Medición altamente sensible de la permeabilidad glomerular en ratones con isotiocianato de fluoresceína-polisucrosa 70

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para probar la permeabilidad glomerular en ratones usando un trazador no radioactivo altamente sensible. Este método permite análisis repetitivos de orina con pequeños volúmenes de orina.

Resumen

La pérdida de albúmina en la orina (albuminuria) predice el resultado cardiovascular. En condiciones fisiológicas, pequeñas cantidades de albúmina son filtradas por el glomérulo y reabsorbidas en el sistema tubular hasta que se alcanza el límite de absorción. Los primeros aumentos en la filtración patológica de albúmina pueden, por lo tanto, perderse mediante el análisis de la albúmina. Por lo tanto, el uso de trazadores para probar la permselectividad glomerular parece ventajoso. El trazador fluorescentemente etiquetado isotiocianato de fluoresceína (FITC)-polisucrosa (es decir, FITC-Ficoll), se puede utilizar para estudiar la permselectividad glomerular. Las moléculas FITC-polisucrosa son filtradas libremente por el glomérulo pero no reabsorbidas en el sistema tubular. En ratones y ratas, FITC-policrorosa se ha investigado en modelos de permeabilidad glomerular mediante el uso de procedimientos técnicamente complejos (es decir, mediciones radiactivas, cromatografía líquida de alto rendimiento [HPLC], filtración de gel). Hemos modificado y facilitado un protocolo basado en trazador de policrorosa FITC para probar aumentos tempranos y pequeños en la permeabilidad glomerular a FITC-policrorosa 70 (tamaño de la albúmina) en ratones. Este método permite análisis repetitivos de orina con pequeños volúmenes de orina (5 l). Este protocolo contiene información sobre cómo se aplica por vía intravenosa el trazador FITC-policrorosa 70 y la orina se recoge a través de un simple catéter urinario. La orina se analiza a través de un lector de placas de fluorescencia y se normaliza a un marcador de concentración de orina (creatinina), evitando así procedimientos técnicamente complejos.

Introducción

Los defectos funcionales o estructurales dentro de la barrera de filtración glomerular aumentan la permeabilidad glomerular a la albúmina, lo que resulta en la detección de albúmina en la orina (albuminuria). La albúmina predice el resultado cardiovascular y es un marcador importante para la lesión glomerular¹. Incluso los niveles bajos de albúmina, que se encuentran dentro del rango normal, se asocian con un aumento del riesgo cardiovascular¹.

En condiciones fisiológicas, la albúmina se filtra a travésdel glomérulo y se reabsorbe casi por completo en el sistema tubular 2,^3. En ratones, la detección de albúmina en la orina suele realizarse mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de albúmina (ELISA) a partir de las 24 horas de recolección de orina. Si se utiliza orina de una colección de orina de 24 horas o orina manchada, se pueden perder pequeñas diferencias en las concentraciones de albúmina debido a problemas de sensibilidad al ensayo. La mayoría de los investigadores, por lo tanto, utilizan modelos animales en los que la albuminuria es inducida por una lesión renal robusta debido a toxinas, medicamentos y cirugía renal.

Por lo tanto, la búsqueda de un método sensible para detectar pequeños y transitorios cambios en la permeabilidad glomerular es muy importante para el campo. Rippe et al. han presentado un modelo de rata para probar la permeabilidad glomerular mediante la aplicación de un trazador con etiqueta fluorescente, a saber, FITC-polisucrose 70 (es decir, FITC-Ficoll 70), en el tamaño de la albúmina⁴. La aplicación de trazador permite la prueba de cambios a corto plazo en la permeabilidad glomerular (en cuestión de minutos) y es muy sensible⁴. Dos estudios han utilizado elmétodo trazador en ratones 5,⁶. A pesar de sus beneficios, este método, por desgracia, tiene desventajas: es técnicamente muy complejo, radiactivo e invasivo. El análisis posterior de la orina sólo se realiza mediante el uso de filtración de gel o tamaño-exclusión HPLC^5,6.

Dentro de este artículo, presentamos un método alternativo, sensible, no radioactivo y rápido para medir la permeabilidad glomerular en ratones utilizando fluorescentemente etiquetado FITC-policrorosa 70. Mediante la introducción de un catéter transuretral, la recolección de orina es menos invasiva que la punción vesical, la uretrotomía y la aplicación de catéter suprapúbico, y permite la recolección de orina al menos cada 30 minutos. El análisis de orina se realiza a partir de pequeñas cantidades (5 ol) utilizando un lector de placas fluorescentes. Las concentraciones de trazador en la orina se normalizan a las concentraciones de creatinina en la orina mediante un ensayo de creatinina enzimática.

Por lo tanto, este novedoso método ofrece una herramienta sensible para estudiar lesiones glomerulares tempranas con mayor permeabilidad glomerular.

Protocolo

Las investigaciones se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices descritas en la Guía para el cuidado y el uso de animales de laboratorio (Publicación No 85-23 de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos, revisada en 1996). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las aprobaciones institucionales pertinentes (el gobierno estatal Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] número de referencia 84-02.04.2012.A397).

1. Preparación de instrumentos, soluciones y equipos

1. Reconstituir FITC-policrorosa 70 con cloruro de sodio estéril al 0,9% (NaCl) a una concentración final de 10 mg/ml (es decir, 100 mg en 10 ml de NaCl).
2. Dialyze FITC-policrose 70 solución para eliminar las moléculas FITC libres durante la noche a 4 oC (corte de peso molecular [MWCO] a 10.000). Utilice 1 L de NaCl estéril al 0,9% por 10 ml de FITC-policrorosa 70 bajo agitación constante. Proteger de la luz. Aliquot el dializado FITC-policrorosa 70 y almacenarlo a -20 oC.
3. Para la solución FITC-policrorosa 70 bolus, añadir 4 ml de 10 mg/ml de fitC-polisucrosa 70 solución a 996 ml de 0,9% de NaCl (la concentración final de FITC-policrorosa 70: 40 g/ml).
4. Para la solución de perfusión de equilibrio, añadir 20 ml de una solución de 10 mg/ml de FITC-polisucrosa 70 a 9,98 ml de NaCl estéril al 0,9% que produzca una concentración final de 20 g/ml.
5. Para la solución experimental, añadir fármacos o sustancias a la solución de perfusión (por ejemplo, para angiotensina II [Ang II] [100 ng/kg/min] para un ratón de 25 g, añadir 3 ml de Ang II de una solución de 1 mM).
6. Para la cirugía, prepare una afeitadora, dos abrazaderas quirúrgicas, un par de tijeras quirúrgicas, dos pinzas, dos pinzas finas, un par de tijeras finas y hisopos. Prepare dos hilos de seda de 10 cm (4-0 a 6-0) para los procedimientos de ligadura.
7. Para la colocación de un catéter venoso central, prepare una jeringa de 10 ml con una aguja de 21 G. Coloque la punta de la aguja en un catéter de 30 cm de largo (con un diámetro interior [ID] de 0,58 mm). Conecte el catéter de 0,58 mm a un catéter de 10 cm (con una identificación de 0,28 mm). Corte la punta del catéter oblicuo más pequeño para crear una punta afilada que se introduce en la vena yugular.
8. Preparar la anestesia (es decir, ketamina de anestesia intraperitoneal, 100 mg/kg de peso corporal, y xilazina, 5 mg/kg de peso corporal).
9. Prepare un angiocatéter de 22 G descartando la aguja y marcando el catéter a 1 cm de la punta. Precalentar la almohadilla de calentamiento a 37 oC.
10. Prepare un dispositivo de presión arterial y cambie la membrana de medición de la presión arterial si es necesario.

2. Fase de preparación

1. Catéter urinario
   NOTA: La sección 2.1 sigue el protocolo descrito por Reis et al.⁷. La Figura 1 y la Figura Suplementaria 1 muestran la colocación de un catéter urinario en ratones hembras.
   1. Anestetizar el ratón con ketamina/xilazina (ver paso 1.8). Utilice la prueba del dedo del pie para confirmar la anestesia adecuada. Para mantener la anestesia, repita la anestesia (por ejemplo, con la mitad de la dosis) después de 60 min. Se confirma la anestesia adecuada si la prueba de pellizco del dedo del rallado no da lugar a la retirada del reflejo.
      NOTA: En este protocolo se utilizan ratones FVB hembra.
   2. Coloque el ratón en la recumbencia dorsal en una almohadilla de calentamiento de 37 oC. Apriete la parte inferior del abdomen y encuentre el ostium uretral (por ejemplo, bajo un microscopio).
   3. Utilice la parte plástica del catéter de un angiocatéter de 22 G y lubrique con gel de xilocaína. Introducirlo cuidadosamente 3 mm en el ostium uretral mientras se paralece el eje uretral distal (Figura1A).
   4. Gire la parte superior del angiocatéter 180o manteniendo la punta dentro del ostium uretral y manteniendo el eje de la uretra (Figura1B).
   5. Introducir el catéter 7 mm más en el ratón para que se coloque dentro de la vejiga (Figura1C). No fuerce el catéter más allá de la resistencia. Corrija la posición del catéter desde el principio si se siente resistencia. Tenga en cuenta que si la posición del catéter urinario es correcta, la orina ya puede aparecer dentro del catéter.
   6. Coloque un tubo marrón de 1,5 ml sobre la parte superior del angiocatéter para recoger la orina. Aplicar 1 ml de 0,9% De NaCl por vía subcutánea para mejorar la producción de orina.
2. Catéter venoso central
   1. Afeitar el cuello del ratón y colocarlo en la recumbencia con la cabeza hacia el cirujano. Hiperextender la cabeza del ratón con una cinta.
   2. Desinfectar el cuello con 70% isopropanol. Haga una pequeña incisión en la piel (5 mm) por debajo de la mandíbula, usando una pinza y un par de tijeras. Cortar la piel aproximadamente 1 cm en la dirección del esternón hasta que se alcance el centro del esternón.
   3. Disecciona cuidadosamente la piel en el lado derecho del cuello, usando un par de tijeras. Haga una incisión rectangular de la piel en el lado derecho del ratón para exponer el tejido blando del cuello. Usa unas tijeras y una pinza. Fije las aletas de la piel con dos abrazaderas.
      NOTA: La vena yugular corre a lo largo del lado izquierdo de la glándula tiroides o está ligeramente cubierta por el lóbulo derecho de la glándula tiroides. Después de este paso, use un microscopio para la cirugía.
   4. Exponer cuidadosamente la vena yugular mediante una preparación contundente, utilizando la punta de la pinza fina. Evite lesiones en las ramas de las venas.
      NOTA: Puede ser necesario extraer el tejido con tijeras finas. Tenga cuidado al usar tijeras para extraer tejido, ya que aumenta el riesgo de sangrado.
   5. Coloque y cierre una ligadura con un hilo de seda (4-0 a 6-0) en la parte distal de la vena yugular visible (hacia la cabeza del ratón). Ponga tensión en la ligadura fijando el hilo de seda con una cinta para asegurar una ligera tensión en la vena yugular. Prepare una ligadura alrededor de la parte proximal de la vena yugular.
   6. Llene el catéter con la solución de perfusión de equilibrio (ver paso 1.4) y fije el catéter con una cinta adhesiva para que el catéter alinee la vena yugular. Control de burbujas para evitar la embolia de aire.
   7. Levante la vena yugular con pinzas finas en el lugar de inserción (el sitio de inserción es de 1-2 mm proximal de la ligadura). Alinee el tubo paralelo a la vena yugular. Perforar la vena yugular, apuntando hacia el lumen, e insertar para aproximadamente 2-4 mm, en paralelo el eje de la vena yugular. Evite los movimientos rápidos.
   8. Cierre la ligadura para fijar el catéter. Control de la estanqueidad de la ligadura mediante la visualización cuidadosa a través del microscopio. Ponga un hisopo húmedo sobre el lugar de la cirugía.
3. Medición de la presión arterial
   1. Coloque el manguito de cola en la parte inferior de la cola del ratón mientras el ratón se acostó en la recumbencia dorsal. Inicie las mediciones y repitalas 10 veces por punto de tiempo. Construir una media a partir de las mediciones.
   2. Ajuste la posición del manguito de la cola si las mediciones de la presión arterial no parecen correctas y se producen datos falsos.

3. Fase de equilibrio

1. Cambie el tubo de recolección urinaria antes de que comience la fase de equilibrio y colóquelo en hielo.
2. Introducir una jeringa de 10 ml llena de solución de fase de equilibrio FITC (ver paso 1.4) con una aguja de 21 G y el catéter más grande (con un ID de 0,58 mm) y colocarla en la bomba de la jeringa.
3. Doble un hisopo y colóquelo alrededor del catéter de pequeño recipiente (con una identificación de 0,28 mm) que se introduce en la vena yugular. Coloca el catéter dentro del hisopo. Coloque una abrazadera sobre el hisopo para abolir el flujo sanguíneo retrógrado o la embolia aérea. Conecte una aguja de 27 G con una jeringa de 1 ml llena con el bolo FITC hasta el extremo del catéter de recipiente pequeño.
4. Abra la abrazadera y aplique el bolo FITC (100 l). Cierre la abrazadera de nuevo y conecte el catéter más grande con el catéter más pequeño. Encienda la bomba de jeringa con 0,008 ml/min (0,480 ml/h). Continúe la perfusión durante 60 min.

4. Fase experimental

NOTA: En esta fase, se puede investigar el efecto de los fármacos sobre la permselectividad glomerular.

1. Cambie el tubo urinario (punto de tiempo 0 min) a otro tubo marrón de 1,5 ml. Coloque un hisopo alrededor del catéter de recipiente pequeño y cierre una abrazadera como se indica en el paso 3.3.
2. Desconecte el catéter grande del catéter de recipiente pequeño. Cambie las jeringas a las soluciones de fase experimental (ver paso 1.5). Deje que la bomba de perfusión funcione de modo que el catéter grande se llene con la solución de equilibrio.
3. Vuelva a conectar los catéteres evitando la embolia de aire y vuelva a abrir la abrazadera. Encienda la bomba de jeringa a 0,008 ml/min.
4. Continúe ejecutando la bomba de la jeringa durante 60 minutos y recoja la orina dentro del tubo urinario a partir de entonces (orina 60 min). Coloque el tubo de orina en hielo.
5. Sacrificar el ratón por luxación cervical durante la anestesia. Antes de la eliminación, el ratón se observa durante 5 minutos para asegurarse de que está muerto.

5. Análisis de orina

1. Medición de fluorescencia
   1. Descongelar la piscina urinaria y diluirla 1:10 con solución salina con fosfato tampón (PBS).
      NOTA: La piscina urinaria es un charco de orina que se ha recogido de ratones sanos en una colección de orina de 12-24 h en una jaula metabólica.
   2. Preparar normas para la medición de fluorescencia. Tome 10 tubos marrones de 1,5 ml y etiquételos para blanco (1:10 piscina de orina diluida) y las siguientes concentraciones de FITC-policrorosa 70 (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 y 160 g/ml).
   3. Pipet 246 l de piscina de orina diluida en un tubo marrón de 1,5 ml y añadir 4 l de la concentración de material FITC-polisurosa 70 (ver paso 1.1) para obtener una concentración final de 160 g/ml FITC-policrorosa 70. Pipet 100 l de la piscina de orina diluida en todos los demás tubos.
   4. Diluir 1:2 pipeteando 100 l del tubo de 160 g/ml FITC-polisucrosa 70 en el tubo de 80 g/ml y continúe con las otras concentraciones. Asegurar la mezcla adecuada de las concentraciones diluidas (por ejemplo, vórtice el tubo antes de continuar).
   5. Diluir las muestras de orina del ratón (0 min, 60 min) 1:10 con piscina urinaria diluida.
   6. Pipetear 5 l de cada concentración estándar de FITC-policrorosa 70 y de las muestras de orina del ratón como triplicados en una placa negra de 384 pocillos. Centrifugar la placa a 1.000 x g durante 15 s para evitar burbujas.
   7. Analice la placa de 384 pocillos en un lector de placas. Realizar excitación a 496 nm y medir la fluorescencia a 525 nm.
2. Medición de creatinina
   1. Siga las instrucciones del fabricante. En resumen, prepare las normas de creatinina diluyendo 10 ml de la solución estándar de creatinina de 100 mM con 990 ml de tampón de ensayo de creatinina para preparar una solución estándar de 1 mM.
   2. Agregue 0, 2, 4, 6, 8 y 10 l de la solución estándar de creatinina de 1 mM en una placa de 96 pocillos para generar 0, 2, 4, 6, 8 y 10 nmol/estándares de pozo, respectivamente. Añadir tampón de ensayo de creatinina a cada pozo para llevar el volumen a 50 sL.
   3. Preparar las mezclas de reacción añadiendo 42–44 l de tampón de ensayo de creatinina, 2 s de creatinasa, 2 ml de creatininasa, 2 l de mezcla enzimática de creatinina y 2 s de sonda de creatinina. Para el espacio en blanco, utilice 44 s de tampón de ensayo de creatinina, 2 ml de creatinasa, 2 ml de mezcla enzimática de creatinina y 1–2 l de sonda de creatinina.
   4. Añadir 50 l de la mezcla de reacción apropiada a cada pocto en la placa de 96 pocillos e incubarla durante 60 minutos en una coctelera horizontal a 37 oC. Proteja la placa de la luz durante la incubación. Mida la absorbancia a 570 nm en un lector de placas.
   5. Calcule las concentraciones de creatinina restando el valor en blanco de todas las lecturas. El resultado tendrá la unidad nanomoles/microlitro. Multiplique la concentración de creatinina por el peso molecular de la creatinina (113,12 ng/nmol) para recibir la unidad nanogramos/microlitro.

6. Análisis de datos

1. Calcule la concentración de orina FITC-policrorosa 70 a partir de la curva estándar.
2. Hacer referencia a las concentraciones de orina FITC-policrorosa 70 a las concentraciones de creatinina en la muestra de orina representativa.
3. Hacer referencia a la orina muestras de 60 minutos a la orina 0 min muestras de controles y ratones tratados.

Resultados

Como se muestra en la Figura2, el método para probar la permeabilidad glomerular en ratones se construye en tres fases. La primera fase se denomina fase de preparación, en la que se colocan un catéter urinario y un catéter venoso central. La segunda fase se denomina fase de equilibrio, comenzando con una inyección intravenosa en bolo de FITC-policrorosa 70 y seguida de la perfusión continua de FITC-policrorosa 70 durante 60 min. La última fase se denomina fas...

Discusión

El método presentado permite al investigador probar la permeabilidad glomerular en ratones de una manera muy sensible utilizando un trazador. Con este método, los aumentos a corto plazo en la permeabilidad glomerular se pueden diagnosticar utilizando sólo pequeñas cantidades de orina. Los pasos más críticos para dominar con éxito esta técnica son 1) el desarrollo de la experiencia manual en cirugía de ratón, especialmente en la cannulación de una vena central, 2) la colocación del catéter urinario sin dañar la mucosa, y ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Motic SMZ168 BL	Microscopio	de SMZ168BL	Motic
con ratones KL1500LCD	Microscopía de Pulch y Lorenz	150500	luz para cirugía con ratones
Microfederschere	Braun, Aesculap	FD100R	tijeras finas
Durotip Feine Scheren	Braun, Aesculap	BC210R	para corte de cuello
Anatomische Pinzette	Braun, Aesculap	BD215R	para cirugía
Prä parierklemme	Aesculap	BJ008R	para cirugía
Seraflex	Serag Wiessner IC108000		seda
Ketamina 10%	Anestesia	Medistar
Rompun (xilacina) 2%	Anestesia	Bayer
Tubo de polietileno de diámetro interior fino 0,28 mm de diámetro exterior 0,61 mm	Catéter Portex	800/100/100
Diámetro interior del tubo de polietileno de diámetro fino 0,58 mm de diámetro exterior 0,96 mm	Catéter Portex	800/100/200
Aparato Harvard 11 Plus	Aparato Harvard	70-2209	bomba de jeringa
BD Insyte Autoguard	BD	381823	catéter urinario
detector multimodo DTX 880	Beckman Coulter	lector de placas
384 pocillos	Nunc	262260	platte de 384 pocillos
kit de ensayo de creatinina	Sigma-Aldrich	MAK080	para medir la concentración de creatinina
placa de 96 pocillos	Nunc	260836	para ensayo de creatinina
Polisucrosa marcada con FITC 70	TBD Consultancy	FP70	FITC-ficoll
Angiotensina II	Sigma-Aldrich	A9525	utilizada para probar la permeabilidad glomerular
BP-98A	Softron		para la medición de la presión arterial
OTS 40.3040	Medite	01-4005-00	calefactora para cirugía con ratones
Instillagel 6mL	Farco-Pharma GmbH		para catéter urinario
Exacta	Aesculap	GT415	afeitadora