Artículo de método

Evaluación rápida de la toxicidad de compuestos químicos mediante embriones de pez cebra

DOI:

10.3791/59315

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25 de agosto de 2019

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1Faculty of Medicine and Health Technology, Tampere University, 2Oral and Maxillofacial Unit, Tampere University Hospital, 3Fimlab Ltd, Tampere University Hospital

En este artículo

Resumen

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Los embriones de pez cebra se utilizan para evaluar la toxicidad de los compuestos químicos. Se desarrollan externamente y son sensibles a los productos químicos, lo que permite la detección de cambios fenotípicos sutiles. El experimento sólo requiere una pequeña cantidad de compuesto, que se añade directamente a la placa que contiene embriones, haciendo que el sistema de prueba sea eficiente y rentable.

Resumen

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El pez cebra es un organismo modelo de vertebrados ampliamente utilizado para la enfermedad y el descubrimiento de fármacos basados en fenotipos. El pez cebra genera muchos vástagos, tiene embriones transparentes y un rápido desarrollo externo. Por lo tanto, los embriones de pez cebra también pueden utilizarse para la evaluación rápida de la toxicidad de los medicamentos que son preciosos y están disponibles en pequeñas cantidades. En el presente artículo, se describe un método para el cribado eficiente de la toxicidad de los compuestos químicos utilizando embriones postfecatización de 1-5 días. Los embriones son monitoreados por estereomicroscopio para investigar los defectos fenotípicos causados por la exposición a diferentes concentraciones de compuestos. También se determinan las concentraciones letales medias máximas (LC50) de los compuestos. El presente estudio requirió 3-6 mg de un compuesto inhibidor, y todo el experimento toma alrededor de 8-10 h para ser completado por un individuo en un laboratorio que tiene instalaciones básicas. El protocolo actual es adecuado para probar cualquier compuesto para identificar efectos tóxicos o fuera del objetivo intolerables del compuesto en la fase temprana del descubrimiento de fármacos y para detectar efectos tóxicos sutiles que pueden perderse en el cultivo celular u otros modelos animales. El método reduce los retrasos procesales y los costos del desarrollo de medicamentos.

Introducción

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El desarrollo de medicamentos es un proceso costoso. Antes de que un solo compuesto químico sea aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) varios miles de compuestos se examinan a un costo de más de mil millones de dólares1. Durante el desarrollo preclínico, la mayor parte de este costo es necesaria para las pruebas con animales2. Para limitar los costos, los investigadores en el campo del desarrollo de fármacos necesitan modelos alternativos para el control de seguridad de los compuestos químicos3. Por lo tanto, en la fase temprana ....

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Protocolo

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La instalación central de pez cebra de la Universidad de Tampere cuenta con una autorización de establecimiento otorgada por la Junta Nacional de Experimentos Animales (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Todos los experimentos con embriones de pez cebra se llevaron a cabo de acuerdo con el Gobierno Provincial de Finlandia Oriental, Departamento De Servicios Sociales y de Salud del Protocolo de la Unidad de Servicios Regionales de Tampere, LSLH-2007-7254/Ym-23.

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Resultados

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La parte crítica de la evaluación de la toxicidad es probar diferentes concentraciones de uno o varios compuestos químicos en un solo experimento. Al principio, seleccione los compuestos para la evaluación de la toxicidad, el número de concentraciones a probar para cada compuesto y, en consecuencia, haga un gráfico (Figura3). Usamos un color único para cada compuesto para organizar las muestras (Figura3). El uso de marcadores res.......

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Discusión

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El ensayo de toxicidad in vitro utilizando células cultivadas puede detectar la supervivencia y los estudios morfológicos de las células proporcionando información limitada sobre la toxicidad inducida por el compuesto de ensayo. La ventaja del cribado de toxicidad de compuestos químicos mediante embriones de pez cebra es la detección rápida de cambios fenotípicos inducidos químicamente en todo un animal durante el desarrollo embrionario en un organismo modelo relevante. Aproximadamente el 70% de los genes humano.......

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Divulgaciones

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Los autores no informaron de ningún posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

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El trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Sigrid Juselius (SP, MP), la Fundación Cultural Finlandesa (AA, MH), la Academia de Finlandia (SP, MP), la Fundación Orion Farmos (MH), la Fundación Tampere Tuberculosis (SP, MH y MP) y la Fundación Jane y Aatos Erkko (SP y MP) ). Agradecemos a nuestros colaboradores italianos y franceses, el profesor Supuran y el profesor Winum, por proporcionar inhibidores de la anhidrasa carbónica para la evaluación de la seguridad y la toxicidad con fines de desarrollo de fármacos contra la tuberculosis y contra el cáncer. Agradecemos a Aulikki Lehmus y Marianne Kuuslahti por la asistencia técnica. También agradecemos a Leena....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de 24 pocillosNuncThermo Scientific
Balance (Báscula)Balanza KERNPLJ3000-2CM
(Báscula)Mettler ToledoAB104-S/PH
CaCl2JT. Sonda
Thermo Scientific17-467-604 
DMSOSigma Aldrich, AlemaniaD4540
Tubos Falcon 15 mLGreiner bio-one188271
Metilcelulosa de alto peso molecularSigma Aldrich, AlemaniaM0262 
Incubadora para larvas de pez cebraTermaksB8000
KCLMerck1.04936.0500
Azul de metiloSigma Aldrich, Alemania28983-56-4
MgSO4Sigma Aldrich, AlemaniaM7506
Tubos de microcentrífugaStarlabS1615-5500
NaClVWR Productos químicos27810.295
Parafina Histoplast IMThermo Scientific8331
Pipeta Pasteur Sarstedt86.1171
Placa de PetriThermo Scientific101R20 
Placas de PetriSarstedt82.1473
Pipeta (1 mL y 200 μ L)Thermo Scientific4641230N, 4641210N   
Placas 24 pocillosThermo Scientific142485
Steriomicroscopio/CámaraZeissStemi 2000-C/Axiocam 105 colores
Viales (1,5 mL)Fisherbrand11569914
Zebrafish AB cepasZIRC   ZL1 
de disección Baker RS421910024

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Amaouche, N., Casaert Salome, H., Collignon, O., Santos, M. R., Ziogas, C. Marketing authorization applications submitted to the European Medicines Agency by small and medium-sized enterprises: an analysis of major objections and their impact on outcomes. Drug Discovery Today. 23 (10), 1801-1805 (2018).
  2. Garg, R. C., Bracken, W. M., Hoberman, A.....

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