Evaluación rápida de la toxicidad de compuestos químicos mediante embriones de pez cebra

El desarrollo de medicamentos es un proceso costoso. Antes de que un solo compuesto químico sea aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) y la Agencia Europea de Medicamentos (EMA) varios miles de compuestos se examinan a un costo de más de mil millones de dólares¹. Durante el desarrollo preclínico, la mayor parte de este costo es necesaria para las pruebas con animales². Para limitar los costos, los investigadores en el campo del desarrollo de fármacos necesitan modelos alternativos para el control de seguridad de los compuestos químicos³. Por lo tanto, en la fase temprana del desarrollo del fármaco, sería muy beneficioso utilizar un método que puede evaluar rápidamente la seguridad y toxicidad de los compuestos en un modelo adecuado. Existen varios protocolos que se han utilizado para el cribado de toxicidad de compuestos químicos que involucran modelos decultivo animal y celular, pero no hay un solo protocolo que se valide y sea de uso común 4,⁵. Los protocolos existentes que utilizan peces cebra varían en longitud y han sido utilizados por investigadores individuales que evaluaron la toxicidad según su requisito de conveniencia^{6,7,8,9, 10 , 11 , 12}.

En el pasado reciente, el pez cebra ha surgido como un modelo conveniente para la evaluación de la toxicidad de los compuestos químicos durante el desarrollo embrionario^6,7. El pez cebra tiene muchas ventajas incorporadas para la evaluación de compuestos químicos^13. Incluso los experimentos a gran escala son susceptibles, ya que una hembra de pez cebra puede poner lotes de 200-300 huevos, que se desarrollan rápidamente exvivo, no necesitan alimentación externa hasta por una semana y son transparentes. Los compuestos se pueden añadir directamente en el agua, donde pueden (dependiendo de la naturaleza del compuesto) difundir a través del coro, y después de la eclosión, a través de la piel, branquias y boca de larvas. Los experimentos no requieren cantidades copiosas de compuestos químicos¹⁴ debido al pequeño tamaño del embrión. El desarrollo de embriones de pez cebra expresan la mayoría de las proteínas necesarias para lograr el resultado normal del desarrollo. Por lo tanto, un embrión de pez cebra es un modelo sensible para evaluar si un fármaco potencial puede perturbar la función de una proteína o molécula de señalización que es significativa desde el desarrollo. Los órganos del pez cebra se vuelven funcionales entre 2-5 dpf^15,y los compuestos que son tóxicos durante este período sensible de desarrollo embrionario inducen defectos fenotípicos en larvas de peces cebra. Estos cambios fenotípicos se pueden detectar fácilmente utilizando un microscopio simple sin técnicas invasivas^11. Los embriones zebrafish son ampliamente utilizados en la investigación toxicológica debido a su complejidad biológica mucho mayor en comparación con el cribado in vitro de fármacos utilizando modelos de cultivo celular^16,17.  Como vertebrado, la composición genética y fisiológica del pez cebra es comparable a lade los seres humanos y, por lo tanto, las toxicidades de los compuestos químicos son similares entre los peces cebra y los humanos 8,^{18,19, 20 , 21 , 22}. Zebrafish es, por lo tanto, una herramienta valiosa en la fase temprana del descubrimiento de fármacos para la evaluación de la toxicidad y la seguridad de los compuestos químicos.

En el presente artículo, proporcionamos una descripción detallada del método utilizado para evaluar la seguridad y toxicidad de los compuestos inhibidores de la anhidrasa carbónica (CA) utilizando embriones de pez cebra post fecundación (dpf) de 1-5 días por un solo investigador. El protocolo consiste en exponer embriones de pez cebra a diferentes concentraciones de compuestos inhibidores químicos y estudiar la mortalidad y los cambios fenotípicos durante el desarrollo embrionario. Al final de la exposición a los compuestos químicos, se determina la dosis DE LC₅₀ del producto químico. El método permite a un individuo llevar a cabo un cribado eficiente de 1-5 compuestos de prueba y toma alrededor de 8-10 h dependiendo de la experiencia de la persona con el método (Figura1). Cada uno de los pasos necesarios para evaluar la toxicidad de los compuestos se describe en la Figura2. La evaluación de la toxicidad de los inhibidores de CA requiere 8 días, e incluye la creación de pares de apareamiento (día 1); recogida de embriones de tanques de cría, limpiándolos y transfiriéndolos a la incubadora de 28,5oC (día 2); distribución de los embriones en los pocillos de una placa de 24 pocillos y adición de compuestos inhibidores de CA diluidos (día 3); análisis fenotípico e imágenes de larvas (día 4-8) y determinación de la dosis de LC₅₀ (día8).  Este método es rápido y eficiente, requiere una pequeña cantidad del compuesto químico y sólo las instalaciones básicas del laboratorio.

La instalación central de pez cebra de la Universidad de Tampere cuenta con una autorización de establecimiento otorgada por la Junta Nacional de Experimentos Animales (ESAVI/7975/04.10.05/2016). Todos los experimentos con embriones de pez cebra se llevaron a cabo de acuerdo con el Gobierno Provincial de Finlandia Oriental, Departamento De Servicios Sociales y de Salud del Protocolo de la Unidad de Servicios Regionales de Tampere, LSLH-2007-7254/Ym-23.

1. Configuración de tanques de apareamiento de pez cebra durante la noche

1. Coloque 2-5 peces cebra macho adultos y 3-5 peces cebra hembra adultos en tanques de apareamiento durante la noche. (La cría es inducida por la mañana por el ciclo automático de oscuridad y luz durante la noche).
2. Establecer varios cruces para obtener suficientes embriones para evaluar la toxicidad de más de dos compuestos químicos. Para la evaluación de la toxicidad, cada concentración necesita un mínimo de 20 embriones^23.
3. Para evitar manejar el estrés a los animales, deje que los animales descansen durante 2 semanas antes de usar los mismos individuos para la cría.

2. Colección de embriones y placas de preparación para la exposición a los compuestos químicos

1. Recoger los embriones, al día siguiente antes del mediodía, utilizando un colador de malla fina y transferirlos a una placa de Petri que contenga un medio embrionario E3 [5,0 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄y 0,1% p/v de azul de metileno].
2. Retire los residuos con una pipeta Pasteur de plástico (por ejemplo, alimentos y residuos sólidos). Examine cada lote de embriones bajo el estereomicroscopio para eliminar los embriones no fecundados/muertos (identificados por su aspecto opaco).
3. Mantener los embriones a 28,5 oC en una incubadora. Examine los embriones, a la mañana siguiente, bajo un estereomicroscopio y retire cualquier embrión insalubre o muerto. Además, sustituya el antiguo medio E3 por un medio E3 fresco.
   NOTA: Los embriones de pez cebra siempre se mantienen a 28,5 oC en condiciones de laboratorio.
4. Transfiera cuidadosamente 1 embrión a cada pocil de una placa de 24 pocillos que contenga suficiente medio E3 para cubrir los embriones.

3. Preparaciones de la solución de stock de compuestos químicos y distribución de compuestos diluidos en los pozos

1. Sacar los viales que contienen compuestos inhibidores almacenados a 4 oC.
   NOTA: Dependiendo de las propiedades del compuesto, estos se almacenan a diferentes temperaturas.
2. Pesar el compuesto (s) utilizando una balanza analítica que puede pesar unos pocos miligramos (mg) del compuesto con precisión.
3. Preparar al menos 250 ml (100 ml) de solución en stock para cada compuesto en un disolvente adecuado (por ejemplo, agua E3 o sulfóxido de dimetil (DMSO), basado en las propiedades de solubilidad de los compuestos.
   NOTA: Los pasos anteriores se pueden hacer un día antes del inicio del experimento en un momento conveniente y se almacenan a 4 oC).
4. Realizar diluciones en serie de las soluciones de stock (p. ej., 10 m, 20 m, 50 m, 100 m, 150 m, 300 m y 500 m) utilizando agua E3 en tubos centrífugos de 15 ml.
   NOTA: Las concentraciones y el número de diluciones en serie varían de un compuesto a otro compuesto dependiendo de sus niveles de toxicidad.
5. De los 24 embriones que contienen 24 pocillos, retire el agua E3 de los pozos utilizando una pipeta Pasteur y una pipeta de 1 ml (que contenga 1 dpf embriones) una fila a la vez.
6. Distribuir 1 ml de cada diluyente en cada pocal (empezando por una concentración más baja y pasando a mayor concentración) en los pozos de la placa de 24 pocillos.
7. Configure un grupo de control a partir del mismo lote de embriones y agregue la cantidad correspondiente de diluyente.
8. Etiquetar las placas de 24 pocillos con el nombre y la concentración del compuesto y mantener las placas a 28,5 oC en una incubadora.

4. Análisis fenotípico e imágenes de los embriones utilizando un estereomicroscopio

1. Examine los embriones bajo un estereomicroscopio para los parámetros 24 h después de la exposición a los compuestos químicos.
   1. Tenga en cuenta los parámetros tales como mortalidad, eclosión, latidos del corazón, utilización del saco de yema, desarrollo de la vejiga de natación, movimiento de los peces, edema pericárdico, y la forma del cuerpo²³.
   2. Tome las larvas expuestas a cada concentración del compuesto y ponerlas lateralmente en una pequeña placa de Petri que contenga 3% de celulosa metilde alto peso molecular utilizando una sonda de metal.
      NOTA: La celulosa metimeta del 3% (alta molecular con) es un líquido viscoso necesario para incrustar al pez con la orientación necesaria para el examen microscópico. Para orientar a los peces en este líquido, se necesita una sonda de metal.
   3. Tome las imágenes usando estereomicroscopio conectado a una cámara. Guarde las imágenes en una carpeta independiente cada día hasta el final del experimento.
   4. Introduzca todas las observaciones de una tabla cada día en una tabla en línea o en una hoja impresa.
   5. Si los compuestos son neurotóxicos, las larvas de 4 a 5 dpf pueden mostrar un patrón de natación alterado, hacer un registro de tales cambios ya sea mediante la captura de un corto (30 s a 1 min) video de las larvas que exhiben un patrón de movimiento anormal.
   6. Después de 5 días de exposición a los compuestos químicos, observe la concentración en la que la mitad de los embriones mueren para calcular la concentración letal mediamáxima 50 (LC₅₀₎de cada producto químico.
      NOTA: La LC₅₀ es la concentración en la que el 50% de los embriones mueren al final de 5 días de exposición a un compuesto químico. Utilizar un mínimo de 20 embriones para probar la toxicidad de cada concentración de un compuesto²³.
   7. Construir una curva para la mortalidad de embriones para todas las concentraciones utilizando un programa adecuado.

La parte crítica de la evaluación de la toxicidad es probar diferentes concentraciones de uno o varios compuestos químicos en un solo experimento. Al principio, seleccione los compuestos para la evaluación de la toxicidad, el número de concentraciones a probar para cada compuesto y, en consecuencia, haga un gráfico (Figura3). Usamos un color único para cada compuesto para organizar las muestras (Figura3). El uso de marcadores resistentes a disolventes y el etiquetado en la parte inferior o laterales de las placas es importante para evitar la confusión más tarde.  Si los compuestos inducen algún defecto fenotípico en las larvas expuestas a diferentes concentraciones de inhibidores, los defectos se registran cada 24 h durante el período de 1-5 dpf (Figura4A,B,C,D). Los embriones tratados con un inhibidor conocido de CA IX a una concentración de 500 m no mostraron ningún cambio fenotípico aparente en los 1-5 días de exposición al compuesto químico (Figura4B). La Figura 4C y la Figura 4D muestran los embriones tratados con inhibidores de la CA que indujeron varios defectos fenotípicos embriones sin rayar incluso en el día 3 (cabeza de flecha), estructura corporal curva (flecha), saco de yema no utilizado y edema pericárdico (cabeza de flecha) y la ausencia de sacos de otolito en las larvas a los 5 días después del tratamiento con compuesto químico (flecha). En otro estudio, los embriones tratados con inhibidor de CA (Figura4E)muestran la ausencia de sacos de otolito y vejiga de natación (cabezas de flecha). En nuestro estudio, (Figura4C,D), documentamos defectos fenotípicos (embriones frágiles y ausencia de pigmentación) incluso después del día 1 de la exposición a inhibidores de CA. Los análisis fenotípicos mostraron que algunos de los compuestos inhibidores son letales y no pueden desarrollarse como fármacos para uso humano (Figura4C,D y Tabla 1).

Los experimentos identificaron un compuesto representativo que indujo cambios fenotípicos mínimos o nodurante el desarrollo embrionario y mostró una dosis alta de LC50 (Figura 5), lo que sugiere que el compuesto es seguro para una mayor caracterización y puede ser potencialmente desarrollado en un candidato a la droga para uso humano16. El mirar imágenes fijas de larvas expuestas al compuesto no mostró defectos fenotípicos (Figura4B). Sin embargo, se encontró que el mismo compuesto era neurotóxico e indujo ataxia en las larvas después de 5 días de exposición al inhibidor de CA (Figura6). Este fenotipo sólo podía detectarse observando directamente el comportamiento de natación de las larvas de peces cebra bajo el microscopio. Estos estudios sugirieron que el desarrollo neuronal de las larvas de pez cebra es sensible al compuesto16,17.

Figura 1: Tiempo en horas necesarias para el cribado rápido de compuestos químicos utilizando embriones de pez cebra: En un conjunto de experimentos, una persona con experiencia práctica puede examinar alrededor de 5 compuestos químicos (cada compuesto que requiere un mínimo de 6 diluciones) utilizando embriones de pez cebra en placas de 24 pocillos. En total, se tarda alrededor de 8-10 h desde la configuración de cruces hasta la realización de la determinación de LC50 durante un período de 8 días.

Figura 2: Gráfico que muestra el desglose de la evaluación de toxicidad de los compuestos químicos. El cribado de toxicidad de compuestos químicos requiere 8 días y se puede dividir en cinco pasos. (Día 1) Consiste en la instalación de pares de apareamiento de peces cebra en tanques. (Día 2) Implica la recolección de embriones de los tanques de apareamiento en platos de Petri seguido de mantenerlos en una incubadora de 28,5 oC para pasar la noche. (Día 3) Examen de embriones utilizando un estereomicroscopio y limpieza de los embriones. Distribución de los embriones en placas de 24 pocillos y adición de las diluciones de los compuestos de ensayo. (Día 4-8) Análisis fenotípicos de larvas en busca de defectos de desarrollo. El estudio del patrón de natación y la determinación de LC50 se realizaron en el último día de exposición a compuestos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Presentación esquemática de experimentos implicados en la evaluación de toxicidad. La evaluación de toxicidad consiste en la preparación de un gráfico tabulado que contiene información sobre compuestos químicos, diluciones de los compuestos y parámetros a evaluar. Realización de la dilución de soluciones de stock a las concentraciones deseadas en tubos centrífugos de 15 ml (la dilución de un tubo que se añadirá a cada hilera de la placa de 24 pocillos). Una placa de 24 pocillos marcada con un marcador a prueba de agua con el nombre del compuesto de ensayo, concentración en cada fila y fecha de exposición. Examen e imágenes de embriones mediante la transferencia de las larvas a una pequeña placa de Petri que contiene 3% de celulosa metil de alto peso molecular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Ejemplo de análisis fenotípico de las larvas en los grupos tratados con compuestos de control y ensayo. (A) Los análisis fenotípicos de las larvas del grupo de control no tratadas con ningún compuesto no mostraron ningún defecto fenotípico bajo un microscopio. (B) Las larvas tratadas con inhibidor de CA de 500 m (conocido inhibidor de la anhidrasa carbónica IX no mostraron defectos fenotípicos observables. (C, D) Las larvas en desarrollo tratadas con inhibidores de la CA con concentraciones de 250o y 125o, respectivamente. Los compuestos indujeron defectos fenotípicos como cuerpo curvo, edema pericárdico y saco de yema no utilizado (flechas y cabezas de flecha). Los paneles A y B se han modificado de Aspatwar et al16. Los paneles C, D y E muestran imágenes inéditas, que se obtuvieron utilizando un microscopio diferente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Determinación de la concentración letal 50 (LC50) utilizando larvas de pecce de 1-5 dpf. La evaluación de la toxicidad mediante embriones de pez cebra permite a los investigadores determinar la concentración letal mínima del compuesto químico al final del experimento.  La concentración de LC50 del compuesto (un inhibidor conocido de CA IX) fue de 3,5 mM. La alta concentración de LC50 permite una mayor caracterización del compuesto. Esta cifra ha sido modificada de Aspatwar et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Un ejemplo de análisis del patrón de natación en grupos de larvas no tratadas (A) e inhibidores (B). Las larvas de pez cebra tratadas en el panel B con compuesto inhibidor de prueba de 300 M (un inhibidor conocido de la anhidrasa carbónica humana IX) mostraron un patrón de movimiento anormal (ataxc) (cabezas de flecha), lo que sugiere que el compuesto induce neurotoxicidad en los embriones en desarrollo . Las puntas de flecha apuntan a la curvatura normal de la cola durante la natación. En el panel A las flechas apuntan a la curvatura normal de la cola durante la natación. Esta cifra ha sido modificada de Aspatwar et al.16. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Resumen de la seguridad y toxicidad de los compuestos examinados. El experimento de evaluación de toxicidad ayuda al investigador a llegar a una conclusión sobre la seguridad de los compuestos químicos probados. La concentración de LC50 permite definir una concentración segura para una mayor caracterización. Un investigador puede decidir si el compuesto es letal incluso después de 24 h de exposición de embriones al compuesto bajo investigación. En nuestro ejemplo, un efecto sutil sobre la natación debido a la neurotoxicidad es la información significativa, que es útil para establecer más experimentos. En consecuencia, sobre la base del cribado de toxicidad, pudimos utilizar concentraciones seguras del inhibidor de CA para una mayor caracterización in vivo24.

Los autores no informaron de ningún posible conflicto de intereses.