Overexpressing larga Noncoding RNAs mediante activación de gen CRISPR

Carl  Robert Rankin; Janet Treger; Emmanuelle Faure-Kumar; Jihane Benhammou; Deborah Anisman-Posner; Alex  Edward Bollinger; Charalabos Pothoulakis; David Miguel Padua

doi:10.3791/59233

Artículo de método

Overexpressing larga Noncoding RNAs mediante activación de gen CRISPR

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DOI:

10.3791/59233

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1 de marzo de 2019

Carl Robert Rankin¹ , Janet Treger¹ , Emmanuelle Faure-Kumar² , Jihane Benhammou¹ , Deborah Anisman-Posner³ , Alex Edward Bollinger³ , Charalabos Pothoulakis¹ , David Miguel Padua¹

¹Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Department of Medicine, University of California, Los Angeles, ²Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Integrated Molecular Technologies (IMT) Core, Department of Medicine, University of California, Los Angeles, ³Division of Hematology and Oncology, Department of Medicine, University of California, Los Angeles

En este artículo

Resumen

Las técnicas tradicionales basados en cDNA sobreexpresión tienen una aplicabilidad limitada para la sobreexpresión de larga noncoding RNAs debido a sus múltiples formas de empalme con la funcionalidad potencial. Esta revisión informa un protocolo usando tecnología de CRISPR para sobreexpresar múltiples variantes de empalme de un ARN largo cubierta.

Resumen

Durante mucho tiempo los RNA (lncRNA) biología es un campo nuevo y emocionante de la investigación, con el número de publicaciones de este campo crece de manera exponencial desde el año 2007. Estos estudios han confirmado que lncRNAs se alteran en casi todas las enfermedades. Sin embargo, estudiando los roles funcionales de lncRNAs en el contexto de la enfermedad sigue siendo difícil debido a la falta de expresión tejido específica, niveles de expresión baja, productos proteicos, complejidades en formas de empalme y la falta de conservación entre las especies. Dada la expresión propios de cada especie, lncRNA estudios son a menudo restringidos a contextos de investigación al estudio de procesos de la enfermedad. Ya que lncRNAs la función a nivel molecular, una forma de diseccionar lncRNA biología es quitar el lncRNA o sobreexpresan los efectos celulares lncRNA y medida. En este artículo, se presenta un protocolo escrito y visualizar que sobreexpresan la lncRNAs in vitro. Como un experimento representativo, un lncRNA asociada a enfermedad inflamatoria intestinal, 1 de antisentido interferón Gamma (IFNG-AS1), muestra que es overexpressed en un modelo de Jurkat T-cell. Para lograr esto, la técnica activa de regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) agrupado se utiliza para permitir que la sobreexpresión en los lugares geométricos genomic endógenas. La técnica CRISPR activa apunta a un conjunto de factores de transcripción a la página de inicio transcripcional de un gen, lo que permite una fuerte sobreexpresión de múltiples formas de empalme lncRNA. Este procedimiento se divide en tres pasos, a saber (i) guía RNA (gRNA) diseño y vector construcción, generación (ii) virus y transducción de señales y proyección (iii) Colonia de sobreexpresión. Para este experimento representativo, un mayor de 20-fold mejora en AS1 de IFNG en células Jurkat T se observó.

Introducción

Mientras que la investigación biomédica más se ha centrado en la codificación de proteínas transcripción, la mayoría de los genes transcritos consiste en realmente de noncoding RNAs (comunicado 93 de Ensembl). La investigación actual está empezando a explorar este campo, con el número de publicaciones en lncRNAs en procesos de la enfermedad aumentando exponencialmente entre 2007 y 2017¹. Estas publicaciones muestran que muchos lncRNAs se asocian con la enfermedad. Sin embargo, los mecanismos moleculares de estas lncRNAs son difíciles de estudiar debido a sus diversas funciones en comparación con los mRNAs. Agrava el problema de entender el pape....