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Recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo de amarillo fluorescente proteína Tagged p62 en estructuras Aggresome inducida por

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DOI:

10.3791/59288

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26 de marzo de 2019

 ,  , 
1Core Imaging Facility and Department of Microbiology and Immunology, Loyola University Chicago, 2Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Loyola University Chicago

En este artículo

Resumen

Se describe un protocolo completo y práctico para la recuperación de fluorescencia después de photobleaching experimentos con células en vivo. Aunque el protocolo fue utilizado para medir la movilidad de amarillo fluorescente p62 etiquetado proteína de aggresome-como las estructuras inducidas, puede ser aplicado a una variedad de sistemas de microscopía y proteínas fluorescentes.

Resumen

Recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo (FRAP) es una técnica de microscopía que puede utilizarse para cuantificar la movilidad de la proteína en células vivas. En un experimento típico de FRAP, fluorescencia de estado estacionario se observa por proyección de imagen repetida con luz láser de baja intensidad. Posteriormente, las moléculas fluorescentes se deterioran rápidamente e irreversiblemente a través de la breve exposición a la luz de láser de alta intensidad. Información sobre movilidad de la proteína se obtiene mediante el control de la recuperación de la fluorescencia. Utilizamos FRAP para determinar la movilidad de p62 en aggresome inducidas estructuras (ALIS) en macrófagos murinos Tras estimulación con lipopolisacáridos (LPS). Porque muchos protocolos FRAP existentes son incompletos o complejo, nuestra meta era proporcionar un protocolo integral, práctico y sencillo paso a paso para FRAP experimentos con células vivas. Aquí, describimos 264.7 transfección de macrófagos con amarillo fluorescente proteína-p62 (YFP-p62), inducción de ALIS exponiendo las células LPS y un método paso a paso para la recolección de prebleach y postbleach FRAP imágenes y análisis de datos. Finalmente, se discuten factores importantes a considerar al realizar un experimento FRAP.

Introducción

Recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) es una técnica de microscopía que puede utilizarse para cuantificar la dinámica de la proteína en vivo las células1,2. La popularidad de FRAP ha aumentado debido a la amplia disponibilidad comercial de láser de barrido confocales Microscopios con alta resolución, velocidad y sensibilidad, y un "arco iris" de codificado genéticamente las proteínas fluorescentes, como el verde fluorescente la proteína (GFP) y proteína fluorescente amarilla (YFP)3. Proteínas fluorescentes genéticamente codificadas están fusionadas a la proteína de interés para permitir la localización subcelular de la proteína de interés. En un experimento típico de FRAP, se observa la fluorescencia de estado estacionario en una región de interés (ROI) dentro de una célula de adquisición vía proyección de imagen repetida de ROI con luz láser de baja intensidad. Posteriormente, las moléculas fluorescentes son rápidamente e irreversiblemente deterioradas en un subconjunto predefinido de la adquisición de ROI, en adelante el retorno de la inversión, el blanqueador por la breve exposición a la luz de láser de alta intensidad. Como nuevas proteínas sin blanquear reponer proteínas decoloradas con el tiempo, la velocidad y la intensidad de la recuperación de la fluorescencia en el blanqueador ROI proporciona información sobre la proteína movilidad (figura 1)4.

Nuestro interés en la determinación de la movilidad de la ubiquitina Unión proteína p62 (también conocido como sequestosome-1) en aggresome inducidas estructuras (ALIS) en macrófagos murinos de 264.7 después de estimulación con lipopolisacáridos (LPS) nos llevó a revisar el FRAP literatura. Desafortunadamente, muchos de los protocolos existentes de FRAP son incompletos o excesivamente complejos5,6,7,8,9. Algunos no proporcionan toda la información sobre la configuración de láser, haz ruta configuración e imagen adquisición parámetros5,6,7,8,9. Otros omiten detalles claves sobre análisis de datos, como forma de abordar el tema de bleach ROI deriva6,9 o cómo calcular los parámetros de recuperación importante, incluyendo la fracción móvil (Mf), la fracción inmóvil (If) y tiempo de recuperación (t½)5,7. Por el contrario, otros colocan mucho énfasis en complejas fórmulas matemáticas para calcular Mf,fy t1/25,6,8,9. Por lo tanto, nuestro propósito es proporcionar un protocolo integral, práctico y sencillo paso a paso para FRAP experimentos con células vivas.

Protocolo

1. 264.7 macrófago transfección

  1. Cultura 100.000 264.7 células (Tabla de materiales) en medio de cultivo completo (de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM)) que contiene glucosa 4,5 g/L (Tabla de materiales), suplementada con 10% suero bovino fetal (Tabla de materiales ) y penicilina/estreptomicina (Tabla de materiales) a no se trata de platos de fondo de cristal de 35 mm (Tabla de materiales) y colocar los platos en una incubadora de2 °C/5% CO 37. Al día siguiente, transfectar las células con 1 mg/mL polietilenimina (PEI) (Tabla de materiales).
  2. Mezcla 1,5 μg de YFP-p62 con 8 μL de PEI en 166 μL de DMEM libre de suero (base medio sin suero fetal bovino y penicilina/estreptomicina).
  3. Deje que la mezcla compleja de transfección reposar a temperatura ambiente 15 minutos antes de agregar la mezcla en cada placa.
  4. Añadir suavemente los complejos al medio existente con las células y la placa.
  5. Coloque la placa a 37 ° C 5% CO2 incubadora durante la noche.
  6. A la mañana siguiente, aspirar el medio de la placa, luego enjuague una vez con medio completo. Añadir 2 mL de medio completo a la placa y permite a las células para recuperarse hasta el día siguiente.

2. inducción de ALIS con lipopolisacárido (LPS)

  1. Al día siguiente, aspirar el medio de las placas, luego agregue 1 mL de total media con 10 ng/mL LPS (Tabla de materiales). Permita que las placas se incuban durante 5 h en un incubador de2 °C/5% CO 37.
  2. Después del tratamiento de LPS, aspirar el medio y, a continuación, añadir 1 mL de tampón de Tyrode frío y estéril que contiene 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM de glucosa, 1,5 mM CaCl2, 1,0 mM de MgCl2y 10 mM HEPES (pH 7,4) a lavar la placa.
  3. Aspirar el buffer, luego agregue 1 mL del tampón frío y estéril de Tyrode suplementado con 10 μg/mL nocodazole (Tabla de materiales). Permita que las placas a incubar a 4 ° C durante 15-20 min antes de la proyección de imagen de FRAP y análisis.
    Nota: El uso de tampón de Tyrode que contienen HEPES como el almacenamiento en búfer compuesto permite la proyección de imagen para llevar a cabo a temperatura ambiente. Nocodazole se usa para disminuir el movimiento de ALIS por microtúbulos. Medio de cultivo contiene bicarbonato como tampón compuesto que requiere CO2 buffer. De lo contrario, el bicarbonato contiene pH cambios medio en ausencia de CO2.

3. configuración del Microscopio Confocal y seleccionar la región de interés

  1. Selección y configuración de ruta de la viga del laser
    1. Utilizar cualquier microscopio confocal adecuado (Tabla de materiales) equipado con software objetivo o ZEN (Tabla de materiales) o cualquier software de tratamiento de imágenes adecuado.
    2. Seleccione la línea 514 de nm del láser argón/2, como YFP tiene excitación máxima a 512 nm y pico de emisión a 527 nm. Haga clic en el botón adquirir , luego haz clic en el botón láser . En la ventana de Control de láser, haga clic en argón/2 458, 477, 488 y 514 nm, haga clic en el botón de Standby . Después de esperar 3 min para el láser calentar, haz clic en el botón (figura 2A) .
    3. Establece la potencia del láser de la línea de láser de argón/2 nm 514 al 100% (8,6 A). Haga clic en el botón adquirir , luego haz clic en el botón láser . En la ventana de Control de láser, escriba 100 en el campo de salida [%] , luego pulse el botón Enter (figura 2A).
    4. Establecer la transmisión de la línea de láser de argón/2 nm 514 al 5%. Haga clic en el botón adquirir , luego el botón de canales . En la ventana de Scan Control , haga clic en el botón de canales y, a continuación, haga clic en el cuadro cuadrado blanco a la izquierda del texto 514 nm en la columna de línea activa para activar la línea de láser de 514 nm. Escriba 5 en el campo de la transmisión [%] de la línea 514 de nm láser (figura 2D).
    5. Fije el divisor de viga primaria dicroico (Haupt Farb Teiler (HFT)) a la posición de HFT 458/514/561 que estas bandas se desvió a la muestra para la excitación. Haga clic en el botón adquirir , luego el botón Config . En la ventana de Control de configuración , haga clic en el botón de Modo de canal , entonces el botón de Pista . Haga clic en el botón HFT , luego seleccione HFT 458/514/561 en el menú desplegable (figura 2B).
    6. Coloque el primer divisor de haz dicroicos secundaria (Neben Farb Teiler 1 (NFT1)) en la posición de espejo , que se desviará el 100% de la luz al segundo divisor de viga secundaria de dicroico (Neben Farb Teiler 2 (NFT2)). Haga clic en el botón adquirir , luego el botón Config . En la ventana de Control de configuración , haga clic en el botón de Modo de canal , entonces el botón de Pista . Haga clic en el botón NFT1 , a continuación, seleccione espejo en el menú desplegable (figura 2B).
    7. Coloque el segundo divisor de haz dicroicos secundaria (NFT2) en la posición de NFT 515 para asegurar que longitudes de onda < 515 nm se reflejará y longitudes de onda > 515 nm se transmitirá. Haga clic en el botón adquirir , luego el botón Config . En la ventana de Control de configuración , haga clic en el botón de Modo de canal , entonces el botón de Pista . Haga clic en el botón NFT2 , a continuación, seleccione NFT 515 desde el menú desplegable (figura 2B).
    8. Establece el filtro de emisión del pase largo (LP) (EF) en LP 530, por lo que las longitudes de onda > 530 nm se transmitirá al tubo fotomultiplicador (PMT, detector). Haga clic en el botón adquirir , luego el botón Config . En la ventana de Control de configuración , haga clic en el botón de Modo de canal , entonces el botón de Pista . Haga clic en el botón filtro de la emisión , luego seleccione LP 530 en el menú desplegable (figura 2B).
    9. Seleccionar el canal 3. Haga clic en el botón adquirir , luego el botón Config . En la ventana de Control de configuración , haga clic en el botón de Modo de canal , entonces el botón de Pista . Haga clic en el cuadro cuadrado blanco a la izquierda del botón del Ch3 .
  2. Configuración de adquisición de imagen
    1. Seleccione el Plan-Apochromat 63 x 1.40 aceite objetivo (Tabla de materiales). Ver a la muestra a través del ocular del microscopio y el ALIS en el centro del campo de visión. Haga clic en el botón adquirir , luego el botón de Micro . En la ventana de Control de microscopio , haga clic en el objetivo, a continuación, seleccione el Plan-Apochromat 63 x 1.40 aceite objetivo en el menú desplegable.
    2. Establezca el tamaño de marco en 512 x 512 píxeles, la velocidad de exploración a 8y la profundidad de datos de 12 bits. Haga clic en el botón adquirir , luego el botón Scan . En la ventana de Scan Control , haga clic en el botón y el botón de cuadro , luego clic en el botón de 512 . Intro 8 en el campo de Velocidad de exploración , pulsa Entery luego haga clic en el botón de 12 bits (figura 2C).
    3. Establezca la media scan 1 y el zoom óptico de 3. Haga clic en el botón adquirir , luego haga clic en el botón Scan . En la ventana de Scan Control , haga clic en el botón de flecha abajo del campo número promedio de exploración, luego seleccione 1 en el menú desplegable. Escriba 3 en el campo de zoom óptico y pulse Enter (figura 2C).
    4. Coloque el alfiler 1,95 unidades luminosas y detector de ganancia a 582 (justo debajo de la saturación). Haga clic en el botón adquirir , luego el botón Scan . En la ventana de Scan Control , haga clic en el botón de canales , escriba 196 en el campo del agujero de alfiler, luego oprima Enter. Entre 582 en el campo de la ganancia del Detector, y presione Enter (figura 2D).
    5. Asegúrese que la línea de láser de argón/2 nm 514 es 100% de potencia (8,6 A). Haga clic en el botón adquirir , luego el botón láser . En el menú de Control del Laser , el valor en el campo de salida [%] debe ser 100 (figura 2A).
    6. Asegúrese que la línea de láser de argón/2 nm 514 es 5% de transmisión. Haga clic en el botón adquirir , luego el botón Scan . En la ventana de Scan Control , el valor en el campo de la transmisión [%] de la línea de láser de 514 nm debe ser 5 (figura 2D).
    7. Crear un ROI forma cuadrada (adquisición de ROI) que tiene las dimensiones 150 x 150 píxeles (194.6 μm2). Pulse el botón de adquisición , entonces el botón de Editar ROI . En el ROI editar menú, haga clic en el icono de rectángulo, luego haga clic y arrastre en la ventana de imagen para crear un cuadrado que tiene las dimensiones 150 x 150 píxeles (194.6 μm2) (figura 1A).
      Nota: La adquisición ROI incluye a un ALIS de interés, (b) un área de fluorescencia que no es un ALIS (control de retorno de la inversión) y al menos 20 x 20 pixeles (3.3 μm2) y (c) un área de poca o ninguna fluorescencia (ROI de fondo) de al menos 20 x 20 píxeles (3.3 μm 2) (figura 1A). Es importante incluir un control de retorno de la inversión en la adquisición de ROI que puede controlarse el fotoblanqueo que puede ocurrir con la proyección de imagen repetida. La adquisición de ROI que se define aquí será la única área que se analizará. Láser repetida exploración dentro de una adquisición ROI sólo restringirá el fotoblanqueo para el retorno de la inversión en lugar de, por ejemplo, photobleaching toda la célula o varias células y recoge el número de píxeles en el PMT (detector) será mayor que el número de píxeles recogieron en el PMT (detector) después de la exploración de un entero o varias celdas.
    8. Puesta en marcha la serie de tiempo tal que la adquisición ROI se analiza 35 veces, una vez cada 30 s. Haga clic en el botón adquirir , luego el botón de la Serie de tiempo . En la ventana de Control de serie de tiempo , haga clic en el botón Manual start de serie y el botón de parada de Manual de serie . Escriba 35 en el campo de serie de parada manual, presione la tecla Enter , luego clic en 30,0 sec ciclo demora (figura 2E).
    9. Ajuste el control de cloro tal que el fotoblanqueo se producirá después de la exploración número 5, para recoger 5 imágenes prebleach de la adquisición de ROI. Pulse el botón de adquisición , entonces el botón Edit Bleach . En la ventana de Control de cloro , haga clic en el cuadrado blanco junto a la lejía después de exploraciones del número. Escriba 5 en el campo número de análisis, luego presione la tecla Enter (figura 2F).
      Nota: Imágenes prebleach y postbleach se deben adquirir en la misma profundidad óptica.
    10. Crear un blanqueador de forma circular ROI en el ALIS que tiene un diámetro de 10 píxeles (área = 0,8 μm2). Haga clic en adquirir | Edición de Bleach | Definir regiones. En la ventana de Bleach regiones , haga clic en el icono de círculo . Haga clic y arrastre en la ventana de imagen para crear un círculo que tiene un diámetro de 10 píxeles (área = 0,8 μm2) (figura 2F).
    11. Establecer iteraciones a 300. Pulse el botón de adquisición , entonces el botón Edit Bleach . En la ventana de Control del blanqueo , escriba 300 en el campo de repeticiones, luego presione la tecla Enter (figura 2F).
    12. Establecer la línea de 514 nm láser de argón/2 a 100% de potencia (8,6 A) y 100% de transmisión durante el blanqueo. Pulse el botón de adquisición , entonces el botón Edit Bleach . En la ventana de Control de cloro , haga clic en el cuadro cuadrado blanco a la izquierda de 514 nm. Introduzca 100 en el campo de la transmisión [%] de la línea de láser de 514 nm, luego presione el botón Enter (figura 2F).
      Nota: El número de iteraciones debe ser determinado empíricamente. Variará según el fluoróforo y el tamaño de la estructura que se blanqueó el láser.
  3. Recolección de datos
    1. Iniciar el experimento FRAP. Recoger las primeras 5 imágenes prebleach y la primera imagen postbleach y luego calcular lejía profundidad según la siguiente ecuación.
      figure-protocol-1
      Si la profundidad de la lejía es < 90, detener el experimento y descartar los datos, como la profundidad de bleach no era suficiente. Cuando la profundidad de la lejía es ≥90, recopilar datos para análisis con un programa y un programa de hoja de cálculo (Tabla de materiales) de procesamiento de imágenes.
      Nota: Cuando se deriva de los ALIS es ≥ 3 μm, detener el experimento y deseche los datos, ya que esta cantidad de deriva de la imagen no se puede corregir para análisis con software de procesamiento de imagen (Tabla de materiales). Cuando deriva de las ALIS es < 3 μm, recoger los datos para análisis de datos con un programa y un programa de hoja de cálculo (Tabla de materiales) de procesamiento de imágenes.
    2. Recopilar datos FRAP de 10 ALIS de 10 celdas con menos de 3 μm de deriva de los ALIS. A continuación, transferir los archivos de .lsm objetivo a un ordenador para análisis de datos.
  4. Análisis de los datos en un programa de procesamiento de imágenes
    1. Correcta de la imagen deriva de alinear o coincidencia (es decir, registrar) la pila de imágenes de series de tiempo de la adquisición de ROI. Para ello, abrir cada archivo de .lsm objetivo con un programa de procesamiento de imagen (Tabla de materiales) y, a continuación, seleccione Plugins | Registro | StackReg | Traducción de. A continuación, seleccione Plugins | Registro | StackReg | Cuerpo rígido10.
    2. Configuración ROI Manager para medir la intensidad de la señal en el blanqueador, el retorno de la inversión. Seleccione analiza | Herramientas | ROI Manager. Seleccione la herramienta óvalo , dibuja un círculo en el blanqueador ROI con un diámetro de 10 píxeles, luego haga clic en el botón Agregar .
    3. Configuración ROI Manager para medir la intensidad de la señal en el control de retorno de la inversión. En el ROI Manager, seleccione la herramienta rectángulo , dibuje un cuadrado de 20 x 20 píxeles en la región de retorno de la inversión de control, luego haz clic en el botón Agregar .
    4. Configuración ROI Manager para medir la intensidad de la señal en el fondo, el retorno de la inversión. En el ROI Manager, seleccione la herramienta rectángulo , dibuje un cuadrado de 20 x 20 píxeles en la región de retorno de la inversión del fondo, luego haga clic en el botón Agregar .
    5. Cambie el nombre los ROIs. Después de agregar el ROI que se analizará en el ROI Manager, renombrarlas Bleach ROI ROI Controly ROI de fondo en consecuencia.
    6. Intensidad de la señal medida en el ROI. Seleccione Bleach ROI ROI Controly ROI de fondoy luego más | Medida de múltiples. Asegurarse de que seleccionan a medir todos los 35 sectores y una fila por rebanada . En la ventana Establecer mediciones , asegúrese de que sólo significa valor gris seleccionado.
      Nota: Estos son los datos brutos de FRAP (figura 1B).
    7. Pegar los resultados en un programa de hoja de cálculo (Tabla de materiales). Copia el blanqueador ROI, retorno de la inversión de control, y de intensidad de la señal de retorno de la inversión de fondo resulta pegar columnas etiquetado Bleach ROI, ROI de Controly el ROI de fondo, respectivamente, en un programa de hoja de cálculo (Tabla de materiales).
  5. Análisis de los datos en un programa de hoja de cálculo
    1. Corregir a fondo la intensidad de la señal en el blanqueador, el retorno de la inversión y el control ROI (figura 1A, C). Utilizar la herramienta Insertar función en un programa de hoja de cálculo (Tabla de materiales) para restar los valores de la columna etiquetada ROI de fondo de los valores en la columna etiquetada ROI Bleach. Restar los valores de la columna etiquetada ROI de fondo de los valores en la columna etiquetada Control de retorno de la inversión. Estas nuevas columnas ROI de Bleach corregido y Corregido Control ROIde la etiqueta.
    2. Normalizar la señal en el blanqueador ROI a la señal de corrección de fondo en el control de retorno de la inversión (figura 1A, D). Utilice la función de Insertar en un programa de hoja de cálculo (Tabla de materiales) para dividir los valores en la columna de etiquetado ROI de Bleach corregido por los valores en la columna etiquetada Corregido Control ROI. Esta nueva columna Normalizado ROI de Bleach corregirde la etiqueta.
    3. Normalizar la señal en la columna de Normalizado ROI de Bleach corregida al promedio de los 5 valores prebleach en el blanqueador ROI (figura 1A, E). Calcule el promedio de los 5 valores prebleach de lejía y ROI. A continuación, dividir los valores en la columna etiquetada Normalizada ROI de Bleach corregido por el promedio de los 5 valores prebleach de lejía y ROI. Esta nueva columna Normalizado corrige Prebleach promedio Bleach ROIde la etiqueta.
  6. Fracción móvil y tiempo medio de recuperación de datos de curva-cabido
    1. Curva de ajuste de los datos ROI de bleach normalizado y corregida mediante un programa de procesamiento de imagen (Tabla de materiales). En el programa de procesamiento de imagen (Tabla de materiales), seleccione analizar | Herramientas | Ajuste de la curva. Copia el postbleach normalizado y corregido bleach ROI valores y los valores de tiempo correspondientes, luego pegarlos en la ventana del Instalador de curva . Seleccione Recuperación exponencial del Curva instalador menú desplegable, luego seleccione ajuste.
    2. Calcular la Mf desde los parámetros de la función de recuperación, que proporciona valores para: 'un,' una fracción de lenta recuperación; 'b', la tasa de recuperación; y 'c', una fracción rápidamente difundiendo. Calcular Mf enchufando en los valores de 'a' y 'c' en la ecuación Mf = a + c. calcular laf usando la ecuaciónf = Mf- 1. Sustituyendo el valor de 'b' en la ecuación para calcular t½ figure-protocol-2 entonces resolviendo para t1/2. 11

Resultados

Se muestran aquí los resultados de un experimento típico en el cual utilizamos FRAP para examinar el grado de movilidad de p62 en ALIS en 264.7 células tratadas con LPS para 3-5 h12. Figura 3 A se muestran los datos crudos obtenidos de un blanqueador, control y retorno de la inversión del fondo después de que la pila de imágenes había sido alineada para corregir pequeñas cantidades (< ~ 3 μm) de deriva de la imagen de los ALIS. Fluorescencia de YFP-p62 en este ALIS en prebleach y postbleach se muestra en la figura 3E y 1 de Video suplementaria. Figura 3 B muestra estos datos después de la corrección de fondo. Figura 3 C muestra estos datos después de corregir por fluorescencia en el control de retorno de la inversión. Figura 3 D muestra estos datos normalizados a la fluorescencia promedio de los 5 valores prebleach de lejía y ROI. El grado de blanqueamiento era suficiente en este experimento (bleach profundidad = 91.94). Fluorescencia de YFP-p62 dentro esta ALIS se recuperó lentamente, como t1/2 = 128.27 s (min 2,14). YFP-p62 no era una proteína muy móvil en este experimento, como Mf = 21.97 y If = 78.03.

figure-results-1
Figura 1 : Un diagrama de una célula 264.7 y pasos para el análisis de la imagen después de que las imágenes FRAP han sido alineadas para corregir para la deriva de la imagen de los ALIS. (A) esquema de una célula de 264.7 representando varios ALIS y la lejía, control y ROIs de fondo en la adquisición de ROI. (B) una descripción idealizada del FRAP crudo datos obtienen en el blanqueador, el control y el fondo ROIs en panel A. (C) una gráfica idealizada de FRAP datos que han sido corregidos por el fondo. (D) un gráfico idealizado de corrección de fondo FRAP datos que han sido normalizados a fluorescencia en el control de retorno de la inversión. (E) un idealizado gráfico de datos FRAP normalizados y corrección de fondo que han sido normalizados a la fluorescencia prebleach en lejía y ROI. Abreviaturas: Con = control; BG = fondo. Esta figura fue modificada de Rabut y Ellenberg4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Imágenes de la interfaz de usuario en el software objetivo (tabla de materiales) para la selección del láser, haz ruta configuración y parámetros de adquisición de imagen para los experimentos FRAP. Láser (A) control de pantalla que muestra las líneas de láser argón/2, con salida y corriente del tubo utilizado. (B) configuración control de pantalla que muestra la viga splitter y emisión filtro de configuración utilizada. (C) la exploración control de pantalla que muestra la configuración utilizada para la adquisición de la imagen. (D) exploración control de pantalla que muestra el agujero de alfiler, detector ganancia, offset del amplificador, ganancia del amplificador y configuración de la transmisión de la línea de láser argón/2 514 nm. (E) control de series de tiempo pantalla que muestra la configuración de serie de tiempo utilizada. Bleach (F) control de pantalla que muestra la prebleach y postbleach parámetros utilizados. Abreviaturas: HFT = Haupt Farb Teiler (divisor de haz dicroicos primaria); NT1 = Neben Farb Teiler 1 (primera secundaria dicroico beam splitter); NT2 = Neben Farb Teiler 2 (divisor de haz dicroicos segundo secundaria); EF = filtro de emisión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3 : Un experimento representativo de FRAP para estudiar dinámica YFP-p62 en ALIS en 264.7 células. (A) crudo fluorescencia intensidad los datos para un blanqueador, control y retorno de la inversión del fondo. (B) los datos indicados en el panel A, después de que el blanqueador y el control de retorno de la inversión habían sido corregidos por fluorescencia en el fondo, el retorno de la inversión. (C) los datos que figuran en los paneles A y B después de la normalización de la intensidad de fluorescencia en el blanqueador ROI para tener en cuenta la fluorescencia en el control de corrección de fondo ROI. (D) los datos en paneles A-C después de la normalización de la intensidad de fluorescencia en el blanqueador normalizado y corregir de fondo ROI a la media de los 5 primeros valores prebleach en el blanqueador, el retorno de la inversión. Mf = 21.97, If = 78.03, t1/2 = 128.27 s (min 2,14) y blanqueo profundidad = 91.94. (E) una imagen de un ALIS prebleach (1,5 minutos) y postbleach (0, 6 y 16 min). Barra de escala = 5 μm y es válida para todos los paneles. Abreviaturas: Con = control; BG = fondo; Corr. = corregido; Norma. = normalizado; Prom. = promedio. Esta figura fue modificada de Cabe et al12haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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1 Video complementario: un típico ALIS en macrófago 264.7 antes y después de photobleaching. Fluorescencia de YFP-p62 es lenta para recuperarse después de la photobleach; por lo tanto, p62 no es una proteína muy móvil. Para este experimento, Mf = 25.62, If = 74.38, t1/2 = 442.79 s (7,38 min) y profundidad de bleach = 90.19. Barra de escala = 5 μm. Este video fue modificado de Cabe et al12por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)

Discusión

Proporcionamos un protocolo integral, práctico y sencillo paso a paso para FRAP experimentos con células vivas. Aquí, el protocolo se utilizó para medir la movilidad de YFP-p62 en ALIS en 264.7 macrófagos, pero se puede aplicar a muchos sistemas del microscopio confocal de escaneo láser y genéticamente codificado proteínas fluorescentes que están ahora disponibles. Para cualquier sistema de microscopía, experiencias piloto son fundamentales para determinar los parámetros óptimos de FRAP, incluyendo adquisición, lejía y tamaños de retorno de la inversión de control, intensidad de láser de fotoblanqueo y adquisición de imágenes prebleach y postbleach. Es razonable esperar que los parámetros óptimos del FRAP que difieren para cada línea de proteínas y células fluorescente genéticamente codificado.

Factores importantes a considerar cuando llevar a cabo un experimento FRAP incluyen (a) lograr adecuado bleach profundidad, (b) el uso de un breve paso blanqueo, postbleach de tiempo suficiente (c) que permite observar la recuperación completa, photobleaching (d) eficiencia, (e). citotoxicidad con FRAP y (f) la inclusión de un control para la pérdida de fluorescencia debido a la proyección de imagen repetida repetida. Se recomienda que la profundidad de bleach, que se puede calcular según la ecuación proporcionada en la sección 3.3.1, sea ≥ 9013. Cuando la profundidad de la lejía es < 90, a subestimar el grado de recuperación de fluorescencia postbleach y los valores de IfMfy t1/2 serán incorrectos. Aunque la duración e intensidad de los pulsos del láser de inducir la lejía pueden variar entre los experimentos FRAP, es importante que el paso de fotoblanqueo ser breve y sustancialmente más rápido que la función de recuperación de fluorescencia. Si no es así, podría ocurrir una cantidad importante de recuperación de fluorescencia durante la etapa de blanqueaba. Con un tiempo de mucho cloro, recuperación de fluorescencia durante la etapa de blanqueaba no se mediría, y daría lugar a mediciones erróneas de If, Mf, yt1/2. Además, para obtener valores correctos para If, Mf, yt1/2, la adquisición ROI debe observarse postbleach hasta que el nivel de fluorescencia en el blanqueador ROI ha alcanzado una meseta. Por ejemplo, en nuestros experimentos FRAP, no hubo diferencias entre laf, Mfy t1/2 valores cuando observamos YFP-p62 fluorescencia en el blanqueador ROI min 32,2 postbleach versus cuando observamos YFP-p62 en lejía y retorno de la inversión para postbleach min 15,1; así, concluimos que la función de recuperación alcanzado una meseta en el min 15,1 postbleach12. Con respecto a la eficacia de fotoblanqueo, photobleaching aumenta con el cuadrado del factor de zoom óptico de14. Así, el uso de lentes de zoom ópticos alta es favorable para el fotoblanqueo rápido pero puede resultar en fotoblanqueo indeseable durante la adquisición; Este último puede explicarse por un control de retorno de la inversión de imagen. Fotoblanqueo repetida debe evitarse ya que puede conducir a la generación de especies reactivas del oxígeno citotóxico (ROS). Sin embargo, el grado de generación de ROS debido a la exposición a un láser de alta intensidad es menor para las proteínas fluorescentes genéticamente codificadas que fluoróforos química (p. ej., anticuerpos fluorescentes)15, y los ROS generados son más propensos a reaccionar dentro de la proteína fluorescente genéticamente codificada que con otras moléculas en la célula4. Además de la mayor probabilidad de generar ROS citotóxicos, photobleaching repetido debe ser evitada ya que es difícil de controlar. Finalmente, aunque la transmisión de láser de baja se utiliza para adquirir imágenes de bleach no todos, algunos fotoblanqueo invariablemente ocurrirá, que deben ser controlados. Controles posibles para esto incluyen monitoreo de la fluorescencia en un control de retorno de la inversión en la adquisición de ROI, obtención de imágenes de control en una celda sin blanquear vecina y realizar experimentos de control con los valores idénticos para los que se utilizan en la photobleaching experimentos pero sin el evento de fotoblanqueo.

Divulgaciones

Los autores no tienen ningún conflicto de interés que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Seth Robia en Loyola University Chicago por sus valiosos comentarios sobre este manuscrito. Este trabajo fue financiado por los NIH grant 1R01NS073967-01A1 a Joanna C. Bakowska.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dulbecco's Modified Eagle MediumHycloneSH30022.01Alta glucosa (4.5 g/L)
Suero fetal bovinoGemini Bio-Products100-106
Platos con fondo de vidrioMatTekP35G-1.5-14-C35 mm
Software ImageJInstitutos Nacionales de SaludN.A.
Lipopolisacárido (LPS)SigmaL4391 Nocodazol
SigmaM1404
Solución de penicilina-estreptomicinaCorning30-002-Cl100 veces;
Plan-Apochromat 63×/1.40 Objetivo de aceiteCarl Zeiss MicroImaging, Inc4407629904000000
Polietilenimina (PEI)Polysciences23966-1lineal (MW 25.000)
RAW 264.7 macrófagos murinosATCCTIB-71
Microscopio confocal ZeissCarl Zeiss MicroImaging, IncLSM 510

Referencias

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