mL de DMEM basado en prueba de esfuerzo suplementado (DMEM sin NaHCO3, véase Tabla de materiales) con piruvato de sodio 1 mM, 2 mM L-glutamina y glucosa 10 mM y 2 mM Hepes.
    Nota: Hacer 1 L de medio con DMEM sin piruvato de sodio, L-glutamina, glucosa y Hepes, filtro estéril y almacenar a 4 ° C. Preparar el medio de prueba de esfuerzo en el día del ensayo mediante la adición de otros reactivos. Con DMEM medio sin NaHCO3 es fundamental.
  5. Ajustar el pH de los medios de prueba de estrés mitocondrial a 7.4 en el día de uso. Medios de comunicación tibia a 37 ° C antes de usar.
  6. Preparar oligomycin: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.
  7. Preparar FCCP: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.
  8. Preparar la antimicina A: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.
  9. Preparar la rotenona: preparar 5 mL de una solución stock de 5 mM en DMSO, hacer alícuotas μl 250 y almacenar a-20 ° C.
    Nota: Todos los reactivos y soluciones utilizadas en el presente Protocolo se enumeran en la tabla 1.

2. recolección y pre digestión de corazones de ratones neonatales (día 1)

  1. Autoclave tijeras, pinzas y una cuchara de Moria para esterilizar.
  2. Realizar todos los pasos en la campana de la cultura de célula para la esterilidad.
  3. 5 mL alícuota de HBSS (sin Ca2 +, Mg2 +) en cada pocillo de una placa de cultivo celular 6-bien; Coloque en hielo. Alícuota 10 mL de HBSS en una placa de cultivo celular de 10 cm.
  4. Prepare 20 mL de solución de la digestión de tripsina en un tubo cónico estéril de 50 mL. Mantenga todas las soluciones en el hielo.
  5. Rápidamente sumergir ratones recién nacidos (día 0) en la solución de etanol 70% para la esterilización.
  6. Decapitar a PUP utilizando tijeras estériles (recto) sin anestesia y luego abre el cofre a lo largo del esternón para permitir el acceso a la cavidad torácica y el corazón. (Figura 1A)
    Nota: 1) es importante utilizar ratones neonatales P0 para lograr viabilidad celular alta. 2) este método de eutanasia está permitida para los recién nacidos con arreglo a las pautas de NIH y la Asociación Médica Veterinaria americana 17.
  7. Extraer corazones del cuerpo con tijeras finas y transferencia inmediatamente en el plato de cultura de célula estéril con HBSS (sin Ca2 +, Mg2 +) (figura 1B).
  8. Eliminar cualquier tejido pulmonar residual, los buques más grandes, etc. (y atria, si lo desea). Lavar el corazón en la solución HBSS con agitación suave.
  9. Cortar cada corazón con unas tijeras finas en 8 pedazos y transferir todo el tejido de corazón con unas pinzas en un pozo de una placa de cultivo celular 6-bien con HBSS (figura 1C y 1D).
  10. Lavar los corazones mediante la transferencia de los corazones de bien a bien en la placa de 6 pozos con HBSS, con una cuchara de Moria (figura 1).
    Nota: Transferencia de los corazones de bien a bien es suficiente para lavar la sangre. Puesto que la sangre interfiere con la digestión enzimática es importante lavar los corazones con HBSS y sacar sangre.
  11. Transferir el corazón con una cuchara de Moria en un tubo cónico que contiene 20 mL de tripsina (0.5 mg/mL) e incubar con agitación suave a 4° C por 4 h (Figura 1E).

3. prepare una placa de cultivo de 96 pocillos (día 1)

  1. Preparar 5 mL de solución de recubrimiento: PBS con 0,5% gelatina (autoclave antes de su uso) y fibronectina solución al 1%. (por ejemplo, 5 mL de solución de gelatina y 50 μl de solución de fibronectina)
  2. Alícuota de 50 μl de solución de recubrimiento en cada pocillo de la placa de cultivo celular de 96 pozos (véase Tabla de materiales). Si las burbujas están presentes, eliminarlos utilizando una pipeta de 20 μl para aspirar las burbujas hacia fuera.
    Nota: Es importante cubrir toda la superficie de cada pocillo con la solución de recubrimiento.
  3. Incube la placa en una incubadora de cultura de célula de 37 ° C durante 1 h o más para permitir el secado de la capa de matriz.
  4. Aspirar cualquier solución de capa residual antes de sembrar de cardiomiocitos.

4. enzimática digestión y galjanoplastia de células (día 1)

  1. Caliente previamente la solución de digestión de colagenasa en un baño de agua de 37 ° C.
    Nota: Este paso es importante para lograr la digestión enzimática eficiente.
  2. Mover el tubo cónico que contiene corazones y solución de digestión antes de 4 ° C a una campana de cultivo celular. (Figura 1F)
  3. Deja que el corazón se hunde hasta el fondo del tubo y retirar la solución de la digestión mediante el uso de una pipeta serológica de 10 mL (1 a 2 mL del medio de aislamiento puede permanecer en el tubo).
  4. Añadir 10 mL de HBSS en el tubo. Vuelva a suspender los corazones con HBSS 2 - 3 veces a lavar con una pipeta serológica de 10 mL de tripsina. Aspirar HBSS (1 a 2 mL puede permanecer en el tubo).
  5. Añadir 10 mL de solución de digestión con colagenasa en el tubo con el corazón. (Figura 1)
  6. Incubar el tubo con el corazón en un baño de agua de 37 ° C durante 10 minutos sin agitación (1 º digestión).
  7. Después de la 1 º digestión, mueva el tubo a la campana de la cultura de célula. Suavemente triturate corazones por volver a suspender los corazones dentro del tubo suavemente 10 veces usando una pipeta serológica de 10 mL. Esto permitirá que corazones para dispersar y células liberadas del tejido cardíaco. (Figura 1 H)
    Nota: Cardiomiocitos son frágiles, trituración suave es importante para lograr alta viabilidad.
  8. Que el tejido no digerido fregadero, transferencia digerido solución enriquecida en cardiomiocitos (aproximadamente 9-10 mL) a un tubo cónico nuevo y añadir la misma cantidad de medios de cultivo celular para detener la digestión de la colagenasa.
  9. Añadir 10 mL de solución de digestión de colagenasa en el tubo que contiene el tejido restante del corazón sin digerir.
  10. Incubar el tubo con tejido cardíaco en un baño de agua de 37 ° C durante 10 min (2 º digestión).
  11. Repita el procedimiento 4.7 y 4.8.
    Nota: Si hay tejido todavía mucho no digerida, repita una vez más la digestión. Sin embargo, en la mayoría de los casos, dos digestiones son suficientes para dispersar la mayoría de las células de los tejidos del corazón.
  12. Coloque un filtro de células estéril (malla de nylon de 100 μm) en un tubo cónico estéril 50 mL nuevo. Humedezca previamente el filtro de la célula con 2-3 mL de medio de cultivo celular y pasar las células a través de la coladera de la célula. Enjuague el colador celular con 2-3 mL de medio de cultivo celular. (Figura 1I)
  13. Centrifugar el tubo cónico que contiene cardiomiocitos durante 5 min a 180 x g (Figura 1J). Aspirar el sobrenadante (figura 1 K), que contienen restos de tejidos celulares y Resuspenda el precipitado de células en 10 mL de medio de cultivo celular (figura 1 L).
  14. Resuspender las células y las células de la placa sobre una placa de cultivo celular de 10 cm (sin ningún tipo de recubrimiento de plástico) e Incube por 1 h en una incubadora de cultivo celular (pre-placas 1) (figura 1 M). Este paso de la pre-galjanoplastia permite no cardiomiocitos, como fibroblastos y células endoteliales, a adherirse a la placa de cultivo de células sin recubrimiento.
    Nota: En este punto, cardiomiocitos son típicamente una forma redonda y aparecen brillantes bajo el microscopio. (Figura 1N).
  15. Después de la incubación de 1 h, suavemente agite la placa, lave las células no adherentes (enriquecidas en cardiomiocitos) de la placa de cultivo de 10 cm y Resuspenda las células mediante pipeteo repetidamente el medio de cultivo celular sobre el plato con una pipeta serológica de 10 mL. Luego, transferir las células no adherentes (enriquecidas en cardiomiocitos) en una nueva placa de cultivo celular de 10 cm (sin ningún recubrimiento de plástico) e incubar durante una 1 h adicional en una incubadora de cultivo celular (placas previos 2 º).
    Nota: Las células que se adhieren a la placa sin revestimiento son dominantemente no cardiomiocitos: fibroblastos y células endoteliales, que pueden visualizarse bajo el microscopio (figura 1O).
  16. Después de 2 º pre-galjanoplastia, suavemente agitar la placa, lave las células no adherentes (cardiomiocitos) de la placa de cultivo de 10 cm, luego transferir los cardiomiocitos en un nuevo tubo cónico de 50 mL.

5. recuento de células y células de revestimiento en una placa de cultivo celular de 96 pozos (día 1)

  1. Contar las células usando un hemocitómetro.
  2. Las células de la placa en una placa de cultivo celular de 96 pozos matriz extracelular revestido con una densidad entre 10 – 30 x 103 células/pocillo utilizando una pipeta multicanal en un volumen final de 200 μl (figura 1 P). Utiliza pozos A1, A12, H1 y H12 para fondo: Añadir 200 μL de medio de cultivo como otros pozos en estos pozos (sin células). Incube la placa en una incubadora de 37 ° C de la célula cultura.
    Nota: En este estudio, el consumo de oxígeno fue probado mediante el uso de densidades de diferentes células como 10 x 103, 20 x 10330 x 103 células/pocillo. (Figura 2A). También, como arriba, cardiomiocitos inmediatamente después del aislamiento suelen ser una forma redonda y aparecen brillantes bajo el microscopio. Células viables se aplanen en 16-24 h de cultivo.

6. oxígeno consumo ensayo utilizando un analizador de flujo extracelular de formato de 96 pozos (día 2)

Nota: Ensayo de consumo de oxígeno puede llevar a cabo un día después de las células de la galjanoplastia o posterior. Cardiomiocitos neonatales cultivados utilizando este protocolo puede sobrevivir hasta 7 días post aislamiento.

  1. Un cartucho de sensor de flujo analizador del hidrato (véase Tabla de materiales) durante al menos 3 horas, pero ideal para un día completo, antes de la prueba. Añadir 200 μL de solución Calibrant (véase Tabla de materiales) en cada pocillo de la placa de la utilidad, el cartucho de sensor vuelva a colocar la placa de la utilidad e incubar en una incubadora de 37 ° C sin CO2 o O2 suplementación.
  2. Cambiar los medios de cultivo celular al medio de prueba de estrés de las mitocondrias una hora antes del ensayo. Cardiomiocitos son frágiles. Por lo tanto, suavemente quitar los medios de cultivo celular mediante una pipeta multicanal y lavan las células con 200 μL de los medios de prueba de estrés mitocondrial precalentado dos veces. Después del segundo lavado, añadir 175 μl de los medios de prueba de estrés con las mitocondrias y las células en una incubadora de 37 ° C sin CO2 o O2 suplementos de la cultura.
  3. Preparar compuestos de prueba concentrado. Para prueba de esfuerzo de las mitocondrias, preparar 3,0 mL de 16 oligomycin μm, μm 9 FCCP y una mezcla de 20 rotenona μm y 20 μm antimicina A, todo en medio de la prueba de estrés mitocondrial.
    Nota: Cada compuesto en la concentración que se describe ha sido probado. Sin embargo, es necesario valorar la concentración de cada compuesto en laboratorio propio.
  4. Carga 25 μl de cada compuesto en los orificios del inyector del cartucho sensor utilizando una pipeta multicanal (figura 1Q). El volumen y la concentración final se describen en la tabla 2.
  5. Configurar el protocolo de ensayo de flujo extracelular. El programa se describe en tabla 3.
  6. Inicie el programa. En primer lugar, ponga el cartucho de sensor en la máquina de calibración (figura 1R). Reemplazar el calibrant para la placa de ensayo una vez hecho el paso de calibración.
    Nota: Utilizando el software proporcionado por el fabricante, indican grupos de pozos y cada uno de ellos y el puerto.
  7. Si lo desea, después del ensayo, deseche cuidadosamente todo medio de ensayo usando una pipeta multicanal y almacenar la microplaca de la cultura de célula a-20 ° C para la normalización de la futura célula usando análisis de proteína.
  8. Medir el contenido de proteína. Añadir 50 μl de solución de lisis de la célula RIPA estándar (véase Tabla de materiales). Incubar la placa de hielo durante 30 minutos completamente Lyse las células. Transferir todo el material para una nueva placa de ensayo bien fondo claro plano 96.
  9. Medir la concentración de proteína por ensayo BCA según protocolo del fabricante.
    Nota: Recubrimiento del pozo con matriz extracelular resulta en una concentración de proteínas en cada pozo. Por lo tanto, restar la cantidad de pozos fondo (sin células) para obtener la concentración de la proteína de la célula real. La concentración de proteína derivada de células es baja en una placa de cultivo de 96 pozos. Además, la concentración de proteína puede variar de pozo a pozo debido a la capa de matriz extracelular. Por lo tanto, se sugiere usar numero de celular para normalizar el OCR.

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Resultados

Mediante el protocolo descrito, corazones fueron aislados de los cachorros neonatales día 0. se obtuvieron 5 x 105 células/pup y cardiomiocitos fueron sembrados a densidades de 10 x 103, 20 x 103o 30 x 103 células/pocillo, en placas bien 96 (figura 2A). Después de la cultura durante la noche, se encontraron cardiomiocitos bien adheridos a la superficie recubierta de plástico y había muy pocas células sueltas (las cé...

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Discusión

En este estudio, hemos establecido un protocolo simple para el aislamiento y cultivo de cardiomiocitos neonatales de ratón. Mediante el uso de estos cardiomiocitos, hemos optimizado también las condiciones para medir la tasa de consumo de oxígeno mediante un sistema de analizador de flujo extracelular. El protocolo permite utilizar cardiomiocitos neonatales de ratón como un modelo de sistema para examinar cómo diversos factores pueden alterar el consumo de oxígeno en las células principales del trabajo del corazón, simil...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a todo laboratorio Ross y miembros del laboratorio de Murphy. Este trabajo es apoyado por la Asociación Americana del corazón (14SDG17790005) Y.C. NIH (HL115933, HL127806) y VA al mérito (BX003260) a R.S.R.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Antimicina ASIGMAA8674Inhibe el complejo III de las mitocondrias
Filtro de células 100 μ m porosFALCON352360Para capturar tejido no digerido
Colagenasa tipo IIWorthingtonLS004176Para hacer colagenasa solución de digestión
D-GlucosaSIGMA75351Para hacer medio de prueba de esfuerzo mitocondrial
DMEM alta glucosaLife technologies11965-092Para hacer medio
de cultivo celularDMEM sin NaHCO3, glucosa, piruvato, glumanina y hepesSIGMAD5030-10X1LPara hacer el medio de prueba de esfuerzo mitocondrial
FCCP (Cianuro de carbonilo 4-(trifluorometoxi)fenilhidrazona)SIGMAC2920Desacopla la respiración mitocondrial
Suero fetal bovino (FBS)Life technologies26140-079Para hacer medio de cultivo celular
Fibronectina a partir de plasma bovinoSIGMAF1141-5MGPara hacer la solución de recubrimiento para placas de cultivo de tejidos
Tijeras finasHerramientas de ciencias finas14060-10Para la disección de corazones
Gelatina de piel porcinaSIGMAG-1890Para hacer solución de recubrimiento para placas de cultivo de tejidos
HBSS (solución salina equilibrada de Hank, sin Ca2+, Mg2+)Cellgro21-022-CVPara lavar corazones y hacer solución de predigestión y digestión de colagnasa
HEPES (1 M)Fisher scientific15630080Para hacer medio de prueba de esfuerzo mitocodnrial
Suero de caballoLife technologies26050-088Para hacer medio de cultivo celular
L-GlutaminaSIGMAG-3126Para hacer medio de prueba de esfuerzo mitocodnrial
M-199Cellgro10-060-CVPara hacer sustrato celular
Cuchara MoriaFisher scientificNC9190356Para lavar corazones 
OligomicinaSIGMA75351-5MGInhibe la ATP sintasa mitocondrial
Tampón RIPAFisher scientific89900Para lisar las células para el ensayo de proteínas
RotenonaSIGMAR8875Inhibe el complejo I de las mitocondrias Caballito
de mar XFe96 Analizador de flujo extracelular
AgilentDispositivo utilizado para analizar la tasa
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102601-100Paquete de placas de cultivo del analizador de flujo, cartuchos de sensor y calibrante
Piruvato de sodioSIGMAP2256Para hacer el medio de prueba de esfuerzo mitocondrial
Tijeras rectasHerramientas de ciencias finas91401-12Para la disección de corazones
Filtro de jeringa 0.2 μ tamañoPara la filtración estéril del medio de digestión
TripsinaUSB Corporation22715 25GMPara hacer la solución de predigestión
de consumo de oxígeno m

Referencias

  1. Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiological Reviews. 85 (3), 1093-1129 (2005).
  2. Wang, K., et al. Mitochondria regulate cardiac contraction through ATP-dependent and independent mechanisms. Free Radical Research. , 1-10 (2018).
  3. Kolwicz, S. C. Jr, Purohit, S., Tian, R. Cardiac metabolism and its interactions with contraction, growth, and survival of cardiomyocytes. Circulation Research. 113 (5), 603-616 (2013).
  4. Rosca, M. G., Hoppel, C. L. Mitochondrial dysfunction in heart failure. Heart Failure Reviews. 18 (5), 607-622 (2013).
  5. Wai, T., et al. Imbalanced OPA1 processing and mitochondrial fragmentation cause heart failure in mice. Science. 350 (6265), aad0116(2015).
  6. Bayeva, M., Gheorghiade, M., Ardehali, H. Mitochondria as a therapeutic target in heart failure. Journal of American College Cardiololgy. 61 (6), 599-610 (2013).
  7. Camara, A. K., Bienengraeber, M., Stowe, D. F. Mitochondrial approaches to protect against cardiac ischemia and reperfusion injury. Frontiers in Physiology. 2, 13(2011).
  8. Brown, D. A., et al. Expert consensus document: Mitochondrial function as a therapeutic target in heart failure. Nature Reviews Cardiology. 14 (4), 238-250 (2017).
  9. Zhou, P., Pu, W. T. Recounting Cardiac Cellular Composition. Circulation Research. 118 (3), 368-370 (2016).
  10. Parameswaran, S., Kumar, S., Verma, R. S., Sharma, R. K. Cardiomyocyte culture - an update on the in vitro cardiovascular model and future challenges. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 91 (12), 985-998 (2013).
  11. Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. Journal of Vissualized Experiments. 10 (114), (2016).
  12. Gibbs, C. L., Loiselle, D. S. Cardiac basal metabolism. Japanese Journal of Physiology. 51 (4), 399-426 (2001).
  13. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age Related Bioenergetics Profiles in Isolated Rat Cardiomyocytes Using Extracellular Flux Analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002(2016).
  14. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 74, 340-352 (2014).
  15. Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. M. Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal. Biochemical Journal. 424 (1), 99-107 (2009).
  16. Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 44 (3-4), 45-50 (2008).
  17. AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition. , Available from: https://www.avma.org/KB/Policies/Documents/euthanasia.pdf (2013).
  18. Manso, A. M., et al. Talin1 has unique expression versus talin 2 in the heart and modifies the hypertrophic response to pressure overload. Journal of Biological Chemistry. 288 (6), 4252-4264 (2013).
  19. Wang, G. W., Kang, Y. J. Inhibition of doxorubicin toxicity in cultured neonatal mouse cardiomyocytes with elevated metallothionein levels. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 288 (3), 938-944 (1999).
  20. Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).
  21. Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), e21746(2011).
  22. Sansbury, B. E., Jones, S. P., Riggs, D. W., Darley-Usmar, V. M., Hill, B. G. Bioenergetic function in cardiovascular cells: the importance of the reserve capacity and its biological regulation. Chemico-Biological Interactions. 191 (1-3), 288-295 (2011).
  23. Sharp, W. W., et al. Dynamin-related protein 1 (Drp1)-mediated diastolic dysfunction in myocardial ischemia-reperfusion injury: therapeutic benefits of Drp1 inhibition to reduce mitochondrial fission. FASEB Journal. 28 (1), 316-326 (2014).
  24. Tigchelaar, W., et al. Hypertrophy induced KIF5B controls mitochondrial localization and function in neonatal rat cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 97, 70-81 (2016).
  25. Graham, B. H., et al. A mouse model for mitochondrial myopathy and cardiomyopathy resulting from a deficiency in the heart/muscle isoform of the adenine nucleotide translocator. Nature Genetics. 16 (3), 226-234 (1997).
  26. Zhao, Y. Y., et al. Defects in caveolin-1 cause dilated cardiomyopathy and pulmonary hypertension in knockout mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (17), 11375-11380 (2002).
  27. Vander Heiden, M. G., et al. Growth factors can influence cell growth and survival through effects on glucose metabolism. Molecular and Cellular Biology. 21 (17), 5899-5912 (2001).
  28. Detillieux, K. A., Sheikh, F., Kardami, E., Cattini, P. A. Biological activities of fibroblast growth factor-2 in the adult myocardium. Cardiovascular Research. 57 (1), 8-19 (2003).
  29. Wang, R., et al. The acute extracellular flux (XF) assay to assess compound effects on mitochondrial function. Journal of Biomolecular Screening. 20 (3), 422-429 (2015).
  30. Dai, D. F., et al. Age-dependent cardiomyopathy in mitochondrial mutator mice is attenuated by overexpression of catalase targeted to mitochondria. Aging Cell. 9 (4), 536-544 (2010).
  31. Ritterhoff, J., Tian, R. Metabolism in cardiomyopathy: every substrate matters. Cardiovascular Research. 113 (4), 411-421 (2017).
  32. Uosaki, H., Taguchi, Y. H. Comparative Gene Expression Analysis of Mouse and Human Cardiac Maturation. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 14 (4), 207-215 (2016).

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