Aislar maligno y no maligno de células B lck:eGFP pez cebra

Resumen

Pez cebra transgénico lck:eGFP expresan GFP altamente en los linfocitos T y se han utilizado para estudiar el desarrollo de las células T y leucemia linfoblástica aguda. Esta línea puede utilizarse para células de estudio B, que expresan lck en niveles inferiores. Este protocolo describe la purificación de las células B malignas y no malignas del pez cebra lck:eGFP .

Resumen

Pez cebra (Danio rerio) son un poderoso modelo para estudiar el desarrollo de linfocitos. Como mamíferos, D. rerio poseen un sistema inmune adaptativo que incluye linfocitos B y T. Estudios de linfopoyesis de pez cebra son difíciles porque anticuerpos reconociendo D. rerio marcadores de superficie celular generalmente no están disponibles, que complica el aislamiento y caracterización de poblaciones de diferentes linfocitos, incluyendo B-linaje células. Líneas transgénicas con expresión fluoróforo específico de linaje se utilizan a menudo para eludir este desafío. La línea transgénica lck:eGFP se ha utilizado para estudiar el desarrollo de las células T D. rerio y se ha utilizado también para el desarrollo del modelo de la célula de T y leucemia linfoblástica aguda (T-ALL). Aunque lck:eGFP peces se han utilizado ampliamente para analizar el linaje T, no ha utilizado para estudiar las células de B. Recientemente, hemos descubierto que muchas células de pez cebra B también expresan lck, aunque a niveles más bajos. Por lo tanto, las células lck:eGFP B además expresan bajos niveles de GFP. Basado en este hallazgo, hemos desarrollado un protocolo para purificar células B linaje de peces cebra lck:eGFP , que se presenta aquí. Nuestro método describe cómo utilizar un clasificador célula fluorescente activada (FACS) para purificar las células de B de pescado lck:eGFP o líneas relacionadas, tales como doble transgénico rag2:hMYC; Lck:EGFP de pescado. En estas líneas, las células B, células B particularmente inmaduras, GFP expreso en niveles bajos pero detectables, lo que les permite distinguirse de las células T que expresan GFP altamente. B células pueden ser aisladas de médula ósea, timo, bazo, sangre u otros tejidos. Este protocolo proporciona un nuevo método para purificar células B D. rerio , permitiendo estudios enfocados en temas como el desarrollo de las células B y linfocitos B malignos.

Introducción

Pez cebra ofrecen poderosos atributos, como manipulability genético, alta fecundidad, transparencia óptica y desarrollo rápido que facilitan el estudio del desarrollo de vertebrados utilizando enfoques genéticos. Estas ventajas, junto con las características compartidas de teleósteos y mamífera hematopoyesis, hacen D. rerio ideal para análisis in vivo de la linfopoyesis y linfocito función, desde su más temprana aparición en larvas a lo largo de la edad adulta. Desarrollo de sangre en el pez cebra depende de procesos genéticos bien conservados que se comparten con los mamíferos, y estos se extienden al sistema inmune adaptante. Además, los mecanismos molecula....

Protocolo

Todos los procedimientos de pez cebra fueron aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en el Universidad de Oklahoma Health Sciences Center.

1. aislar no malo B y los linfocitos T de transgénicos lck:eGFP pescado

1. Anestesiar los peces Metanosulfonato de 0.02% (MS-222) en el agua del sistema de pescado.
2. Examinar el pescado de 2 a 6 meses para thymi fluorescente, que se encuentran en el aspecto dorsomedial de la cavidad branquial del pez cebra y otros teleósteos¹⁴. Usar un microscopio de epifluorescencia (470/40 longitud de onda de excitación....

Resultados

Hemos utilizado la citometría de flujo para analizar y FACS para aislar GFP^lo y GFP^Hola células de timo, médula ósea riñón y bazo de pez cebra transgénico lck:eGFP . El análisis de peces 3 meses reveló que el timo contiene principalmente linfocitos GFP⁺ . Las células GFP⁺ fueron confinadas en gran parte a la puerta linfoide descrita por Traver et al¹⁷. Dos poblaciones distintas de la GFP⁺ , GFP^lo<.......

Discusión

Desarrollamos y proporcionar un protocolo para aislar las células de B de pez cebra transgénico lck:eGFP , añadir esto a otros modelos de D. rerio con linaje B etiquetas^3,4. Sorprendentemente, la identificación de GFP^lo B células en esta línea pasó desapercibida desde su descripción en el año 2004. Generalmente, lck es considerada específica de la célula de T⁶, pero estudios recientes encontraron expre.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
35 y micro; m mesh	Sefar Tecnología de filtro	7050-1220-000-13
5 mL Tubo de poliestireno de fondo redondo con tapón de filtro de celdas	Marca Falcon Corning	352235
Tubo cónico de 50 mL	VWR international	525-0448
AZ APO 100 Microscopio fluorescente	Nikon
Cytoflex	Beckman Coulter
DS-Qi1MC camara	de Nikon
; MS-222	Sigma	E-10521
FACSJazz	BD Biosciences
Suero fetal bovino	Thermo Fisher	10437028
FlowJo v10.2	FlowJo, LLC
em>lck:eGFP			Véase Langeneu et al., 2004
Software NIS Elements Nikon		versión 4.13
Penicilina-estreptomicina	Sigma	P4333
Homogeneizadores de microtubos Mortero	Ciencias de la Microscopía Electrónica	64788-20
Pipetas
rag2:hMYC-ER			Véase Gutierrez et al., 2011
RPMI Media 1640 1x	Life Technologies	11835-030

Metanolsulfonato de 3-aminobenzoato de etilo < de transferencia de plástico