Un análisis de alto rendimiento para la predicción de toxicidad química por perfiles fenotípicos automatizado de Caenorhabditis elegans

Resumen

Se ha desarrollado un método cuantitativo para identificar y predecir la toxicidad de productos químicos, analizando automáticamente los perfiles fenotípicos de Caenorhabditis elegans. Este protocolo describe cómo tratar gusanos con productos químicos en una placa de 384 pozos, capturar videos y cuantificar fenotipos relacionados toxicológicos.

Resumen

Aplicación de ensayos de toxicidad de químicos en los organismos superiores de la orden, tales como ratones o ratas, es lento y costoso, debido a su larga vida útil y problemas de mantenimiento. Por el contrario, el nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) tiene ventajas que lo hacen una opción ideal para las pruebas de toxicidad: una vida corta, fácil cultivo y reproducción eficiente. Aquí, describimos un protocolo para la automática perfiles fenotípicos de C. elegans en una placa de 384 pozos. Los gusanos nematodos son cultivados en una placa de 384 pozos con líquido medio tratamiento físico-químico, y videos se toman de cada pozo para cuantificar la influencia química de 33 características de gusano. Resultados experimentales demuestran que las características de fenotipo cuantificada pueden clasificar y predecir la toxicidad aguda de compuestos químicos diferentes y establecer una lista de prioridades para más pruebas de la evaluación de la toxicidad química tradicional en un modelo roedor.

Introducción

Junto con el rápido desarrollo de compuestos químicos aplicados a la producción industrial y la vida cotidiana de las personas, es importante estudiar la toxicidad pruebas modelos de los productos químicos. En muchos casos, el modelo animal de roedor se emplea para evaluar la potencial toxicidad de diferentes productos químicos sobre la salud. En general, la determinación de concentraciones letales (es decir, el ensayo 50% dosis letal [DL50] de diferentes productos químicos) se utiliza como parámetro tradicional en un modelo de roedor (rata/ratón) en vivo, que es muy costoso y desperdiciador de tiempo. Además, debido a reducir, afinar, o sustituir (3R) principio funda....

Protocolo

El protocolo sigue las pautas de cuidado de los animales del Comité de ética Animal del centro de Beijing para la prevención de enfermedades y el Control en China.

1. química preparación

1. Obtener productos químicos (tabla 1 y Tabla de materiales).
2. Determinar la dosis más alta y más baja de los productos químicos individuales para una concentración mínima del 100% de mortalidad (LC100, 24 h) y una concentración máxima de 100% nonlethality (LC0, 24 h) a los gusanos. Use al menos seis diluciones de la mayor concentración (tabla 1).
   Nota: Realizar un gusano preliminar mort....

Resultados

Hemos probado los fenotipos de gusanos expuestos a diferentes concentraciones de más de 10 productos químicos¹². En la prueba, se cuantificaron 33 características distintas para cada producto químico compuesto en tres puntos del tiempo (0 h, 12 h y 24 h). Anteriormente, una comparación entre un manual y un análisis automático de un ensayo de vida útil se realizó^11,12. En este ensayo, se encontró que los pro.......

Discusión

Las ventajas de la C. elegans han conducido a su creciente uso en toxicología⁹, para el estudio de mecanismos y métodos de cribado de alto rendimiento. Un papel creciente para C. elegans en complementar otros sistemas modelo en la investigación toxicológica ha sido notable en los últimos años, especialmente para la evaluación rápida de la toxicidad de nuevos productos químicos. Este artículo proporciona un nuevo ensayo de cribado de alto rendimiento, cuantitativa del gusano fenot.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
2-Propanol	Sigma-Aldrich	59300
Placas de 384 pocillos	Throme	142761
Agar	Bacto	214010
Sulfato de atropina	Sigma-Aldrich	PHL80892
Tampón			0,5 mL de NaOH de 10 M, 0,5 mL de NaClO al 5%, 9 mL de agua ultrapura
Cloruro de cadmio	Sigma-Aldrich
Cloruro de calcio	Sigma-Aldrich	21074
Cámara CCD	Zeiss	AxioCam HRm	Microscopía Zeiss
GmbH Colesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Sulfato de cobre (II)	Sigma-Aldrich	451657
Etanol	Sigma-Aldrich	24105
Etilenglicol	Sigma-Aldrich	324558
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
K-Medium			3,04 g de NaCl y 2,39 g de KCl en 1 L de agua ultrapura
LB Broth			10  g/L  Triptona,  5  g/L  Levadura   Extracto,  5  g/L  NaCl
Sulfato de magnesio heptahidratado	Sigma-Aldrich	63140
NGM Placa			3 g de NaCl, 17 g de agar, 2,5 g depeptona en 1 L de agua ultrapura, después del autoclave añadir 1 mL de colesterol (5 mg/mL en etanol), 1 mL de MgSO4 (1 M), 1 mL de CaCl2 (1 M), 25 mL de tampón PPB
Peptona	Bacto	211677 Cloruro
de potasio	Sigma-Aldrich	60130
Fosfato de potasio dibásico	Sigma-Aldrich	795496
Fosfato de potasio monobásico	Sigma-Aldrich	795488
tampón			35,6 g de K2HPO4, 108,3 g de KH2PO4 en 1 L agitador de agua ultrapura
	ZHICHENG	ZWY-200D
Cloruro de sodio	Sigma-Aldrich	71382
Fluoruro de	sodioSigma-Aldrich	s7920
Hidróxido de sodio	Sigma-Aldrich	71690
Solución de hipoclorito de sodio	Sigma-Aldrich	239305
El enlace del programa			https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate
Triptona	Sigma-Aldrich	T7293
Extracto de levadura	Sigma-Aldrich	Microscopio automático Y1625
Zeiss	Zeiss	AXIO Observer.Z1	Microsco automático Zeiss con software patentado Zen2012 y cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD)

de lejía 202908 PPB