Evaluación morfológica y funcional de sinapsis de cinta en regiones de frecuencia específica de la Cóclea de Ratones

Summary

Este manuscrito describe un protocolo experimental para evaluar las características morfológicas y el estado funcional de las sinapsis de cinta en ratones normales. El modelo actual también es adecuado para modelos de sinaptopatía coclear inducidas por ruido y relacionados con la edad. También se discuten los resultados correlativos de estudios anteriores del ratón.

Abstract

Las células del vello interno coclear (ICH) transmiten señales acústicas a las neuronas ganglionares espirales (SGN) a través de las sinapsis de cinta. Varios estudios experimentales han indicado que las sinapsis de células pilosas pueden ser los objetivos iniciales de la hipoacusia neurosensorial (SNHL). Tales estudios han propuesto el concepto de "sinaptoopatía" coclear, que se refiere a alteraciones en el número, estructura o función de la siinas de cinta que dan lugar a una transmisión sináptica anormal entre los IHC y los SCN. Si bien la sinaptoopatía coclear es irreversible, no afecta al umbral auditivo. En los modelos experimentales inducidos por ruido, se emplean daños restringidos a las sinapsis de IHC en regiones de frecuencia selectas para identificar los factores ambientales que causan específicamente la sinaptopatía, así como las consecuencias fisiológicas de perturbar este oído interno Circuito. Aquí, presentamos un protocolo para analizar la morfología sináptica coclear y la función en una región de frecuencia específica en ratones adultos. En este protocolo, la localización coclear de regiones de frecuencia específicas se realiza utilizando mapas de frecuencia de lugar junto con datos de coclearografía, tras los cuales las características morfológicas de las sinapsis de cinta se evalúan a través de sinápticas Immunostaining. El estado funcional de las sinapsis de cinta se determina entonces en función de las amplitudes de la respuesta auditiva del tronco cerebral (ABR) onda I. El presente informe demuestra que este enfoque puede utilizarse para profundizar nuestra comprensión de la patogénesis y los mecanismos de la disfunción sináptica en la cócleara, lo que puede ayudar en el desarrollo de nuevas intervenciones terapéuticas.

Introduction

Las frecuencias en el rango de aproximadamente 20 u201220,000 Hz pueden ser percibidas como estímulos auditivos por los seres humanos. La audición humana es normalmente más sensible cerca de 1.000 Hz, donde el nivel medio de presión sonora es de 20 oP en adultos jóvenes (es decir, 0 decibelios de nivel de presión sonora [dB SPL]). En algunas condiciones patológicas, la pérdida auditiva está restringida a frecuencias específicas. Por ejemplo, en las primeras etapas de la pérdida auditiva inducida por ruido (NIHL), se puede observar una "notch" (es decir, elevación del umbral auditivo) en el audiograma a 4 kHz¹. A lo largo de la partición coclear....

Protocol

Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía NRC/ILAR para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (8a Edición). El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica Capital, Beijing, China.

1. Selección de animales

1. Para todos los experimentos, utilice ratones macho c57BL/6J adultos (8 semanas de edad) como modelo animal.
   NOTA: Los ratones C57BL/6J que llevan una variante de empalme del Cdh23 presentan una senescencia acelerada en el sistema auditivo, reflejada como una pérdida del 40% de las sinapsis de cinta e....

Results

Se realizaron pruebas auditivas de ABR para 10 ratones C57BL/6J (8 semanas de edad) bajo anestesia. Los Abs se introdujeron utilizando estímulos de ráfaga de tono a 4, 8, 16, 32 y 48 kHz. El umbral auditivo de cada animal se detectó visualmente distinguiendo al menos una forma de onda clara en el ABR. Todos los ratones mostraron umbrales de ABR en respuesta a ráfagas de tono, que oscilan entre 25 y 70 dB SPL dependiendo de la frecuencia del estímulo. Nuestros resultados indicaron que el umbral auditivo

Discussion

Dado que la sinaptoopatía coclear se caracterizó por primera vez en ratones adultos con un desplazamiento temporal de umbral (TTS) inducido por el ruido de banda de octava de 8 u201216 kHz a 100 dB SPL durante 2 h³¹, los investigadores han investigado cada vez más los efectos de la sinaptopatía en varios mamíferos, incluyendo monos y humanos^32,33. Además de la exposición al ruido, varias otras condiciones se han asociado con la sinaptopatí.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Clorhidrato de ketamina	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, China	H35020148	100 mg/kg
Clorhidrato de xilacina	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.	X-1251	10 mg/kg
Aparato de fisiología TDT	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, EE. UU	Sistema de Fisiología Auditiva III
Software SigGen/BioSig	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, EE. UU.	Sistema de Fisiología Auditiva III
Almohadilla eléctrica	Pet Fun	11072931136
Dumont 3#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canadá	0203-3-PO
Pinzas Dumont 5#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Canadá	0209-5-PO
Microscopio estereoscópico de disección	Nikon Corp., Tokio, Japón	SMZ1270
Suero	de cabra ZSGB-BIO, Pekín, China	ZLI-9021
Receptor anti-glutamato 2, extracelular, clon 6C4	Millipore Corp., Billerica, MA, EE. UU	Ratón MAB397
Ratón purificado anti-CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, EE. UU	. 612044	ratón
Alexa Fluor 568 cabra anti-ratón IgG1anticuerpo	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU.	A21124	cabra
Alexa Fluor 488 cabra anti-ratón anticuerpo IgG2a	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EE. UU.	A21131	cabra
Medio de montaje que contiene DAPI	ZSGB-BIO, Pekín, China	ZLI-9557
Microscopía fluorescente confocal	Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania	TCS SP8 II
Image Pro Plus software	Media Cybernetics, Bethesda, MD, EE. UU	versión 6.0
Otoscopio de bolsillo de diagnóstico profesional	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Shanghai, China	HS-OT10
Electrodo de aguja	Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an, China	1029	20 mm, 28 G
Campo cerrado Ponente	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, EE. UU	CF1