La inmunoprecipitación por cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para comprender los mecanismos moleculares de la regulación genética. Sin embargo, el método implica dificultades para obtener fragmentación de cromatina reproducible mediante cizallamiento mecánico. Aquí, proporcionamos un protocolo mejorado para un ensayo ChIP usando digestión enzimática.
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Artículo de método
Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos
En este artículo
Resumen
Resumen
Para expresar fenotipos celulares en los organismos, las células vivas ejecutan la expresión génica en consecuencia, y los programas transcripcionales desempeñan un papel central en la expresión génica. La maquinaria transcripcional celular y sus proteínas de modificación de cromatina se coordinan para regular la transcripción. Para analizar la regulación transcripcional a nivel molecular, están disponibles varios métodos experimentales como el cambio de movilidad electroforética, el reportero transitorio y los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Describimos un ensayo ChIP modificado en detalle en este artículo debido a sus ventajas en mostrar directamente las modificaciones de la histona y las interacciones entre las proteínas y el ADN en las células. Uno de los pasos clave en un ensayo ChIP exitoso es la cizalladura de cromatina. Aunque la sonicación se utiliza comúnmente para el cizallamiento de cromatina, es difícil identificar condiciones reproducibles. En lugar de cizallar cromatina por sonicación, utilizamos digestión enzimática con nucleasa microcócica (MNase) para obtener resultados más reproducibles. En este artículo, proporcionamos un protocolo de ensayo ChIP sencillo usando MNase.
Introducción
La expresión génica en células de mamíferos está regulada de forma estricta y dinámica, y la transcripción es uno de los pasos clave. La transcripción genética está regulada principalmente por factores de transcripción y histonas. Un factor de transcripción es una proteína que se une a secuencias de ADN específicas y controla la transcripción genética. Estos factores promueven o inhiben el reclutamiento de ARN polimerasa II (PolII), que inicia la síntesis de ARNm a partir del ADN genómico como plantilla1. Las modificaciones histonas como la acetilación y la metilación de los residuos de la cola de histona afectan positiva y negativamente a la t....
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Protocolo
1. Preparación de reactivos
- Haga una solución de paraformaldehida (PFA) del 18,5%. Añadir 0,925 g de PFA, 4,8 ml de agua (utilizar agua ultrapurificada en todo el protocolo) y 35 ml de KOH de 1 M en un tubo de plástico cónico de 50 ml. Cierre bien la tapa y caliente el tubo en un vaso de vidrio de 400-600 ml que contenga aproximadamente 200 ml de agua utilizando un microondas. Retire el tubo antes de que el agua comience a hervir y vórtice el tubo para disolver la PFA. Deje que el PFA se enfríe a temperatura ambiente y guárdelo en hielo.
NOTA: Repita el calentamiento y la mezcla hasta que el PFA se disuelva por completo. Prepare la soluci....
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Resultados
La digestión de la cromatina es uno de los pasos importantes para un ensayo DeC. Usamos MNase para digerir la cromatina para obtener una mezcla de oligómeros nucleosos. En el paso de digestión MNase, MNase puede pasar a través de la membrana nuclear y digerir la cromatina. Sin embargo, la cromatina digerida no puede pasar a través de la membrana y permanece en los núcleos. Para liberar la cromatina digerida de los núcleos, se necesita una breve sonicación. La Figura 1A muestra microfotografí.......
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Discusión
Aunque la sonicación se utiliza comúnmente para obtener cromatina fragmentada, es lento y engorroso identificar condiciones reproducibles. En este protocolo, utilizamos la digestión MNase porque la digestión enzimática debería ser más fácil de identificar condiciones reproducibles. Un breve paso de sonicación después de la digestión de la MNase (ver paso 2.2) fue necesario para romper la membrana celular y liberar la cromatina digerida. Por lo tanto, el poder de sonicación en nuestro protocolo debe ser lo más bajo posibl.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Esta investigación es apoyada por las regalías de Genentech a la Ciudad de la Esperanza. Este trabajo no es apoyado total o parcialmente por los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA (pH 8,0) | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2 M KCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 2x iQ SYBR Green supermix | Bio-Rad | 1706862 | |
| 5 M NaCl | Thermo Scientific | AM9010 | |
| 50 bp | England Biolabs | N3236S Producto de | |
| agarosa | Internacional | A20090 | |
| Octilfenoxi ramificado poli(etilenoxi)etanol | Millipore Sigma | I8896 | IGEPAL CA-630 |
| Perlas magnéticas de proteína G de grado ChIP | Tecnología de señalización celular | 9006S | |
| Tampón de dilución de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) | Millipore Sigma | 20-153 Composición del | tampón: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM de NaCl. |
| Tinte de carga de gel púrpura (6x) | New England Biolabs | B7024S | |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0724 | Glucógeno de grado de electroféresis |
| Millipore Sigma | G1767 | 19-22 mg/mL | |
| Cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa Halt, sin EDTA (100x) | Thermo Scientific | 78445 | |
| High Salt Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-155 Composición del | tampón: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl. |
| Histona H3K4me3 anticuerpo (pAb) | Active Motif | 39915 | |
| LiCl Immune Complex Wash Buffer | Millipore Sigma | 20-156 Composición del | tampón: 0,25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% ácido desoxicólico (sal sódica), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,1. |
| Tampón de lavado de complejo inmune bajo en sal | Millipore Sigma | 20-154 Composición del | tampón: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl. |
| Magna GrIP Rack (8 pocillos) | Millipore Sigma | 20-400 | Cualquier tipo de soporte de separación magnética que sea compatible con un tubo de 1,5 mL está bien. |
| La nucleasa microcócica | New England Biolabs | M0247S | viene con un tampón 10x (500 mM de Tris-HCl, 50 mM de CaCl2, pH 7,9 a 25 & grados; C) y 100x BSA (10 mg/mL) |
| NaHCO3 | JT Baker | 3506-01 | |
| Conejo normal IgG | Millipore Sigma | 12-370 | |
| PIPES | Millipore Sigma | P6757 | |
| Proteinasa K | Millipore Sigma | 3115887001 | |
| Sistema de PCR en tiempo real | Bio-Rad | CFX96, C1000 | |
| ARN pol II CTD phospho Ser5 anticuerpo | Active Motif | 39749 | |
| SDS | Boehringer Mannheim 100155 | de grado electroférese | |
| Millipore Sigma | S5636 | ||
| Sonicator equipado con una sonda de micropunta | QSONICA | Q700 | Cualquier tipo de sonicadores que sean compatibles con un tubo de 1,5 mL está bien. |
| Fenol ultrapuro:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1, v/v) | Thermo Scientific | 15593031 | pH 8.05 |
Referencias
- Nikolov, D. B., Burley, S. K. RNA polymerase II transcription initiation: a structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (1), 15-22 (1997).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalen....
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Reimpresiones y permisos
