Capacidad de diferenciación de las células del Progenitor humano aórtica adiposo Perivascular gratis

Resumen

El objetivo de este protocolo es para poner a prueba la capacidad de diferenciarse en múltiples linajes celulares de células progenitoras derivadas de tejido adiposo de humanos perivascular. Diferenciación fue comparada con las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana, que se conoce a diferenciarse en adipocitos, Osteocito y linajes de condrocitos.

Resumen

Tejido adiposo es una fuente rica de multi-potente células madre mesenquimales (MSC) capaces de diferenciarse en osteogénico, adipogenic y condrogénica. Adipogenic diferenciación de células progenitoras es un mecanismo importante de conducción disfunción y expansión del tejido adiposo en respuesta a la obesidad. Los cambios de comprensión en el tejido adiposo perivascular (PVAT) es clínicamente relevante en la enfermedad metabólica. Sin embargo, estudios previos han sido predominantemente en el ratón y otros animales modelos. Este protocolo utiliza humanos torácica PVAT las muestras recolectadas de pacientes sometidos a cirugía de bypass aortocoronario. Tejido adiposo de la aorta ascendente fue recogido y utilizado para la explantación de la fracción vascular estromal. Previamente confirmamos la presencia de células progenitoras adiposas en PVAT humano con capacidad de diferenciarse en que contiene lípidos adipocitos. En este estudio, se analizaron además el potencial de diferenciación de las células de la fracción vascular estromal, que presumiblemente contiene células progenitoras multi-potente. Comparamos las células PVAT derivadas de médula ósea humana MSC para la diferenciación en adipogenic, osteogénica y condrogénica linajes. Después de 14 días de diferenciación, las manchas específicas fueron utilizadas para detectar acumulación de lípidos en los adipocitos (O aceite rojo), depósitos calcíficos en células osteogénicos (alizarina rojo), o glicosaminoglicanos y colágeno en las células condrogénica (TRICROMICA de Masson). Mientras que la médula ósea MSC distingue eficientemente en los tres linajes, células derivadas del PVAT tenían adipogenic y condrogénica potencial, pero carecía de potencial osteogénico robusto.

Introducción

Tejido adiposo es una fuente rica de multi-potente células madre mesenquimales (MSC) capaces de diferenciarse en osteogénico, adipogenic y condrogénica linajes¹. Este tejido se expande a través de la hipertrofia de los adipocitos maduros y de diferenciación de novo de MSC residente a adipocitos. El tejido adiposo perivascular (PVAT) rodea los vasos sanguíneos y regula la función vascular^2,3. Expansión PVAT inducida por la obesidad exacerba la patología cardiovascular. Mientras que el potencial multipotent de MSC de depósitos adiposos subcutáneos humanos han sido bien estudiadas^4,5, ningún estudio explantados y evaluó la capacidad de diferenciación de las células progenitoras PVAT derivado humano, probablemente debido a la invasividad de la contratación. Así, el objetivo de este trabajo es proporcionar una metodología de explantación y propagar células progenitoras de PVAT aórtica humana de pacientes con enfermedades cardiovasculares y para probar su propensión a diferenciar a osteogénico condrogénica y adipogenic linajes. Nuestra fuente de PVAT es desde el sitio de la anastomosis del injerto de bypass en el ascendente de la aorta de pacientes obesos sometidos a cirugía de bypass aortocoronario. PVAT recién aislado es enzimáticamente disociado y la fracción vascular estromal es aislada y propagada in vitro, lo que nos permite probar por primera vez la capacidad de diferenciación de células progenitoras derivadas de PVAT humana.

Usando primaria cultivados humanos PVAT stromal vascular fracción, probamos tres ensayos diseñados para inducir a las células madre/progenitoras para diferenciar hacia adipogenic, osteogénico, o linajes condrogénica. Nuestro estudio anterior identificó una población de CD73 +, CD105 + y células PDGFRa + (CD140a) que robusta pueden diferenciarse en adipocitos⁶, aunque no fue probado su multipotencia. PVAT directamente regula el tono y la inflamación vascular⁷. El fundamento para probar el potencial de diferenciación de esta población celular nuevo es comenzar a comprender la influencia especializada de PVAT sobre la función vascular y los mecanismos de expansión PVAT durante la obesidad. Esta metodología aumenta nuestra comprensión de las funciones de las células madre derivadas de tejido adiposo y nos permite identificar y comparar las similitudes y diferencias de las células progenitoras procedentes de diferentes tejidos. Se basan en enfoques establecidos y validados para aislar y diferenciar MSC hacia diversos linajes y optimizar procedimientos para maximizar la viabilidad de las células progenitoras derivadas PVAT humana. Estas técnicas tienen amplias aplicaciones en los campos del vástago y del progenitor investigación y tejido adiposo desarrollo de la célula.

Protocolo

El uso de tejidos humanos en el presente estudio fue evaluado y aprobado por el institucional de Junta de Maine Medical Center, y todo el personal recibió entrenamiento apropiado antes de la experimentación.

1. preparaciones

1. Hacer buffer de disociación por reconstituir 50 mg animal-libre colagenasa/dispase mezcla solución con 1 mL de solución de trabajo de nanopure H₂O. preparar 1 mg/mL mediante la adición de 49 mL de DMEM que contenía 1% w/v BSA a la colagenasa reconstituido de alta glucosa / solución dispase. Guardar alícuotas de trabajo de 5 mL a-20 ° C y caliente a 37 ° C utilizando a un previo baño de agua a utilizar.
2. Hacer solución de antibiótico mediante la adición de 1 mL de solución antibiótico/antimicótico de 100 x (concentración final es de 200 unidades/mL de penicilina, estreptomicina 200 de unidades/mL y 0,5 μg/mL fungizone) en 49 mL de HBSS y almacenar en hielo.
3. Preparar solución de gelatina (0,2% p/v) disolviendo gelatina 200 mg de piel bovina en 100 mL de nanopure H₂O. Autoclave la solución durante 20 minutos y almacenar a 4 ° C.
4. Preparar 500 mL de medio de crecimiento PVAT: glucosa alta DMEM/F12 con suplemento de glutamina, piruvato de sodio y bicarbonato de sodio, suplementado con 10% FBS y agente antimicrobiano 100 μg/mL (véase Tabla de materiales).
5. Preparar medios de inducción de adipogenic 50 mL: glucosa alta 40,8 mL DMEM, complementada con medios de crecimiento 7,5 mL PVAT, 500 μl de 100 x antibiótico/antimicótico solución (concentración final es 100 unidades/mL de penicilina y estreptomicina 100 de unidades/mL fungizone 0.25 μg/mL), 0,5 mM IBMX (stock de 500 mM en 0,1 M NaOH), la dexametasona de 1 μm (valores de 1 mM en etanol), 5 μm rosiglitazona (bolsa de 5 mM en DMSO), 33 μm biotina (stock de 66 mM en DMSO), 100 insulina nM (200 stock μm en ácido acético al 0.1%) y 20 μm ácido pantoténico (bolsa de 100 mM de H₂ O).
6. Preparar 50 mL de medio de inducción de control para el linaje de adipogenic: glucosa alta 40,8 mL DMEM suplementado con medios de crecimiento PVAT 7,5 mL y 500 μl de pen-strep (100 acciones de x).
7. Preparar los medios de mantenimiento de adipogenic 50 mL: glucosa alta mL 41,5 DMEM suplementado con 7,5 mL PVAT medios de crecimiento en el paso 1.3, 500 μl pen-strep (100 acciones de x), dexametasona 1 μm (valores de 1 mM en EtOH), biotina μm 33 (valores de 66 mM en DMSO), insulina nM 100 (200 μm hasta la existencia en 0.1% CA ácido etic) y el ácido pantoténico μm 20 (bolsa de 100 mM de H₂O).
8. Preparar 500 mL de medio de crecimiento para los linajes osteogénicos y condrogénica: suplemento de glucosa alta αMEM suplementado con 10% FBS, glutamina x 1 (véase Tabla de materiales) y 5 mL de pen-strep (100 acciones de x).
9. Preparar 50 mL de medio de inducción para el linaje osteogénico: 50 mL de los medios de crecimiento de MSC de médula ósea suplementados con 10 nM dexametasona y glicerofosfato-β de 10 mM.
10. Preparar 50 mL de medio de inducción para la estirpe condrogénica: 50 mL de los medios de crecimiento de MSC de médula ósea con 100 nM dexametasona, 50 μg/mL ascorbato-2-fosfato de sodio y 10 ng/mL TGFβ1. Para las condiciones osteogénicos y condrogénica, los medios de crecimiento MSC de médula ósea basal servirá como los medios de no inducción.

2. Protocolo n ° 1: Cultura PVAT humano las células de la fracción Vascular estromal

Nota: PVAT es resecado desde el sitio de la anastomosis del injerto en la aorta ascendente de anestesiados pacientes sometidos a procedimientos de injerto de bypass de arteria coronaria. PVAT aórtica se coloca un 15 mL cónico que contiene 10 mL hielo frío alta glucosa en DMEM F12 y trasladado desde el quirófano al laboratorio dentro de las 2 h de la resección. PVAT aórtica es tejido desechado durante el procedimiento de by-pass y ha sido considerado como investigación de sujetos no humanos por la Junta de revisión interna del centro médico de Maine.

1. Este protocolo es para un pedazo de ~ 500 mg de PVAT humano (aproximadamente 3 x 1 x 0,5 cm³). Transferir PVAT humano fresco de DMEM a un tubo cónico de 50 mL conteniendo 25 mL de solución de antibiótico. Incubar con mecedora por 20 min a 4 ° C. Mientras que el PVAT es en solución antibiótica, descongele una alícuota del almacenador intermediario de la disociación a 37 ° C.
2. Añadir 50 μl de solución de antibiótico/antimicótico de x 100 a 5 mL de tampón de disociación y esterilice usando un filtro de jeringa 0,22 μm. Añadir 1 mL de solución de gelatina al 1 bien de una placa de 24 pozos. En campana de flujo laminar, use pinzas estériles y tijeras para transferir PVAT de la solución de antibiótica a una placa de Petri estéril. Añadir 1 mL de tampón de disociación precalentado al tejido y Pique finamente el tejido entero en una mezcla (no trozos de más de ~ 2 x 2 mm²) utilizando pinzas estériles y tijeras de disección.
3. Transferir la mezcla de 1 mL a 4 mL de tampón de disociación e incubar el tubo a su lado en un agitador orbital con 37 ° C a 200 rpm durante 1 hora. Después de 1 h, no pedazos de tejido visible estará presentes, y la solución aparecerá como una suspensión turbia.
4. Filtrar la solución a través de un tamiz de célula μm 70 ubicado en lo alto de un tubo cónico de 50 mL. Enjuague el filtro con una solución antibiótica adicional 10 mL para capturar tantas células como sea posible. No apriete el filtro.
5. Sedimenten las células por 12 min a 300 x g en una centrífuga oscilante del cubo.
   Nota: Después de la centrifugación, se separará el tubo en una capa superior grasa de los adipocitos, una interfase y un diábolo. El pellet es la fracción vascular estromal que contiene las células endoteliales, células inmunes, las células de sangre y células progenitoras.
6. Resuspender el precipitado en 10 mL de HBSS y centrifugar durante 5 min a 300 x g. Repita este paso para un total de 2 lavados en HBSS. Después del último lavado, no lisar los glóbulos rojos. Varios intentos con varios búferes disponibles comercialmente y tiempos de incubación han conducido a reducciones marcadas en accesorio de la célula progenitora y viabilidad.
7. Aspirar la gelatina de la placa de 24 pocillos. Lave suavemente el bien 1 x con HBSS quitar gelatina sin consolidar.
8. Resuspender el precipitado de la fracción vascular estromal con glóbulos rojos intactos en 1 mL de medio de crecimiento y semilla en el recubrimiento de gelatina bien. Añadir humanos FGF2 (resuspendió en PBS con 0,01% BSA w/v) a una concentración final de 25 ng/mL en medio de cultivo. Incubar durante 24 h a 37 ° C con 5% CO₂.
9. Al día siguiente, quitar medios de cultivo y lavado pozos x 5 con HBSS para eliminar glóbulos rojos y las células muertas. Añadir 1 mL de medio fresco crecimiento suplementado con 25 ng/mL FGF2.
10. Cambiar el medio cada 48 h, para complementar con 25 ng/mL FGF2 fresco cada vez.
11. Las células típicamente alcanzan confluencia 100% 7-10 días después de explante; células del paso a continuación:
    1. Aspirar monocapa de los medios de comunicación y lavado de crecimiento 2 x 1 ml HBSS. Aspire todo HBSS de los pozos y añadir unas gotas de solución de disociación celular.
    2. Toque y agitar a la placa e incubar a 37 ° C con 5% CO₂ para 5-7 min levantar las células. Añadir ~ 1 mL de medio de cultivo fresco a las células separadas y distribuir 500 μl a 2 pocillos de una placa de 24 pocillos, cada uno conteniendo 500 μl crecimiento los medios de comunicación y 25 ng FGF2.
12. Continúan expandiendo células humanas derivadas de PVAT como se indica en el paso anterior. Cada paso debe ser no mayor que una división de 1:2. Las células son pasadas 5 a 7 veces antes de la asignación para los ensayos de diferenciación.

3. Protocolo 2: Cultura médula ósea humana MSC colonias

Nota: Médula ósea humana MSC son aislados como descrito⁸ y como primeros paso congelado las existencias congelar media (70% FBS 20% basal DMEM y 10% DMSO) ~ 100.000 células/ml en líquido N₂.

1. Rápidamente descongelar un vial de médula ósea MSC del líquido N₂ en un baño de agua de 37 ° C y la placa de un pocillo de una placa de cultivo de 6 pozos que contienen 3 mL de medio de crecimiento de MSC e incubar durante una noche a 37 ° C y 5% CO₂.
2. Al día siguiente, medios de cultivo MSC de aspirar y lavar las células 3 x en 2 mL de HBSS. En 100% de confluencia, medios de cultivo de aspirar y lavar las células 3 x en 2 mL de HBSS. Añadir 500 μL/pocillo celular separación solución, incubar a 37 ° C y 5% de CO₂ por 5 min golpee ligeramente la placa para todas las células son desalojados y distribuir contenido a 2 pocillos de una placa de 6 pozos que contienen medios de cultivo 2 mL MSC.
3. Ampliar la médula ósea humana y MSC PVAT derivado paralelamente durante aproximadamente 5 – 7 pasos o hasta cantidades suficientes para las pruebas se ha logrado.

4. Protocolo 3: Placa e inducir Adipogenic, osteogénica y condrogénica linajes

1. Replica los números apropiados de la placa de la médula y las células derivadas de PVAT por pozo de una placa de 12 pozos y apropiadas para cada condición experimental. Para adipogenic y osteogénicos condiciones, ~ 200, 000 – 225.000 células/pocillo se necesita, para condiciones condrogénica de células/pocillo se necesitan 150.000-175.000.
   Nota: Corrimos un mínimo de N = 3 pozos replicadas para el control e inducida por las condiciones de cada linaje experimental para los funcionamientos de un total de 2 independientes (N = total de 6 repeticiones).
2. Disociar las células de la población de la célula humana PVAT progenitoras y la población de MSC de médula ósea humana usando solución de separación celular e incubación a 37 ° C y 5% CO₂ para las poblaciones de piscina de 5 minutos en frascos cónicos separado 15 mL. Girar el frasco hacia abajo a 500 x g por 7 min para que sedimenten las células. Resuspender en 1 mL de PBS y un hemocitómetro para estimar el número de celular.
3. Las células en pozo de 12 platos de la placa como se indica en el paso 4.1. Prever platos separados adipogenic inducida y no inducidas, osteogénico y las condiciones para que la condición no-inducida puede ser fijo en un momento anterior sin interrumpir continuar la cultura de la condición inducida.
4. Añadir 1,5 mL de adipogenic y medios de inducción osteogénica a cada pocillo de la condición inducida. Añadir 1,5 mL de adipogenic y medios no inducción osteogénicos a cada pocillo de la condición de no inducido. Comenzar la incubación de la adipogenic osteogénica células inducidas y no inducidas por poblaciones y en 37 ° C y 5% CO₂.
5. Girar hacia abajo el volumen restante de las células progenitoras PVAT humanas y médula ósea humana MSCs por 7 min a 500 x g.
6. Determinar el volumen necesario para resuspender restantes la médula ósea y células PVAT pellets para lograr una densidad de 100.000 células/10 μl (10⁶ células/mL). Resuspender el pellet en el volumen calculado de medios de cultivo de MSC para la inducción de estirpe condrogénica. Mueva suavemente el volumen de las células de arriba y abajo utilizando una pipeta para asegurar una distribución homogénea.
7. Tomar con pipeta una gota de 10 μl de la solución concentrada de células en el centro de cada pozo para formar una micromass de 100.000 células. Coloque 1 mL de estéril de H₂O en el pozo adyacente para evitar la evaporación. Incubar los cultivos micromass por 2 h a 37 ° C y 5% CO₂ para permitir la micromass a agregado.
8. Después de 2 horas, agregue cuidadosamente los medios de diferenciación condrogénica tacon con 10 ng/mL TGFβ1 humana a cada uno de los pozos de condición inducida. Cuidadosamente añadir 1,5 mL de los medios de no inducción (medio de crecimiento de MSC de médula ósea) en los pocillos de condición no-inducida. Utilizar placas 12-bien separadas para las condiciones inducidas y no inducidas por lo que la condición no-inducida puede ser fijo en un momento anterior.

5. Protocolo 4: Cultura Adipogenic, osteogénico y linajes condrogénica durante 14 días

1. La cultura las condiciones inducidas y no inducidas de los tres linajes durante 4 días a 37 ° C y 5% CO₂, actualizar los medios de comunicación cada 2 días. El día 4, cambiar la condición de linaje adipogenic inducida de los medios de inducción a los medios de mantenimiento para el resto del ensayo.
2. Todas las condiciones inducidas por no fijar en formol al 10% para 12 h. dispone de formalina y lavado todo fijada pozos x 2 en PBS para eliminar todos los rastros de formol. Almacenar las placas en PBS a 4 ° C hasta el procesamiento.
3. La cultura las condiciones inducidas por un total de 14 días, actualizar los medios de comunicación cada 2 días. Añadir TGFβ1 fresco a 10 ng/mL concentración final con cada actualización de los medios de inducción condrogénica. Continuar a la cultura del linaje adipogenic en adipogenic mantenimiento medios de comunicación y los medios de inducción linaje osteogénico, refrescante cada 2 días. En el día 14, fijar condiciones todo inducidas por 12 h en formalina al 10% para tinción.
4. Raspe o vierta el micromass en la condición de inducción condrogénica en un cassette para empotrar. Deshidratar el micromass en una serie de baños de alcohol cada vez más concentrado por 5 min, comenzando en 70%, entonces, dos veces de 95%, 80% y dos veces más en alcohol absoluto. Coloque el cartucho en un agente de desalcoholización y entonces finalmente insertar el cassette en parafina para el seccionamiento y la coloración.

6. Protocolo 5: Tinción Adipogenic condición con aceite O rojo

1. Preparar solución stock aceite rojo O disolviendo 350 mg de aceite rojo O en 100 mL de isopropanol al 100%. Mezcle por 2 h con una barra de agitación y vacío a través de un filtro de 0.2 μm. Solución madre se puede almacenar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 año.
2. Preparar aceite rojo O solución diluida mezclando 3 partes solución a 2 partes diH₂0 (por ejemplo, 60 mL de solución madre a 40 mL diH₂0). La concentración final de aceite rojo O en la solución de trabajo es de 2,1 mg/mL.
3. Retire todo el líquido de pozos. Lavar cada pozo 2 x con isopropanol al 60%, asegurándose de eliminar completamente toda el agua de los lados de los pocillos. Aspire isopropanol al 60% y agregar rápidamente la solución de trabajo de aceite rojo O sin tocar las paredes de los pozos para cubrir el fondo. Es fundamental que este paso se hace rápidamente para que no sequen los pozos.
4. Una vez que se agrega el aceite rojo O, incubar 10 min a temperatura ambiente con el suave balanceo.
5. Quite todo aceite rojo O y añadir agua destilada H₂O. Wash con agua destilada de H₂O 10 m empezar a quitar Oil Red O. Después de 10 minutos, aspirar aceite rojo O y repita el procedimiento de lavado 3 x.
6. Una vez finalizado el lavado, añadir PBS y las células de la imagen. Almacenar las células en PBS a 4 ° C.

7. Protocolo 6: Tinción condición osteogénica con rojo de alizarina

1. Retire todo el líquido de cada pocillo. Añadir volumen apropiado de solución al 2% rojo de alizarina colorante a cada pozo (1,5 mL por pocillo de una placa de 12 pozos) y suavemente incline el plato de lado a lado hasta que la solución cubra totalmente el fondo del pozo.
2. Incubar por 15 min a temperatura ambiente. Quitar el rojo de alizarina de los pozos. Enjuague suavemente cada bien cuatro veces con agua destilada de H₂O, teniendo precaución para no desalojar los cristales de calcio. Deje que se seque.

8. Protocolo 7: Coloración Trichrome condrogénica condición de Masson

1. Hornear los portaobjetos en un horno seco de 60 ° C durante 30 minutos secciones Deparaffinize e hidratan en agua destilada.
   1. Para rehidratar, coloque los portaobjetos en tres incubaciones de 5 min con agentes de desalcoholización, seguidos de incubaciones de 5 min en bajar las concentraciones de alcohol como sigue: dos al 100% (etanol absoluto), dos en el 95% de alcohol, dos en 80%, dos al 70% y finalmente dos en agua destilada H₂O. las diapositivas puede permanecer en H₂O mientras se prepara el fijador de Bouin.
2. Lugar 40 mL de fijador de Bouin en un tarro de plástico coplin para microondas (descubierto). Microondas en high para llevar la temperatura a 55 ° C. Coloque los portaobjetos en solución caliente por 20 min; deje en reposo sobre la superficie de cubierta. Lavar en agua corriente durante 10 minutos o hasta que todo el color amarillo desaparezca.
3. Mancha de secciones en hematoxilina de Weigert durante 10 minutos lavado en agua corriente durante 10 minutos.
4. Secciones de Beibrich escarlata ácido en solución durante 10 minutos lavado 3 x 10 min en agua del grifo de la mancha. Mordiente los portaobjetos en solución de ácido fosfomolíbdico/fosfotúngstico durante 10 minutos. No enjuague.
5. Coloque los portaobjetos en solución anilina azul para 10 minutos enjuague con dos breves inmersiones en agua del grifo.
6. Coloque los portaobjetos en solución de ácido acético al 1% durante 3 a 5 min lavado en agua corriente durante 1 minuto lugar en etanol al 95% durante 1 minuto deshidratar como se indica en el paso 5.4 y montar con resina sintética.

Resultados

Aislamiento de la fracción vascular estromal de PVAT humana

Figura 1A se muestra un diagrama esquemático de la región anatómica donde se obtuvo la PVAT que cubre la aorta ascendente. Anteriormente Describimos los grupos de pacientes sometidos a injerto de puente de arteria coronaria que estas muestras eran derivadas⁶. Figura 1B m...

Discusión

Células progenitoras adiposas de diferentes depósitos varían ampliamente en la diferenciación y el fenotipo potencial⁹. Cultivo de progenitores PVAT derivado de un solo donante paciente en inducción simultánea por tres linajes diferentes, adipogenic, osteogénica y condrogénica, permite una investigación bien controlada de la capacidad pluripotencial de esta novela población de células progenitoras. La metodología descrita en este informe se puede utilizar para probar la capacidad de diferenciación...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Mezcla de colagenasa/dispasa sin animales I	Millipore-Sigma	SCR139	50mg
Azul Alcián	NewComerSupply	1003A	1% Solución acuosa pH 2.5
Rojo Alizarina	Amresco	9436-25G
alpha-MEM	ThermoFisher 12561056
Azul de anilina	NewComerSupply	10073C
Antibiótico/antimicótico	ThermoFisher	15240062
Beibrich ácido escarlata fucsina	Millipore-Sigma	A3908-25G
b-glicerofosfato	Millipore-Sigma	G9422-10G
Biebrich Scarlet	EKI	2248-25G
Biotina	Millipore-Sigma	B4501-100MG
Fijador de Bouin	NewComerSupply	1020A
Bovino albúmina sérica	Calbiochem	12659	almacenada a 4 & °
Solución de desprendimiento de células	Accutase	AT104
Filtro de campana (70 mm)	Corning	352350
Dexametasona	Millipore-Sigma	D4902-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	4,5 g/L glucosa, L-glut y piruvato
DMEM/F12 medio	ThermoFisher	10565-042	alto en glucosa, glutamax, sodio bicarboninato
DMSO	Millipore-Sigma	D2650
Suero fetal bovino	Atlanta Biologicals	S11550
FGF2	Peprotech	100-18B
Formalina	NewComerSupply	1090
Gelatina, piel de bovino	Millipore-Sigma	G9391-500G
Glutamax	ThermoFisher	35050061	suplemento de glutamina
HBSS	Lonza	10-547F
IBMX	Millipore-Sigma	I5879-250MG
Solución de insulina	Millipore-Sigma	I9278-5ML
Aceite rojo O	Millipore-Sigma	O0625-100G
Ácido pantoténico	Millipore-Sigma	P5155-100G
Solución de penicilina-estreptomicina	ThermoFisher	15240062	100ml
Permount	Fisher	SP15-500
Solución de ácido fosfotúngstico/fosfomoibdico	Millipore-Sigma	P4006-100G/221856-100G
Primocin	Invivogen	ant-pm-1	Reactivo antimicrobiano para medios de cultivo.
Rosiglitazona	Millipore-Sigma	R2408-10MG
TGFb1	Peprotech	100-21
Hematoxilina de Weigert	EKI	4880-100G