Artículo de método

Ensayo de inmunoprecipitación de cromatina utilizando nucleasas microcócticas en células de mamíferos

DOI:

10.3791/59375

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10 de mayo de 2019

 , 
1Department of Molecular and Cellular Biology, Beckman Research Institute of City of Hope

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La inmunoprecipitación por cromatina (ChIP) es una poderosa herramienta para comprender los mecanismos moleculares de la regulación genética. Sin embargo, el método implica dificultades para obtener fragmentación de cromatina reproducible mediante cizallamiento mecánico. Aquí, proporcionamos un protocolo mejorado para un ensayo ChIP usando digestión enzimática.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para expresar fenotipos celulares en los organismos, las células vivas ejecutan la expresión génica en consecuencia, y los programas transcripcionales desempeñan un papel central en la expresión génica. La maquinaria transcripcional celular y sus proteínas de modificación de cromatina se coordinan para regular la transcripción. Para analizar la regulación transcripcional a nivel molecular, están disponibles varios métodos experimentales como el cambio de movilidad electroforética, el reportero transitorio y los ensayos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP). Describimos un ensayo ChIP modificado en detalle en este artículo debido a sus ventajas en mostrar directamente las modificaciones de la histona y las interacciones entre las proteínas y el ADN en las células. Uno de los pasos clave en un ensayo ChIP exitoso es la cizalladura de cromatina. Aunque la sonicación se utiliza comúnmente para el cizallamiento de cromatina, es difícil identificar condiciones reproducibles. En lugar de cizallar cromatina por sonicación, utilizamos digestión enzimática con nucleasa microcócica (MNase) para obtener resultados más reproducibles. En este artículo, proporcionamos un protocolo de ensayo ChIP sencillo usando MNase.

Introducción

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La expresión génica en células de mamíferos está regulada de forma estricta y dinámica, y la transcripción es uno de los pasos clave. La transcripción genética está regulada principalmente por factores de transcripción y histonas. Un factor de transcripción es una proteína que se une a secuencias de ADN específicas y controla la transcripción genética. Estos factores promueven o inhiben el reclutamiento de ARN polimerasa II (PolII), que inicia la síntesis de ARNm a partir del ADN genómico como plantilla1. Las modificaciones histonas como la acetilación y la metilación de los residuos de la cola de histona afectan positiva y negativamente a la transcripción del gen cambiando la estructura de la cromatina2. Dado que las alteraciones en la expresión génica afectan al contexto celular, es esencial examinar los mecanismos moleculares por los cuales se regula la transcripción.

Hasta la fecha, se dispone de varios métodos para investigar la regulación de la transcripción genética. El ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA), también llamado ensayo de cambio de gel, se utiliza para analizar una interacción proteína-ADN3. Un extracto nuclear de células de interés se incuba con una sonda de ADN con etiqueta de isótopo radiactivo (por ejemplo, 32P) y electroforesed en un gel de poliacrilamida. Su autoradiograma muestra que el complejo ADN-proteína migra más lentamente que la sonda en un gel. En presencia de un anticuerpo contra la proteína, el complejo ADN-proteína-anticuerpo migra en un gel más lentamente que el complejo DE proteínas de ADN. Esta banda superimprovisada revela una unión específica entre el ADN y la proteína. Sin embargo, EMSA sólo determina una interacción específica ADN-proteína en un sistema libre de células, y por lo tanto sigue siendo desconocido si la interacción controla la transcripción en células vivas. El ensayo transitorio del reportero, comúnmente llamado ensayo de reportero luciferasa, fue desarrollado para abordar la regulación de la expresión génica en las células. Por lo general, una región genómica ascendente de un genal de interés se inserta en un plásmido reportero, transfectó transitoriamente en las células, y se mide la actividad del reportero. Una variedad de mutantes de eliminación permite la identificación de las regiones que son responsables de la regulación genética. A pesar de que un ensayo de reportero es una herramienta útil para identificar factores de transcripción y unir secuencias de ADN que controlan la transcripción, este método tiene una desventaja importante en que un plásmido reportero está libre de estructura de cromatina y no refleja "real" maquinaria de transcripción. Además, el sistema no puede determinar los cambios en las modificaciones de histono.

El desarrollo del método de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) se basó en los informes de Jackson y Chalkley de que la fijación de "células enteras" con la estructura de cromatina preservada con formaldehído4,5. Desde entonces, muchas técnicas relacionadas se han desarrollado y mejorado6. En los ensayos de ChIP, las células se fijan con formaldehido para cruzar el ADN y las proteínas. La cromatina se fragmenta y luego se inmunoprecia con anticuerpos de interés. El complejo inmunológico se lava y se purifica el ADN. La amplificación de PCR con imprimaciones dirigidas a una región particular del genoma revela la ocupación de proteínas de interés en el genoma.

Aunque ChIP es una poderosa herramienta para identificar las interacciones de proteínas como factores de transcripción y histonas modificadas con el ADN, el método implica algunas dificultades, como un paso de fragmentación de la cromatina, en la práctica. La sonicación ha sido ampliamente utilizada para el cizallamiento de cromatina; sin embargo, es engorroso identificar condiciones reproducibles. El tratamiento de la nucleasa microcócica (MNase) es un método alternativo para la cizalladura de cromatina. MNase es una endo-exonucleasa que digiere ADN y ARN de doble cadena, de una sola cadena, circular y lineal. Es relativamente fácil determinar las condiciones, incluyendo las cantidades de cromatina y enzima, temperatura y tiempo de incubación, para una fragmentación óptima de la cromatina. Modificamos y simplificamos los protocolos existentes, y establecimos un método sencillo y reproducible. Este documento proporciona el protocolo para un ensayo ChIP utilizando MNase en células de mamíferos.

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Protocolo

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1. Preparación de reactivos

  1. Haga una solución de paraformaldehida (PFA) del 18,5%. Añadir 0,925 g de PFA, 4,8 ml de agua (utilizar agua ultrapurificada en todo el protocolo) y 35 ml de KOH de 1 M en un tubo de plástico cónico de 50 ml. Cierre bien la tapa y caliente el tubo en un vaso de vidrio de 400-600 ml que contenga aproximadamente 200 ml de agua utilizando un microondas. Retire el tubo antes de que el agua comience a hervir y vórtice el tubo para disolver la PFA. Deje que el PFA se enfríe a temperatura ambiente y guárdelo en hielo.
    NOTA: Repita el calentamiento y la mezcla hasta que el PFA se disuelva por completo. Prepare la solución de PFA inmediatamente antes de la reticulación (paso 2.1.3).
  2. Haga una solución de glicina de 1,25 M. Disolver 14,07 g de glicina en 150 ml de agua y filtrar a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 m. Conservar a 4oC.
  3. Haga el búfer de lisis de la célula ChIP. Disolver 378 mg de PIPES, 10,6 ml de 2 M KCl y 1,25 g de octilphenoxi poli(etilenoxi) en agua. Ajustar el pH a 8,0 con 1 M KOH a 4 oC y hacer hasta 250 ml. Filtrar a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 m y almacenar a 4 oC.
  4. Hacer tampón de digestión de nucleasa microcócica (MNase). Para hacer 1 ml, mezcle 0,1 ml de tampón de digestión 10x MNase, 10 ml de solución de BSA de 100x, 10 ml de ditiothreitol de 0,1 M y 0,88 ml de agua.
  5. Hacer 1 M NaHCO3. Disolver 4,2 g de NaHCO3 en 50 ml de agua y filtrar a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 m. Conservar a temperatura ambiente.
  6. Hacer 10% sulfato de dodecilo sódico (SDS). Disolver 5 g de SDS en 50 ml de agua. Conservar a temperatura ambiente.
  7. Haga el búfer de elución. Mezclar 15 ml de 1 M de NaHCO3, 15 ml de 10% de SDS y 120 ml de agua para obtener 150 ml de tampón de elución para una muestra.
    NOTA: Aumente los volúmenes proporcionalmente dependiendo del número de muestras.
  8. Hacer 3 M de solución de acetato de sodio (pH 5.2). Disolver 24,6 g de acetato de sodio anhidro en agua. Ajuste el pH a 5,2 con ácido acético y comporte 100 ml. Filtrar a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 m y almacenar a temperatura ambiente.

2. Determinación de las condiciones de digestión de la MNase

NOTA: En el paso 2 del protocolo, un ejemplo con VCaP, se presentan células de cáncer de próstata humano. Se pueden utilizar líneas celulares de mamíferos; ver Nota en los pasos.

  1. Preparación de cromatina reticulada
    1. Mantener las células VCaP en glucosa Alta en DME complementada con 10% de suero bovino fetal (FBS) a 37 oC en una incubadora de dióxido de carbono. Células de VCaP de semilla sin celdas a 4 x 106 células en seis platos de 6 cm en 4 ml de medios de cultivo y cultivo durante 3 días.
      NOTA: Utilice los medios de referencia cultural adecuados para cada línea de celda. Hasta 10 x 106 células se pueden sembrar en un plato de 6 cm o 10 cm. Para células suspendidas, las células de semilla sin matraces T25. El número de platos o matraces depende de cuántas dosis se prueban para la digestión de la MNase. Si se prueban 4 dosis, prepare 6 platos o matraces. Véase también el paso 2.2.
    2. Separe las células VCaP de un plato usando trippsina y cuente la célula. Calcule el número de celda en un plato. Para las células suspendidas, retire una pequeña cantidad de suspensión celular de un matraz y cuente el número de celda.
    3. Añadir 0,229 ml de 18,5% de PFA a un plato de 6 cm en 4 ml de medios de cultivo a una concentración final del 1%. Gire suavemente pero a fondo un plato o matraz para distribuir PFA uniformemente. Incubar a temperatura ambiente durante exactamente 10 min.
      NOTA: En este paso, la cromatina y las proteínas están reticuladas. Como la PFA es tóxica, lleva a cabo este paso en una campana de humo sorquímico y usa el equipo de protección personal adecuado.
    4. Después de 10 min, añadir 0,47 ml de solución de glicina de 1,25 M a una concentración final de 125 mM. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
      NOTA: La glicina neutraliza el exceso de PFA para detener la reticulación.
    5. Aspirar formaldehyde/glycine/culture media. Lave las células agregando 4 ml de solución salina con fosfato (PBS) dos veces. Para células suspendidas, transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y centrífuga a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y añadir un volumen medio de PBS y suspender completamente. Repita este paso. Deseche los desechos líquidos correctamente, ya que contienen formaldehído.
    6. Preparar PBS que contiene proteasa e cóctel inhibidor de fosfatasa (PIC) mediante la adición de 1/100 volumen de 100x PIC a PBS. Aspirar PBS de un plato y añadir 1 mL por plato de PBS que contenga PIC. Raspa las células y transfiere la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para las células suspendidas, simplemente transfiera la suspensión a un tubo de 1,5 ml.
    7. Tubos de centrífuga a 3.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente para recuperar el pellet celular. Retire el PBS completamente con una pipeta. Registre el número de celda por tubo y almacene el pellet celular a -80 oC.
  2. Lisis celular y digestión MNase
    NOTA: El volumen del reactivo en los siguientes pasos se basa en un tubo que contiene 6 x 106 celdas. Ajustar el volumen del reactivo proporcionalmente dependiendo del número de celda; cuando un tubo contenga 2 x 106 células, utilice 100 l de tampón de lisis de células ChIP (paso 2.2.1), tampón de digestión MNase (paso 2.2.3) y tampón de dilución ChIP (paso 2.2.5) y 10 ml de 0,5 M EDTA (pH 8.0) (paso 2.2.4).
    1. Descongelar el pellet celular almacenado (células VCAP, que contiene 6 x 106 células por tubo) preparado en el paso 2.1.7 sobre hielo. Prepare el búfer de lisis de celda ChIP complementado con PIC agregando 1/100 volumen de 100x PIC al búfer. Añadir 300 l de tampón de lisis de célulaChIP complementado con PIC y resuspender el pellet a fondo. Vortex el tubo durante 15 s e incubar la suspensión sobre hielo durante 10 min.
    2. Centrifugar a 9.000 x g durante 3 min a 4oC y retirar el sobrenadante por completo. Resuspenda el gránulo en 300 ml de tampón de digestión MNase.
    3. Diluir MNase (2.000 unidad de gel/L) con tampón de digestión MNase para dar 50 unidades de gel/ L. Añadir 0, 0,5, 1, 2, 4 l de 50 unidades de gel / L de MNase a la suspensión e incubar a 37 oC durante exactamente 10 min, mezclando por inversión cada 2,5 min.
      NOTA: La Tabla 1 muestra cantidades óptimas de MNase en varias líneas celulares.
    4. Añadir 30 ml de 0,5 M EDTA (pH 8.0) para terminar brevemente la digestión de la MNase y el vórtice. Incubar durante 5 minutos sobre hielo. Centrifugar a 9.000 x g durante 5 min a 4oC y retirar el sobrenadante por completo.
    5. Prepare el búfer de dilución ChIP complementado con PIC añadiendo 1/100 volumen de 100x PIC al búfer. Resuspenda el pellet en 300 ml de tampón de dilución ChIP complementado con PIC.
    6. Sonicar la suspensión sobre hielo usando un sonicador equipado con una sonda de micropunta. Utilice las siguientes condiciones de sonicación: amplitud 2, tiempo de procesamiento 15 s, pulso ON 5 s, pulso OFF 30 s. Tome 1 l de la suspensión y insértela en un vaso deslizante y observe con un microscopio. Asegúrese de que la estructura celular está casi rota.
      NOTA: La Figura 1A muestra microfotografías representativas de la suspensión celular VCaP antes y después de la sonicación. Este paso es para liberar la cromatina digerida en el sobrenadante rompiendo membranas nucleares. Un ajuste de potencia debe ajustarse a menos del 5% de potencia máxima e intentar la sonicación durante 5 s tres veces con más de un intervalo de 30 s. Si el control de potencia está disponible, ajuste el ajuste de potencia a 5 W y procese las muestras para un total de 15 s como se mencionó anteriormente para dar una potencia total de 70-75 J. Compruebe si la estructura celular está rota como se mencionó anteriormente. Si no es suficiente, repita una vez más. La condición descrita anteriormente se aplica prácticamente a todas las líneas celulares probadas.
    7. Centrifugar a 9.000 x g durante 10 min a 4 oC, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y guardar 20 ml de la cromatina digerida para el paso 2.3. Almacene el resto a -80 oC.
  3. Reticulación inversa, purificación del ADN y análisis de la cromatina digerida
    1. Añadir 75 ml de agua, 4 ml de 5 M de NaCl y 1 l de proteinasa K a un tubo de tornillo de 1,5 ml. Añadir 20 ml de cromatina digerida de diversas condiciones de digestión MNase preparadas en el paso 2.2.7 a los tubos que contengan agua, NaCl y proteinasa K. Cierre bien la tapa, mezcle completamente e incubar el tubo a 65 oC durante la noche.
      NOTA: Este paso es para la eliminación de la reticulación entre la proteína y el ADN.
    2. Prepare dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml por condición. Añadir 100 l de fenol:cloroformo:isoamilalcohol (25:24:1) (PCI) a un tubo de 1,5 ml. Añadir 10 ml de acetato de sodio de 3 M (pH 5.2) y 2 ml de glucógeno a otro tubo.
      NOTA: El uso de cloroformo:isoamilalcohol no es necesario7. El aumento del volumen puede resultar en una baja recuperación del ADN después de la precipitación de etanol8.
    3. Centrifugar brevemente el tubo que contiene cromatina digerida del paso 2.3.1 y añadir 100 ml de PCI. Cierre la tapa firmemente y vórtice vigorosamente para formar emulsión. Centrifugar el tubo a máxima velocidad (por ejemplo, 20.000 x g) durante 30 s a temperatura ambiente.
    4. Tome cuidadosamente la fase superior que contiene ADN y agréguela al tubo que contiene PCI preparado en el paso 2.3.2. Vórtice vigorosamente y centrifugar el tubo como paso 2.3.3.
      NOTA: Si la fase inferior está contaminada, centrifugar el tubo de nuevo, o eliminar la mayor parte de la fase inferior primero, centrifugar el tubo y tomar la fase superior.
    5. Tome cuidadosamente la fase superior como se describe en el paso 2.3.4 y agregue al tubo que contiene acetato de sodio y glucógeno preparado en el paso 2.3.2. Añadir 250 s de etanol. Mezclar por inversión e incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Centrifugar el tubo a la velocidad máxima (p. ej., 20.000 x g)durante 30 min a 4 oC.
      NOTA: La incubación de la solución a temperatura ambiente no afecta a la recuperación del ADN8,9.
    6. Confirme los pellets en la parte inferior del tubo. Retire con cuidado el sobrenadante para no molestar el pellet y añadir 500 s de etanol al 70%. Centrifugar el tubo a la velocidad máxima (p. ej., 20.000 x g)durante 5 min a 4 oC.
    7. Retire el sobrenadante completamente y seque el pellet durante aproximadamente 5 minutos a temperatura ambiente. Disolver el pellet en 20 s de 10 mM Tris EDTA HCl/1 mM (pH 8.0) (TE). Mida la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro UV.
    8. Mezclar 0,5 g de ADN con un tinte de carga de gel y aplicar a un gel de agarosa al 2%. Electroforrese las muestras a 100 V en tampón tris-acetato-EDTA hasta que el tinte púrpura migró al dos tercios del gel y manchar un gel con bromuro de etidio de 0,5 g/ml durante 10 min. Toma una foto del gel.
      NOTA: Vea la Figura 2 para más detalles.

3. CromatinaImmunoprecipitación

  1. Preparación de la cromatina digerida
    1. Preparen las celdas. Para células adherentes, semilla 2-10 x 106 células por plato en 2 platos (6 cm o 10 cm) por grupo de tratamiento y permitir que las células se adhieran a la parte inferior de los platos durante más de 1 día. Para células suspendidas, semilla en 2 matraces T25 por grupo de tratamiento. Trate las células como desee.
    2. Tome un plato o matraz de cada grupo y cuente el número de celda como se describe en el paso 2.1.2. Prepare la cromatina reticulada como se menciona en los pasos 2.1.3-2.1.7.
    3. Lisia el pellet celular y la digestión MNase como se describe en los pasos 2.2.1-2.2.7. Utilice la cantidad óptima de MNase para digerir la cromatina según se determine en el paso 2. Conservar la cromatina digerida a -80oC.
    4. Enlace cruzado inverso 20 l de cromatina digerida y purificar el ADN como se describe en el paso 2.3.8. Mida la concentración de ADN como se describe en el paso 2.3.7. Electroforrese las muestras en gel de agarosa del 2% para comprobar el tamaño de la cromatina digerida como se menciona en el paso 2.3.
      NOTA: La concentración de ADN es idéntica a la de la cromatina digerida almacenada preparada en el paso 3.1.3.
    5. Diluir una muestra de cromatina digerida reticulada inversa del paso 3.1.4 para dar 10 ng/-L con agua y diluir en serie para realizar concentraciones de 1, 0,1 y 0,01 ng/L. Almacenar a -20 oC.
      NOTA: Estas muestras se utilizan para los estándares de PCR en tiempo real.
  2. Inmunoprecipitación
    NOTA: En los pasos 3.2-3.5 del protocolo, se determina la ocupación antitrimetilada de histona H3 lisina 4 (H3K4me3) en células VCaP. Vea también la figura3.
    1. Descongelar la cromatina digerida del paso 3.1.3. Mantenga todas las muestras en hielo.
    2. Prepare el búfer de dilución ChIP complementado con PIC añadiendo 1/100 volumen de 100x PIC al búfer. Diluir la cromatina digerida a 5 g/500 l con tampón de dilución ChIP complementado con PIC. Prepare 1.000 l más extra para (1) IP con IgG no inmune (Control IgG), (2) IP con H3K4me3.
    3. Añadir 5 sl de cromatina digerida de 5 g/500 l a un tubo de tornillo de 1,5 ml como muestra de entrada (1% de una IP). Almacene la muestra a -80 oC.
    4. Añadir 500 l cada uno de 5 g/500 l de cromatina digerida a un tubo de tornillo de 1,5 ml como muestra IP. Añadir 2 g de anticuerpo al tubo. Cierre la tapa e incubar el tubo a 4oC durante la noche con una mezcla suave utilizando una plataforma de balanceo.
      NOTA: Aunque la cantidad óptima de anticuerpos debe determinarse empíricamente, se recomienda n.a.
    5. Añadir 30 l de perlas magnéticas de proteína G de grado ChIP por IP. Incubar el tubo a 4oC durante 2 h con una mezcla suave utilizando una plataforma de balanceo.
      NOTA: No es necesario prelavado de perlas magnéticas.
  3. Lavar el complejo inmune y revertir el reticulación
    1. Gire brevemente el tubo desde el paso 3.2.5. Coloque el tubo en un estante de polietileno que contenga imanes de neodinio durante 1 min. Retire cuidadosamente el sobrenadante por aspiración.
    2. Añadir 0,5 ml por tubo de tampón de lavado complejo inmune bajo en sal. Disperse las perlas tocando suavemente o vórtrelo brevemente. Incubar el tubo a 4 oC durante 5 min con una mezcla suave utilizando una plataforma de balanceo. Después de 5 min, repita el paso 3.3.1.
    3. Añadir 0,5 ml de tampón de lavado complejo inmune con alta sal por tubo. Disperse y lave las perlas como paso 3.3.2. Después del lavado, repita el paso 3.3.1.
    4. Añadir 0,5 ml de tampón de lavado complejo inmune de LiCl por tubo. Disperse y lave las perlas como paso 3.3.2. Después del lavado, repita el paso 3.3.1.
    5. Coloque el tubo en un bastidor magnético durante 1 min. Retire completamente el sobrenadante restante.
    6. Añadir 150 l de tampón de elución al tubo. Vortex el tubo para dispersar las cuentas por completo. Cierre la tapa e incubar el tubo a 65 oC durante 30 minutos, mezclando por inversión o vórtice cada 5 minutos para dispersar las perlas a fondo.
    7. Durante la incubación, preparar un tubo de tornillo de 1,5 ml y añadir 6 ml de 5 M de NaCl y 2 l de proteinasa K. Descongelar 1% de la muestra de entrada preparada en el paso 3.2.3. Añadir 150 l de tampón de elución, 6 ml de 5 M de NaCl y 2 ml de proteinasa K a 1% de muestra de entrada.
    8. Después de la incubación, gire por el tubo. Coloque el tubo en un bastidor magnético durante 1 min y transfiera el sobrenadante al tubo de tornillo que contiene NaCl y la proteinasa K preparados en el paso 3.3.7.
    9. Cierre la tapa y el vórtice todas las muestras IP y de entrada para mezclar completamente. Incubar el tubo a 65oC durante la noche.
  4. Purificación del ADN
    1. Preparar el tubo como se describe en 2.3.2 y añadir 150 s de PCI en lugar de 100 s. En otro tubo, añadir 12 ml de acetato de sodio de 3 M (pH 5,2) y 2 ml de glucógeno.
    2. Retire el tubo de la incubadora. Gire hacia abajo el tubo y agregue 150 s de PCI.
    3. Vórtice vigorosamente el tubo para formar emulsión. Centrifugar el tubo a máxima velocidad (por ejemplo, 20.000 x g) durante 30 s a temperatura ambiente.
    4. Transfiera cuidadosamente 140 l de la fase superior al tubo que contiene PCI preparado en el paso 3.4.1. Repita el paso 3.4.3.
      NOTA: Véase también nota en el paso 2.3.4.
    5. Transfiera cuidadosamente 120 ml de fase superior al tubo que contiene acetato de sodio y glucógeno preparado en el paso 3.4.1.
      NOTA: Véase también nota en el paso 2.3.4.
    6. Añadir 300 s de etanol. Mezclar por inversión e incubar durante 10 min a temperatura ambiente.
    7. Centrifugar el tubo a la velocidad máxima (p. ej., 20.000 x g)durante 30 min a 4 oC. Lave el pellet como se describe en el paso 2.3.6.
    8. Después de secar el pellet como se describe en el paso 2.3.7, disolver el pellet en 50 s de TE. Conservar a -20oC.
  5. Detección de fragmentos de ADN mediante PCR en tiempo real
    1. Descongelar las siguientes muestras: (1) IP con Control IgG, (2) IP con muestra de entrada anti-H3K4me3, (3) 1%. Descongelar también 4 dosis de normas preparadas en el paso 3.1.5 (total de 7 muestras).
      NOTA: Utilice normas del mismo grupo para la cuantificación de cantidades de ADN en las muestras de entrada e IP.
    2. Haga que la PCR funcione con una solución de trabajo para 8 muestras. Mezclar 40 ml de supermezcla de PCR en tiempo real de 2x, 8 l cada una de imprimaciones de 4 oM hacia delante y hacia atrás, y 8 l de agua.
      NOTA: Una mezcla de reacción de PCR contiene 5 l de supermezcla de PCR en tiempo real de 2x, 1 l cada una de imprimaciones de 4 oM hacia delante y hacia atrás, y 1 l de agua. Las secuencias de imprimación se enumeran en la Tabla2.
    3. Aliquot 8 L de solución de trabajo PCR en un pozo de una placa PCR. Añadir 2 l de muestras del paso 3.4.8 o estándares del paso 3.1.5.
    4. Sellar la placa PCR y ejecutar la PCR utilizando las siguientes condiciones: 1) 95 oC durante 3 min para la desnaturalización inicial, 2) 95 oC para 10 s para la desnaturalización, 3) 56 oC para 30 s para recocido, 4) 72 oC para 30 s para extensión y recopilación de datos para extensión y recopilación de datos , repita los pasos 2) a 4) durante 55 ciclos. Después del ciclismo, mida una curva de fusión del producto PCR. Analice los datos.
      NOTA: Los datos sin procesar de la Figura 3 se muestran en la Tabla 3. Calcular la cantidad inicial (SQ) de las muestras utilizando una curva estándar. Multiplique SQ en 1% de entrada por 100 para ajustar una muestra de entrada SQ de 1% a una IP para dar SQ ajustado en entrada (Eq. 1). Divida SQ en la muestra IP por SQ ajustado en Input para dar un valor de entrada % (método de entrada porcentual, Eq. 2). Para calcular el enriquecimiento de pliegues, divida SQ en IP con anti-H3K4me3 por SQ en IP con IgG de control (método de enriquecimiento de plegado, Eq. 3).
      SQ ajustado en la entrada (SQ en 1% de entrada) x 100 (1)
      Porcentaje de entrada de H3K4me3 a 100 x (SQ en IP con anti-H3K4me3) / (SQ ajustado en entrada) (2)
      Enriquecimiento de plegado de H3K4me3 (SQ en IP con anti-H3K4me3) / (SQ en IP con control IgG) (3)

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La digestión de la cromatina es uno de los pasos importantes para un ensayo DeC. Usamos MNase para digerir la cromatina para obtener una mezcla de oligómeros nucleosos. En el paso de digestión MNase, MNase puede pasar a través de la membrana nuclear y digerir la cromatina. Sin embargo, la cromatina digerida no puede pasar a través de la membrana y permanece en los núcleos. Para liberar la cromatina digerida de los núcleos, se necesita una breve sonicación. La Figura 1A muestra microfotografí...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aunque la sonicación se utiliza comúnmente para obtener cromatina fragmentada, es lento y engorroso identificar condiciones reproducibles. En este protocolo, utilizamos la digestión MNase porque la digestión enzimática debería ser más fácil de identificar condiciones reproducibles. Un breve paso de sonicación después de la digestión de la MNase (ver paso 2.2) fue necesario para romper la membrana celular y liberar la cromatina digerida. Por lo tanto, el poder de sonicación en nuestro protocolo debe ser lo más bajo posibl...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Esta investigación es apoyada por las regalías de Genentech a la Ciudad de la Esperanza. Este trabajo no es apoyado total o parcialmente por los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5 M EDTA (pH 8,0)Thermo ScientificAM9010
2 M KClThermo ScientificAM9010
2x iQ SYBR Green supermixBio-Rad1706862
5 M NaClThermo ScientificAM9010
50 bpEngland BiolabsN3236S Producto de
agarosa InternacionalA20090
Octilfenoxi ramificado poli(etilenoxi)etanolMillipore SigmaI8896IGEPAL CA-630
Perlas magnéticas de proteína G de grado ChIPTecnología de señalización celular9006S
Tampón de dilución de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP)Millipore Sigma20-153 Composición deltampón: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl, pH 8,1, 167 mM de NaCl.
Tinte de carga de gel púrpura (6x)New England BiolabsB7024S
GlycineBio-Rad161-0724Glucógeno de grado de electroféresis
Millipore SigmaG176719-22 mg/mL
Cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa Halt, sin EDTA (100x)Thermo Scientific78445
High Salt Immune Complex Wash BufferMillipore Sigma20-155 Composición deltampón: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 500 mM NaCl.
Histona H3K4me3 anticuerpo (pAb)Active Motif39915
LiCl Immune Complex Wash BufferMillipore Sigma20-156 Composición deltampón: 0,25 M LiCl, 1% IGEPAL CA630, 1% ácido desoxicólico (sal sódica), 1 mM EDTA, 10 mM Tris, pH 8,1.
Tampón de lavado de complejo inmune bajo en salMillipore Sigma20-154 Composición deltampón: 0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,1, 150 mM NaCl.
Magna GrIP Rack (8 pocillos)Millipore Sigma20-400Cualquier tipo de soporte de separación magnética que sea compatible con un tubo de 1,5 mL está bien.
La nucleasa microcócicaNew England BiolabsM0247Sviene con un tampón 10x (500 mM de Tris-HCl, 50 mM de CaCl2, pH 7,9 a 25 & grados; C) y 100x BSA (10 mg/mL)
NaHCO3JT Baker3506-01
Conejo normal IgGMillipore Sigma12-370
PIPESMillipore SigmaP6757
Proteinasa KMillipore Sigma3115887001
Sistema de PCR en tiempo realBio-RadCFX96, C1000
ARN pol II CTD phospho Ser5 anticuerpoActive Motif39749
SDSBoehringer Mannheim 100155de grado electroférese
Millipore SigmaS5636
Sonicator equipado con una sonda de micropuntaQSONICAQ700Cualquier tipo de sonicadores que sean compatibles con un tubo de 1,5 mL está bien.
Fenol ultrapuro:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1, v/v)Thermo Scientific15593031pH 8.05
escalera de ADN New investigación de Acetato de sodio

Referencias

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