El objetivo de este protocolo es para poner a prueba la capacidad de diferenciarse en múltiples linajes celulares de células progenitoras derivadas de tejido adiposo de humanos perivascular. Diferenciación fue comparada con las células madre mesenquimales derivadas de médula ósea humana, que se conoce a diferenciarse en adipocitos, Osteocito y linajes de condrocitos.
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Artículo de método
Capacidad de diferenciación de las células del Progenitor humano aórtica adiposo Perivascular gratis
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Resumen
Resumen
Tejido adiposo es una fuente rica de multi-potente células madre mesenquimales (MSC) capaces de diferenciarse en osteogénico, adipogenic y condrogénica. Adipogenic diferenciación de células progenitoras es un mecanismo importante de conducción disfunción y expansión del tejido adiposo en respuesta a la obesidad. Los cambios de comprensión en el tejido adiposo perivascular (PVAT) es clínicamente relevante en la enfermedad metabólica. Sin embargo, estudios previos han sido predominantemente en el ratón y otros animales modelos. Este protocolo utiliza humanos torácica PVAT las muestras recolectadas de pacientes sometidos a cirugía de bypass aortocoronario. Tejido adiposo de la aorta ascendente fue recogido y utilizado para la explantación de la fracción vascular estromal. Previamente confirmamos la presencia de células progenitoras adiposas en PVAT humano con capacidad de diferenciarse en que contiene lípidos adipocitos. En este estudio, se analizaron además el potencial de diferenciación de las células de la fracción vascular estromal, que presumiblemente contiene células progenitoras multi-potente. Comparamos las células PVAT derivadas de médula ósea humana MSC para la diferenciación en adipogenic, osteogénica y condrogénica linajes. Después de 14 días de diferenciación, las manchas específicas fueron utilizadas para detectar acumulación de lípidos en los adipocitos (O aceite rojo), depósitos calcíficos en células osteogénicos (alizarina rojo), o glicosaminoglicanos y colágeno en las células condrogénica (TRICROMICA de Masson). Mientras que la médula ósea MSC distingue eficientemente en los tres linajes, células derivadas del PVAT tenían adipogenic y condrogénica potencial, pero carecía de potencial osteogénico robusto.
Introducción
Tejido adiposo es una fuente rica de multi-potente células madre mesenquimales (MSC) capaces de diferenciarse en osteogénico, adipogenic y condrogénica linajes1. Este tejido se expande a través de la hipertrofia de los adipocitos maduros y de diferenciación de novo de MSC residente a adipocitos. El tejido adiposo perivascular (PVAT) rodea los vasos sanguíneos y regula la función vascular2,3. Expansión PVAT inducida por la obesidad exacerba la patología cardiovascular. Mientras que el potencial multipotent de MSC de depósitos adiposos subcutáneos humanos han sido bien estudiadas
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Protocolo
El uso de tejidos humanos en el presente estudio fue evaluado y aprobado por el institucional de Junta de Maine Medical Center, y todo el personal recibió entrenamiento apropiado antes de la experimentación.
1. preparaciones
- Hacer buffer de disociación por reconstituir 50 mg animal-libre colagenasa/dispase mezcla solución con 1 mL de solución de trabajo de nanopure H2O. preparar 1 mg/mL mediante la adición de 49 mL de DMEM que contenía 1% w/v BSA a la colagenasa reconstituido de alta glucosa / solución dispase. Guardar alícuotas de trabajo de 5 mL a-20 ° C y caliente a 37 ° C utilizando a un previo baño de agua a utiliz....
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Resultados
Aislamiento de la fracción vascular estromal de PVAT humana
Figura 1A se muestra un diagrama esquemático de la región anatómica donde se obtuvo la PVAT que cubre la aorta ascendente. Anteriormente Describimos los grupos de pacientes sometidos a injerto de puente de arteria coronaria que estas muestras eran derivadas6. Figura 1B m.......
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Discusión
Células progenitoras adiposas de diferentes depósitos varían ampliamente en la diferenciación y el fenotipo potencial9. Cultivo de progenitores PVAT derivado de un solo donante paciente en inducción simultánea por tres linajes diferentes, adipogenic, osteogénica y condrogénica, permite una investigación bien controlada de la capacidad pluripotencial de esta novela población de células progenitoras. La metodología descrita en este informe se puede utilizar para probar la capacidad de diferenciación.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Reconocemos la ayuda de navegación de la investigación en el centro médico de Maine para ayudar con la obtención de tejido clínico, histopatología y núcleo de histomorfometría (apoyado por 1P20GM121301, L. Liaw PI) en el Maine Medical Center Research Instituto de corte y coloración. Este trabajo fue financiado por los NIH grant HL141149 R01 (Liaw L.).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Mezcla de colagenasa/dispasa sin animales I | Millipore-Sigma | SCR139 | 50mg |
| Azul Alcián | NewComerSupply | 1003A | 1% Solución acuosa pH 2.5 |
| Rojo Alizarina | Amresco | 9436-25G | |
| alpha-MEM | ThermoFisher 12561056 | ||
| Azul de anilina | NewComerSupply | 10073C | |
| Antibiótico/antimicótico | ThermoFisher | 15240062 | |
| Beibrich ácido escarlata fucsina | Millipore-Sigma | A3908-25G | |
| b-glicerofosfato | Millipore-Sigma | G9422-10G | |
| Biebrich Scarlet | EKI | 2248-25G | |
| Biotina | Millipore-Sigma | B4501-100MG | |
| Fijador de Bouin | NewComerSupply | 1020A | |
| Bovino albúmina sérica | Calbiochem | 12659 | almacenada a 4 & ° |
| Solución de desprendimiento de células | Accutase | AT104 | |
| Filtro de campana (70 mm) | Corning | 352350 | |
| Dexametasona | Millipore-Sigma | D4902-100MG | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | 4,5 g/L glucosa, L-glut y piruvato |
| DMEM/F12 medio | ThermoFisher | 10565-042 | alto en glucosa, glutamax, sodio bicarboninato |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650 | |
| Suero fetal bovino | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| Formalina | NewComerSupply | 1090 | |
| Gelatina, piel de bovino | Millipore-Sigma | G9391-500G | |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | suplemento de glutamina |
| HBSS | Lonza | 10-547F | |
| IBMX | Millipore-Sigma | I5879-250MG | |
| Solución de insulina | Millipore-Sigma | I9278-5ML | |
| Aceite rojo O | Millipore-Sigma | O0625-100G | |
| Ácido pantoténico | Millipore-Sigma | P5155-100G | |
| Solución de penicilina-estreptomicina | ThermoFisher | 15240062 | 100ml |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Solución de ácido fosfotúngstico/fosfomoibdico | Millipore-Sigma | P4006-100G/221856-100G | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | Reactivo antimicrobiano para medios de cultivo. |
| Rosiglitazona | Millipore-Sigma | R2408-10MG | |
| TGFb1 | Peprotech | 100-21 | |
| Hematoxilina de Weigert | EKI | 4880-100G |
Referencias
- Minteer, D., Marra, K. G., Rubin, J. P. Adipose-derived mesenchymal stem cells: biology and potential applications. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 59-71 (2013).
- Akoumianakis, I., Tarun, A., Antoniades, C.
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Reimpresiones y permisos
