Preparación de hongos y materiales vegetales para la elucidación estructural mediante RMN de estado sólido de polarización Nuclear dinámica

Resumen

Se presenta un protocolo para preparar ¹³C,¹⁵marcado con N muestras de hongos y plantas para espectroscopia de RMN de estado sólida multidimensional y las investigaciones de la polarización nuclear dinámica (DNP).

Resumen

Este protocolo muestra cómo uniformemente ¹³C, ¹⁵N etiquetado materiales fungicidas pueden ser producidos y experimentos de cómo estos materiales blandos deben ser procedidos para NMR de estado sólido y la sensibilidad mejorada del DNP. También se detalla el procedimiento de procesamiento de las muestras de biomasa vegetal. Este método permite la medición de una serie de 1D y 2D ¹³C -¹³C / espectros de correlaciones de¹⁵N, que permite alta resolución elucidación estructural de complejos biomateriales en su estado natal, con la mínima perturbación. El isótopo de etiquetado puede ser examinado mediante la cuantificación de la intensidad en espectros 1D y la eficacia de la transferencia de polarización en espectros de correlación 2D. El éxito de la preparación de la muestra de la polarización nuclear dinámica (DNP) puede ser evaluado por el factor de mejora de la sensibilidad. Otros experimentos examinando los aspectos estructurales de los polisacáridos y las proteínas dará lugar a un modelo de la arquitectura tridimensional. Estos métodos pueden ser modificados y adaptados para investigar una amplia gama de materiales ricos en hidratos de carbono, incluyendo las paredes de la célula naturales de plantas, hongos, algas y bacterias, así como sintetizados o diseñado polímeros de hidratos de carbono y su complejo con otros moléculas.

Introducción

Hidratos de carbono juegan un papel central en varios procesos biológicos tales como almacenamiento de energía, construcción estructural y reconocimiento celular y adhesión. Se enriquecen en la pared celular, que es un componente fundamental en plantas, hongos, algas y bacterias^1,2,3. La pared celular sirve como una fuente central para la producción de biocombustibles y biomateriales, así como un objetivo prometedor para terapias antimicrobiana^4,5,6,7

Protocolo

1. crecimiento de ¹³C, ¹⁵N-labeled Aspergillus fumigatus medio líquido

1. Elaboración de etiqueta y ¹³C, ¹⁵medio marcado con N
   Nota: Ambos medio de levadura extracto peptona dextrosa (YPD) y la media mínima mejora⁴³ se utilizaron para el mantenimiento de la cultura fungicida. Se realizan todos los pasos después de autoclavar en campana de flujo laminar para reducir al mínimo la contaminación.
   1. Preparación de medio líquido sin etiqueta: Disolver 6,5 g de YPD polvo en 100 mL de agua destilada y luego autoclave durante 25 minutos a 134 ° C.
   2. Preparación de medio sólido....

Resultados

El etiquetado del isótopo sustancialmente incrementa la sensibilidad de NMR y hace posible medir una serie de 2D ¹³C -¹³C y ¹³C -¹⁵N espectros de correlación para analizar la composición, la hidratación, la movilidad y el embalaje de polímeros, que se integrarán para construir un modelo tridimensional de la arquitectura de la pared celular (figura 1). Si el etiquetado uniforme tiene éxito, un conjunto completo de 1D.......

Discusión

En comparación con los métodos bioquímicos, NMR de estado sólido tiene ventajas como una técnica no destructiva y de alta resolución. NMR es también cuantitativa en el análisis compositivo, y a diferencia de la mayoría otros métodos analíticos, no han las incertidumbres introducidas por la solubilidad limitada de los biopolímeros. Establecimiento del protocolo actual facilita futuros estudios sobre biomateriales ricos en hidratos de carbono y polímeros funcionalizados. Sin embargo, debe señalarse que el análisis de datos.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Molibdato de amonio tetrahidrato	Acros Organics	12054-85-2
AMUPol	Cortecnet	C010P002
Balanza de pesaje analítica	Ohaus	B730439218	Modelo PA84C
Bioclave 16 L	VWR	470230-598
Armario de bioseguridad	Labconco corporation	302319100
Ácido bórico	Tienda VWR	BDH9222	a las 15-30 ° C
Cloruro de cobalto (II) hexahidratado	Honeywell |Fluka	60820	≥ 98 %
Sulfato de cobre (II) pentahidratado	BDH	BDH9312	≥ 98 %
Corning Incubadora de agitación LSE	Thermo Fisher Scientific	7202152
D2O	Sigma Aldrich	151882	99,9 átomo
% D d6-DMSO	Sigma Aldrich	151874	99,9 átomo % D
d8-glicerol	Sigma Aldrich	447498	≥ 99 átomo %
D Tubo de diálisis 3,2 kDa	Sigma	Aldrich D2272	132724
Fosfato dipotásico	VWR	BDH9266	≥ 98 %
Glicerol	Sigma Aldrich	G5516	≥ 99.5 %
Centrífuga Heraus Megafuge 16R	Thermo Fischer Scientific	750004271	Máximo RCF 25,830 x g
HR-MAS Kit de inserto desechable	Bruker	B4493	Kel-F
Sulfato de hierro (II) Heptahidratado	Alfa Aesar	14498	≥ 99+ %
Sulfato de magnesio Heptahidratado	VWR	10034998	almacenar a 18-26 ° C
Cloruro de manganeso (II) tetrahidratado	Alfa Aesar	11563	≥ 99 %
Fosfato monopotásico	VWR	470302-254	≥ 99 %
Medidor de pH	Mettler Toledo B706689216
Etilendiaminatetraacetato tetrasódico	Acros Organics	13235-36-9	≥ 99.5 %
Sulfato de zinc heptahidratado	Alfa Aesar	33399	≥ 98 %
12C3, d8-glicerol	Cambridge Isotope Laboratory	CDLM-8660	12C3, 99,95%; D8, 98%
13C6-glucosa	Sigma Alrdrich 364606		≥ 99 % (PC)
15N-nitrato sódico	Sigma Aldrich	364606	≥ 98 % 15N, ≥ 99 (cp)
Zafiro de 3,2 mm Rotor NMR	Cortecnet	B6939
Tapón de silicona de 3,2 mm	Bruker	B7089
4 mm Kit de rotor MAS	Bruker	H14355	Zirconia